碱性磷酸酶ELISA方法碱性磷酸酶ELISA方法
实验原理:
1. 在ELISA测定中,碱性磷酸酶的色原底物是对硝基苯磷酸盐(p-nitropheny-phosate,pNPP)。pNPP在碱性磷酸酶的作用下生成对硝基酚(pNP),其在入=405 nm处有最大吸收。
2. 由于较高浓度的无机磷可竞争性地抑制碱性磷酸酶的活性,所以用TBS体系,不能用含磷酸根丰富的PBS体系,否则会造成本底偏高。
3. 由于碱性条件下pNP的光吸收增强,并可使碱性磷酸酶失活,因而可使用氢氧化钠作为终止剂。
试剂:
ELISA溶液体系:
1XTBS ...
碱性磷酸酶ELISA方法
实验原理:
1. 在ELISA测定中,碱性磷酸酶的色原底物是对硝基苯磷酸盐(p-nitropheny-phosate,pNPP)。pNPP在碱性磷酸酶的作用下生成对硝基酚(pNP),其在入=405 nm处有最大吸收。
2. 由于较高浓度的无机磷可竞争性地抑制碱性磷酸酶的活性,所以用TBS体系,不能用含磷酸根丰富的PBS体系,否则会造成本底偏高。
3. 由于碱性条件下pNP的光吸收增强,并可使碱性磷酸酶失活,因而可使用氢氧化钠作为终止剂。
试剂:
ELISA溶液体系:
1XTBS 1L体系
H2O 定容至1000ml
Tris-HCl 6.06g 50mM 盐酸调 PH 7.5
NaCl 8.76g 150mM
包被液:
0.1M NaHCO3 (pH9.6)。过滤除菌,4℃贮存。
显色液:
1. 0.1M glycine pH 10.4 + 1mM MgCl2 + 1mM ZnCl2
配方:7.51g glycine + 203 mg MgCl2 + 136 mg ZnCl2 + 980 ml H2O,用浓NaOH溶液调至pH10.4,补水定容到1L。
2. 1 M diethanolamine(二乙醇胺)pH 9.8+ 0.5mM MgCl2
配方:97 ml of diethanolamine +100 mg MgCl2 + 800 ml H2O,用浓HCl溶液调至pH9.8,补水定容到1L。
显色液中pNPP终浓度为1mg/ml。
终止液:
配方:3M NaOH。
实验步骤:
1. 包被:用包被液稀释靶分子,4℃过夜或者37℃ 1h。TBS洗3次。
2. 封闭:2%M-TBS 37℃ 1h。TBS洗3次。
3. 结合:将
达菌用TBS重悬,超声后加入到孔中,37℃ 1h。0.5%TBST洗3次。
4. 显色:将显色液加入到孔中,3M NaOH终止(100ul显色液+25ul终止液)
实验结论:
两种显色液显色时间有区别,显色液1显色较慢,适合检测表达量较高或结合活性高的样本,同时实验平行性较好;显色液2显色较快,灵敏度较高。
Troubleshooting
If the background is too high:
1. Use a blocking step prior to the application of the primary antibody. Normal Serum (5% v/v) from the same species as the host of the second antibody generally produces the best results.
2. Additional blocking agents for an ELISA are:
a. 0.05% TWEENÒ 20 in 50mM TBS, pH 8.0.
b. 1% BSA containing 0.05% TWEEN 20 in 50mM TBS, pH 8.0.
c. 3% nonfat-dried milk in 0.01 M TBS. Do not use milk as a blocking agent when using avidin-biotin systems.
3. Use 0.05% TWEEN 20 in all washing and antibody diluent buffers.
4. Run control wells without the primary antibody to check for non-specific reactivity of the secondary antibody/alkaline phosphatase conjugate.
5. Adjust the titer of the primary antibody and/or the alkaline phosphatase conjugate to determine the optimal working dilutions.
If no color develops or color is too faint:
1. Adjust the concentration of the primary antibody.
2. Adjust the concentration of the secondary antibody/alkaline phosphatase conjugate.
3. Determine if the enzyme conjugate is active by mixing a small sample of substrate and conjugate together in a test tube.
4. Increase the substrate incubation time or temperature.
5. Adjust the concentration of the coating antigen.
6. Consider using an amplification system such as avidin-biotin
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