角膜滴用TATaFGFHis蛋白对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的治疗(可编辑)
角膜滴用TATaFGFHis蛋白对大鼠视网膜缺血再灌注损
伤的治疗
温州医学院
硕士学位论文
角膜滴用TAT-aFGF-His蛋白对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的治 疗
姓名:林海环
申请学位级别:硕士
专业:药理学
指导教师:李校?;林绍强
20080501温州医学院硕士学位论文
角膜滴用 蛋白对大鼠
视网膜缺血再灌注损伤的治疗
目的
第一部分
观察由的反式激活蛋白转导域 ,?携带的人酸性成纤维细胞生长
因子
,和组氨酸的融合蛋白??通过角膜滴入
给药进入视网膜组织的情况。并构建融合蛋白?作为对照蛋白。 .第二部分
眼角膜滴用融合蛋白?对大鼠实验性视网膜缺血再灌注 ,损伤的治疗作用,并探讨其作用机
理。
方法
.第一部分
扩增基因片段,利用蹦和的同尾酶特性,用
和聊双酶切扩增产物并与 和勰双酶切处理的质粒相 连,转化至大肠杆菌 ,氨卞青霉素筛选阳性克隆。抽提经测序鉴
定序列
正确的重组质粒,转化至大肠杆菌,利用氨卞抗性筛选出转化子。 分别用诱导表达融合蛋白?和,离子交换及肝 素亲和两步层析法分离纯化蛋白。
健康大鼠只随机分为生理盐水组组、州组和 ?组,每组只,组滴入生理盐水,组滴入腿
,?组滴入心.。大鼠给药后分别于
、 、 、 、 和 处死,每时间点只,双眼给药。用 抗体,采用免疫组化法
和?在角膜和
视网膜组织的分布情况。
.第二部分
健康大鼠只随机分为生理盐水治疗组简称组、?治疗 组简称组、?治疗组简称组。各组大鼠均采用前房灌 注加压形成. 高眼压,维持 建立模型。再灌注开始后及
.每隔 ,组滴入生理盐水,组滴入腿,组滴入腿
??进行治疗。各组大鼠分别于再灌注,, 处死,每时间点 只,每组右眼为实验眼,左眼为正常对照眼。动物造模前及处死前
行视网膜
温州医学院硕士学位论文
点图检测,记录 波和波波幅。光学显微镜下观察视网膜组织 病理学变化旺染色,记录视网膜内层厚度和视网膜神经节细胞 数目的变化。采用原位凋亡检测法检测视网膜神经节细胞层 和内核层的细胞凋亡情况。
结果
.第一部分
正确构建表达质粒载体?。经诱导后,融合蛋白
?和?的表达量分别占菌体总蛋白的%和%,均为可
溶性表达。经两步层析纯化后,获得了纯度大于%的??和 卜蛋白。免疫组化结果表明,组、?组在角膜和视网膜组织 、 、 、 、
均未见到染色阳性细胞。?组在
、 的角膜和视网膜组织均能见到阳性细胞,主要分布在角膜上皮
细胞
层和视网膜节细胞层。 时有微量进入视网膜组织, 时??大部分被清
时?在视网膜的分布达到高峰,
除。
.第二部分
?检查:与组相比,组 波和波波幅在,, 均无明显差异 ,组
.。与和组比较,再灌注 波波幅.?.
脚明显高于组.?.肌和组.?.?.和
.;再灌注, ,组 波波幅.?.肌和.
?.肌明显高于组.?.脚和.?.肌和组
.?.岫和.?.脚.。
?视网膜组织病理学变化:损伤早期,水肿增厚,和均可见核 固缩细胞,晚期数耳减少,萎缩变薄。与组相比,组在再灌注 ,厚度有差异.,而其余各时间点,数目和厚度均
无差异.。与和组比较,再灌注,组水肿更严重
.,而数目均多于前两组,但只与组有统计学差异.; 再灌注,组与前两组相比,厚度均无差异.,而数目
明显多于前两组.;再灌注,组厚度大于前两组., 且数目均多于前两组.。
?视网膜组织细胞凋亡:正常大鼠视网膜染色阴性,、、组视网膜 和均可见大量棕黄色阳性细胞,并随再灌注时间的增加而减少。
与
组相比,组在再灌注各时间点的阳性细胞数均无显著差异.。与 和组比较,再灌注,组的阳性细胞与组有差异.,但温州医学院硕
士学位论文
与组无显著差异.;再灌注,组和的阳性细胞数明 显少于前两组.;再灌注,组的阳性细胞明显少于前两组 .。
结论
.角膜滴用 ?蛋白不能进入视网膜组织,蛋白转导域能有效 携带?穿透眼球血眼屏障进入眼底到达视网膜组织。 .成功构建视网膜缺血再灌注模型。
.??蛋白能够改善损伤的组织病理学变化,抑制细胞凋亡,对 视网膜细胞功能恢复有作用。
.?对损伤的治疗可能通过抑制细胞凋亡和保护神经节细胞的 途径。
.为角膜滴用蛋白治疗视网膜缺血再灌注损伤提供理论依据。 关键词酸性成纤维生长因子; 蛋白转导域; 视网膜缺血再灌注; 凋亡
视网膜电图;
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温州医学院硕士学位论文 缩略词表温州医学院硕士学位论文
学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及
取得的
研究成果。据我所知,除文中已经注明引用的内容外,本论文不包
含其他个
人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集
体,均已在文中作了明确说明并表示谢意。
作者签名:硅丞连写、日期:型窆:圣:
关于学位论文使用授权声明
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和摘要汇
编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。
日期:迦筮:圣:
导师签名:
学位论文作者签名:幸荦炀温州医学院硕士学位论文
.上.一
刖 舌
视网膜缺血再灌注 ?,损伤是一种较
为常见的临床疾病。如视网膜中央动脉阻塞、视网膜静脉阻塞,
缺血性视神经病
变、糖尿病视网膜病变等,均可造成不同程度的视网膜缺血,在血液再通后,视
功能反而下降,视网膜损伤加重剖。目前认为损伤的发病机理包括缺血缺
氧引起能量缺乏、钙离子超载、自由基大量产生、兴奋性谷氨酸过量释放、各种
神经营养因子的缺乏及由此而启动了调控细胞凋亡的基因,使视网膜神经细胞因
凋亡致死,从而引起视功能的损害。由于眼球是一个相对封闭的球体,存在血
一眼屏障 以保持眼内外环境的稳定性,保证视网膜感
光功能的安全。受血一眼屏障、血浆蛋白结合等因素影响,局部滴眼给药以及全
身给药进入视网膜组织的药量很少,难以达到有效的治疗浓度。目前,临床治疗
视网膜缺血再灌注损伤,通常采用球结膜注射方法,然而该方法操作难度大,容
易损伤眼球内组织,给病人造成痛苦。因此,寻找防治损伤的有效药物并改
进给药方式具有重要的临床实践意义。酸性成纤维生长因子 ,是一种重
要的神经营养因子,其受体广泛存在于神经元、星形细胞、内皮细胞、成纤维细
胞及软骨细胞等多种细胞。通过与其相应的受体结合发挥调节基因表达、
促进细胞增生分化及营养神经细胞等多种生理作用。此外,的神经营养作
用还表现在促进中枢和周围神经损伤后修复再生方面酗。
蛋白是人类免疫缺陷病毒的反式激活因子,年,和
发现蛋白能够跨膜递送进入细胞。年等证实
蛋白中有一个富含碱性氨基酸、带有正电荷的多肽片段蛋白中位氨
基酸与蛋白转导功能密切相关,并称之为蛋白转导域
, 年用变形的?一半乳
糖苷酶经腹腔注射后 能够进入到包括大脑在内的各种组织内,证实
可以携带外源蛋白突破血脑屏障嘲。最新的实验结果表明?
蛋白腹腔注射后 后便能到达大脑内海马等组织叫。
本研究根据基因构建阴性对照蛋白蛋白,在大肠杆
菌表达系统中表达。应用组氨酸亲和层析法纯化融合蛋白。运用免疫组化方法,
观察眼角膜滴用进入大鼠眼球内的情况。采用视网膜缺血再灌注
损伤模型,探讨眼角膜滴用?对视网膜功能、视网膜组织病理
学改变以及视网膜细胞凋亡的影响,以评价??局部滴眼给药治疗
损伤的可行性。
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第一部分 弟一鄙万
眼角膜滴用 蛋白进入视网膜组织的检测 材料与方法
材料
.菌种、质粒、动物
大肠杆菌:公司
大肠杆菌:公司
原核表达载体一:公司
质粒??。争埘:暨南大学医药生物技术研究开发中心
大鼠清洁级,雄性,~:温州医学院实验动物中心 .分子生物学试剂
聚合酶:公司
聚合酶:公司
一连接酶:公司
限制性内切酶
、聊、勰:公司,:公司
:杭州昊天生物公司
质粒小量抽提试剂盒:上海生工
胶回收试剂盒:上海生工
产物纯化试剂盒:上海生工 引物合成:上海生工
.蛋白表达纯化试剂
:公司
公司
:广东环凯微生物科技公司 凝胶:公司
?亲和凝胶:公司
:宝生物
大连有限公司 丙烯酰胺,,’一亚甲双丙烯酰胺:公司
,,考马斯亮蓝:公司
甘氨酸:上海伯奥生物科技有限公司
温州医学院硕士学位论文 试剂盒:上海申能博彩公司 美国进口透析袋:北京经科宏达公司
.动物实验试剂
抗体:公司
兔抗人
试剂盒:武汉博士德公司 抗体稀释液:武汉博士德公司 多聚赖氨酸:福建迈新公司 试剂盒:武汉博士德公司
水合氯醛:国药集团化学试剂公司
.常用溶液及缓冲液配置
..大肠杆菌培养相关溶液液体培养基: 的去离子水中加入 ,.
和. ,搅拌溶解后,高压灭菌,?保存。
固体培养基含有 /卡那霉素抗性: 的去离子水中加入 ,. ,. 和. 的琼脂粉,高压灭菌。稍
冷却后无菌操作的条件下,加入浓度为,摇匀后 /卡那霉素
倒入培养皿中。培养基完全冷却凝结后置于?冰箱中保存。 /卡那霉素: 卡那霉素粉末溶于 的灭菌超纯水中,过滤除 菌后?保存。工作浓度为 /。
%甘油: %甘油丙三醇溶于 的超纯水中,高压灭菌。 .
。: 去离子水中含有.
无水,高压灭菌。
,.:. 溶于 灭菌水中,除菌过滤,?保存。
。
工作浓度为.
..蛋白电泳相关溶液
%过硫酸胺: 的去离子水中含有.
过硫酸胺,保存,有效期为
一周。
%:称取 固体,加到 去离子水中,并加热溶解,使用浓 。
调节至.,加去离子水定容至
. .
去离子水中加入. 碱,用浓盐酸调
。
节值至.,加去离子水定容至
. .:
去离子水中加入. 碱,用浓盐酸调
节值至.,加去离子水定容至 。 .
%丙烯酰胺溶液: 去离子水中加入丙烯酰胺 和甲叉双丙烯酰胺 .
。?热溶,滤纸过滤,冷却后保存。温州医学院硕士学位论文 考马斯亮蓝染色液: 去离子水中含有甲醇 、冰醋酸 和 .
考马斯亮蓝 ,搅拌溶解后即可。
脱色液:冰醋酸 ,甲醇 和去离子水 ,混匀后即得。 聚丙烯酰胺蛋白电泳缓冲液: 去离子水中含有. 碱、 甘氨酸 和
,?热溶。工作浓度为 一聚丙烯胺蛋白
电泳缓冲液。
.
:缓冲液中含有? ,%/
,.%/溴酚蓝,%/甘油,%/巯基乙醇。 ..蛋白纯化相关溶液?:称取.,加入 去离子水,并 加热溶解,用. 。
的滤膜过滤除去杂质,加去离子水定容至 ?、
高压灭菌,室温保存。
?:称取.,加入 去离子水,
。?、
并加热溶解,过滤除去杂质,加去离子水定容至 高压灭菌,室温保存。
:用
。?。溶液调节 ?溶液,用计
测试值至.,所得溶液即为 。工作浓度为删。 .
:称取氯化钠. ,加入 ,并加热溶解,过 定容至
滤除去杂质,加 ,?保存。
.:称取氯化钠. 删,并加热溶解, ,加入
过滤除去杂质,加 定容至 ,保存。 .:称取氯化钠. 训,并加热溶解,
,加入
过滤除去杂质,加 定容至 ,?保存。 ..动物实验相关溶液
%水合氯醛:称取 水合氯醛,加入 去离子水,并加热溶解,加
。
去离子水定容至
.
:的超纯水中加入 ,?
,?
.
。
。用浓盐酸调节值至.,加水定容至 %多聚甲醛: 的. 中加入
多聚甲醛,置于?的水浴锅
中搅拌至完全溶解,过滤后置中保存。 ?×多克隆抗体:用抗体稀释液:稀释。 显色液:临用前将试剂盒中支溶液各取一滴,加水 混匀后立即使
用。
.主要仪器设备
冷冻离心机:公司
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台式离心机:上海安亭仪器厂
电热恒温培养箱一:上海森信实验仪器公司 全温度震荡培养箱呷 :大仓市实验设备厂 计:上海精科公司
超纯水机:公司
恒流泵一:上海沪西分析仪器厂
记录仪:重庆川仪四厂
蛋白电泳仪:北京市六一仪器厂
恒压恒流电泳仪一:北京市六一仪器厂 分光光度计:公司
溶剂过滤器:上海嘉鹏科技公司
超声波细胞破碎机 宁波新芝生物公司 冷冻干燥机?:北京博医康技术公司 方法
.
扩增. 片段
..质粒的抽提
接种含模板质粒??。埘 的大肠杆菌于 培养基中,
?培养过夜。
取 培养菌液,, ,离心 ,弃上清,采用质粒小 量抽提试剂盒抽提质粒。
取 抽提的质粒,%琼脂糖电泳检测。 ..
引物的设计与合成
:’?匹丛?,.从从一’
:’叁鱼?堡一’
其中,下划线部分为
酶切位点,下划线部分为蹦酶切位点,
引物由上海生物工程技术公司合成。
扩增反应
的引物母液: 装的引物用灭菌后的超纯水配成 的母液保存。
工作浓度为
反应体系如下:.
住.?螂 温州医学院硕士学位论文
肛弘
肛
.肛
总体积 弘
反应混合物,经?变性 进入循环,循环温度及时间为?, ;?, ;?, 。
,共个循环,然后?延伸
取 扩增产物,用.%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。 采用上海生工的胶回收试剂盒进行回收,并用.%的琼脂糖电
泳检测。
.
??重组质粒的构建
..表达载体的抽提
接种含的大肠杆菌,?培养过夜,同方法..。
所抽提的质粒?冰箱中保存备用。 ..
产物和表达载体一的双酶切 用和占明双酶切产物? 片段。 用
和双酶切表达载体,其中聊?和/的粘性末端
一致。
?水浴反应 ,反应体系如下: 体系一:肛
× 肛
扯
磨儿
肛
斗
总体积
体系二:
肛
?。
× 肛
弘
总体积
酶切完毕后,采用上海生工的产物纯化试剂盒进行回收。并用 温州医学院硕士学位论文
.的琼脂糖电泳检测。
..连接反应
将产物 片段的酶切回收产物和表达载体的酶切回 收产物于?连接. ,得到??重组质粒,反应体系如下: . “
酶切回收产物
肛
酶切回收产物 弘
总体积
..感受态大肠杆菌 和大肠杆菌的制备
本实验选用大肠杆菌 为重组质粒的克隆扩增菌株,选用大肠杆
菌
为表达菌株。制备感受态整个过程均须无菌操作,具体步骤为: 取肛复活甘油菌,接种于 新鲜培养液中按%的接种量, ?,
,过夜培养。
按%的转种量转种,。、 振荡培养. ?.,置冰上 ;。
各吸取 离
菌液分装到冰预冷的管中,?、
心
,去尽上清,加. 预冷:,轻轻打匀重悬细胞。 ‘、?
离心 ,去尽上清,加. 预冷 ,
。
轻轻打匀重悬细胞;冰浴
。、? ,
离心 ,去尽上清,加. 预冷
重悬细胞。
冰浴,直接转化或加%甘油于?保存备用。 ..连接产物转化大肠杆菌
取肛感受态大肠杆菌 ,冰水中放置,加入弘方法..的连接
。
产物冰浴
?准确热激 ,立刻冰浴 ;加入 新鲜培养基,、 。
振荡培养
取 在抗性?/的氨苄青霉素平板上涂布,培养箱过夜 培养。
并以未经酶切的质粒作为阳性对照,以未转化的感受态大肠杆菌
作为阴性对照。
.重组质粒的鉴定
..菌落鉴定
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用无菌牙签随机挑取转化的个单菌落,分别在装有肛灭菌水的管 中搅拌一下。
沸水中煮 , ,吸取上清作为模板。反
离心
应体系如下:
.弘× 肛
.弘
.枷
弘 . .肛
.肛
“
总体积
反应条件同方法..,扩增后取肛扩增产物,用%的琼脂糖凝胶进 行电泳分析。
并以无模板的体系作为阴性对照,模板为质粒的体系作为 阴性对照。
..序列分析
挑选个经菌落鉴定呈阳性的转化子,接种到 含弘/的氨
苄青霉素的培养基中,?、 /过夜培养,%甘油保种。 取甘油菌测序,序列测定由上海基康有限公司完成。 .重组质粒转化大肠杆菌
抽提鉴定正确的重组质粒,同方法..。
取重组质粒 转化感受态的大肠杆菌。
在抗性垤/的氨苄青霉素平板上筛选阳性转化子。 .
?州和在大肠杆菌中的表达
..诱导表达
分别挑取?和的单克隆菌株,接种到含氨苄青霉素的 液体培养基中 上/过夜培养。
按的比例转接到新鲜液体培养基中,剧烈振荡培养至对数生长期 。?.一.
取 菌液作为诱导前样品,在剩余菌液中加入终浓度为. 的, 。
?,诱导表达
..表达产物聚丙烯酰胺凝胶?电泳分析
...凝胶的配置
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按照北京六一仪器厂蛋白质电泳操作
安装好玻璃板。 配制%分离胶,迅速加至已安装好的两玻璃板的间隙中,流出 。
灌注积层胶所需空间梳子的齿长再加
加水至玻璃板的边缘,室温垂直放置。待分离胶完全聚合后,倾出
覆盖层液
体,并用滤纸吸净。
配制%的浓缩胶,在已聚合的分离胶上灌注浓缩胶,并立即在浓缩
胶溶液
中插入干净的梳子,室温垂直放置。
...全菌样品的制备
,
取诱导前和诱导后各时间点菌液各 ,离心 ,弃上清。 加入弘水和肛 ,振荡混匀。
×
?煮沸 ; 离心 ,备用。
...上清和沉淀样品的制定
取诱导前和诱导后各时间点菌液各 ,?, ,弃 ,离心
上清。
将收获的菌体重悬于冰预冷的中,超声破碎工作时间 、间歇时间,
离心?、 ,分别收集上清和沉淀。
,
。
取肛上清,加入等体积的×
沉淀加入弘灭菌水和肛 ,并吹打均匀。
。
?,煮沸
离心 ,备用。
...
电泳
待浓缩胶完全聚合之后,小心取出梳子,并固定于电泳槽上,内外
槽各加入
甘氨酸电泳缓冲液。
按预定的顺序加样每孔 ,连接好电源,按恒压方式进行电泳。 电泳条件:开始时恒压 ,当染料溴酚蓝前沿进入分离胶后,把电
压提高
到 ,继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部,关闭电源,停止电泳。 。
从电泳装置上卸下玻璃板,标记凝胶方向,考马斯亮蓝染色 将凝胶浸泡在脱色液,摇床上脱色至背景清晰。
.
?和的分离纯化
..摇瓶发酵
将种子菌液按.%的接种量接种到含有氨苄青霉素的 的培养基中 。 .
摇瓶培养
/
再按%的转种量转种到三角瓶装液量为中,。、 。
摇瓶培养
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。
添加诱导剂,至终浓度为.洲,?, /,继续培养 离心?、 、 ,收获菌体。
..菌体的超声破碎
将收获的菌体重悬于 冰预冷的中。
超声破碎工作时间 、间歇时间 ,离心?、 , ,收集上清液。
..
?离子交换层析
。
打开、,检测器,设置检测波长为 ,灵敏度为.,预热 用. 的 溶液平衡离子交换层析柱,流速为 /。 基线平稳后,调整基线为。
调整流速为. /,上蛋白样。
用含. 的 /,至基线平稳。
溶液洗脱杂蛋白,调整流速为
用浓度为. 的 溶液洗脱目的蛋白,调整流速为. /。
收集洗脱峰。
用浓度为. 的 溶液洗脱杂蛋白,调整流速为 /,至基线 平稳。
的
用浓度为. 溶液洗脱杂蛋白,至基线平稳。 %分析洗脱目的蛋白。
..肝素亲和层析
用. 的
溶液平衡肝素亲和层析柱,流
/。
速为
基线平稳后,调整基线为。
用. 的 溶液平衡肝素亲和层析柱,流速为 /。 基线平稳后,调整基线为。
调整流速为. /,上咧柱洗脱后的蛋白样。 的
用浓度为. 溶液洗脱杂蛋白,至基线平稳。 用浓度为. 的 溶液洗脱目的蛋白,调整流速为. /。 收集洗脱峰。
用浓度为. 的溶液洗脱杂蛋白,至基线平稳。 ?%分析洗脱目的蛋白。
..目的蛋白的透析脱盐与冻干
用无菌生理盐水透析 ,换液次,以除去纯化中带入的盐。 蛋白透析后,经.胁滤膜过滤除菌。
蛋白置于冰箱,预冻过夜。
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放入冻干机中, 冻干,密封,放?冰箱保存。 . ?
蛋白眼局部给药穿膜活性
..动物分组、给药
健康大鼠只随机分为生理盐水组组、?组和?? 、 、 、 、
组,每组只,根据给药后的时间不同分为 和 组,每组共只眼。
经生理盐水稀释,分别得到 /和.
/的?卅和
?蛋白溶液。
大鼠用%水合氯醛
/麻醉后,组滴入生理盐水,组滴
入垤?,?组滴入??。
..载玻片防脱处理
将玻片在%盐酸中浸泡过夜,用清水冲洗 后,用无水酒精洗次,
?烘箱中烘干。
将充分洗净并干燥的玻片浸泡在多聚赖氨酸稀释液中:, 后取
。
出沥干,置于烘箱中烘干备用。
..标本的采集及处理
根据各组时间点,采用颈椎脱臼处死动物,立即挖取眼球,以生理
盐水冲洗
。
血渍,浸泡于%多聚甲醛中性缓冲液中固定
以平行于视神经矢状轴且以其为平面切除眼两侧组织,小心取出
晶状体,流
。
水缓慢冲洗
置于脱水机中经%酒精、%酒精、%酒精、无水酒精脱水,二甲苯透
明,
浸蜡,石蜡包埋。
将包埋好的眼球标本,以平行于视神经矢状轴为平面进行切片。 每个标本不连续切片片,切片厚度为胁。
。
用已涂有多聚赖氨酸的载玻片粘片,?烘箱中烘. ..免疫组化法检测?和蛋白
石蜡切片经?二甲苯 ,二甲苯 ,%酒精 ,%酒精 , %酒精 ,自来水 脱蜡水化。
,自然冷却。
枸橼酸盐缓冲液高压锅修复
。
蒸馏水洗后%双氧水处理 ,用洗三次,每次 加兔血清封闭液,?水浴 ,甩干勿冲洗。 加兔抗人标签单抗稀释浓度为:,?过夜。用洗三次,每 次
,擦干组织周围液体。
,
加生物素化山羊抗兔,水浴 。用洗三次,每次 温州医学院硕士学位论文
擦干组织周围液体。
加复合剂,?水浴 。用洗三次,每次 ,擦干组织 周围液体。
棕色显色,显微镜下控制显色 ,自来水终止反应。 苏木素复染 ,自来水漂洗遍,盐酸酒精分化数秒钟,自来水漂洗,
%氨水泛蓝,自来水漂洗。
酒精梯度脱水,二甲苯透明,中性树脂封片。 。
光镜下观察结果,视网膜和角膜部位各取个视野观察阳性细胞%
医学院硕士学位论文
结果
.目的基因’的合成
利用的方法,获得编码融合蛋白的基因片段。如图所示, 琼腊糖电泳结果表明在约
处扩增出特异条带,与预期大小一致。把目的 基因克隆入质粒得重组质粒?。
.重组质粒的菌落鉴定
重组质粒转染大肠杆苗 ,随机挑取的个重组质粒? 转化子单菌落,经鉴定株结果呈阳性,如图所示。经测序,第号质
粒
的序列完全正确测序图,得融合蛋白表达苗?。 .蛋白 和在大肠杆菌中的表达
’
经.加 ?诱导
后,离心后分别收集菌体
/??和/,并进行%的
电泳。图
的泳道在约 处有一条明显的表达带,与
?卜的预期分子量一致;图 的泳道在约 处也有一条明显 的表达带,与?的预期分子量一致。经 .分析融合蛋白表达 量均占菌体总蛋白的%左右。
.??和蛋自纯化
摇瓶发酵的菌体经超声破碎仪破碎后,再经凸离子交换层析后,
收集洗脱
液,%电泳分析,得到纯度约%的目的蛋白。将含目的蛋白的洗脱 液再进行肝素亲和层析,. 的溶液洗脱,%?电泳结果显示, 融合蛋白纯度达到%以上见图 、。
.?蛋白服局部给药穿膜结果
石蜡切片的免疫组化结果显示,各时间点生理盐水组和?组的角
膜和视网膜中均染色阴性细胞,见图、。 组的角膜从 、 、
开始微弱阳性结果, 、都有明显的阳性结果, 开始减弱, 而到 大部分蛋白已被消除见图。口毋
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角膜组织;:视网膜组织温州医学院硕士学位论文
第二部分
..对视网膜缺血再灌注损伤的治疗作用 材料与方法
材料
.主要试剂
托吡卡胺滴眼液:江西科伦药业有限公司 .%盐酸丙美卡因滴眼液:公司
氧氟沙星滴眼液:江苏克胜药业有限公司
%羧甲基纤维素钠滴眼液:公司
水合氯醛:国药集团化学试剂公司
蛋白酶:北京中杉公司
多聚赖氨酸包被玻片:北京中杉公司
.
试剂盒:北京中杉公司
?蛋白:第一部分实验获得, /生理盐水溶液 蛋白:第一部分实验获得,. /生理盐水溶液 .实验动物及分组
健康大鼠只温州医学院实验动物中心提供,雄性,体重 。外眼和检眼镜检查双眼屈光间质清晰,眼底无改变,饲养在明一
暗交替
光照、?的环境中,不限食水。随机分为生理盐水治疗组简称组、 治疗组简称组、?眦治疗组简称组。根据再灌注 ,
的时间不同分为 , 组,每组只,每组右眼为实验眼,左眼为正常 对照眼。
.实验设备
电生理检测仪: ,德国
直接检眼镜:苏州医疗器械厂
眼科手术显微镜:苏州医疗器械厂
眼科手术器械:苏州六六医疗器械厂
图像分析系统:
方法
.动物模型的建立
大鼠腹腔注射%水合氯醛 /,行全身麻醉。温州医学院硕士学位论文
眼部滴入.%盐酸丙美卡因,行眼局部麻醉。
大鼠取俯卧位固定于台面上,用托吡卡胺滴入右眼散大瞳孔。
号头皮针与生理盐水瓶连接,并将号头皮针从右眼角膜缘刺入前房,避
免损及虹膜及晶状体,固定针头。
处,此高度在眼内
缓慢升高生理盐水瓶使液面至与实验眼垂直距离
形成 的眼内压,此压力接近大鼠的体循环收缩压
.
。造成大鼠视网膜动脉血流中断。
眼内可见球结膜苍白,直接检眼镜下可见眼底血流中断,视网膜苍白。
维持 ,而后缓慢降低盐水瓶至动物眼水平,拔出针头,可见球结膜充
血,视网膜血液重新再灌注。
实验过程中维持动物体温在?左右,并间断用氧氟沙星滴眼液点
眼维持角
膜湿润和防止感染。
.给药方法
取由第一部分获得的?和蛋白溶液用生理盐水缓冲液
稀释到同样浓度.弘/。
缺血完毕再灌注开始后及以后每隔天的早上点组滴入弘生理盐
.
水,组滴入 ,组滴入 .腿,
同时各组左眼滴入同样体积的生理盐水作为对照。
.标本的采集及处理
根据各组时间点,采用颈椎脱臼法处死动物,立即摘除眼球,以生理盐水冲
。
洗血渍,浸泡于%多聚甲醛中性缓冲液中固定
以平行于视神经矢状轴且以其为平面切除眼两侧组织,小心取出晶状体,流
。
水缓慢冲洗
梯度酒精脱水;二甲苯透明;浸蜡;石蜡包埋。
将包埋好的眼球标本,以平行于视神经矢状轴且以其为平面进行切片,厚度
约胁。
捞取切到视神经的片子,烘干过夜。
.
检测
采用视觉电生理检测仪记录闪光视网膜电图,刺激器为 全野刺激器。
记录电极为自制?薛环状角膜电极,参考电极和接地电极分别为
不锈钢
。
自制针状电极,各电极自身阻抗均小于
实验前将大鼠暗适应 ,大鼠腹腔注射水合氯醛 /,行全身麻醉。 眼部滴入.%盐酸丙美卡因,行眼局部麻醉,托吡卡胺散瞳。温州医
学院硕士学位论文
记录电极置于右眼角巩膜缘,参考电极刺入右侧颊部皮下,接地
电极置于尾
部,所有操作均在微弱的红灯下暗室内进行。
再次暗适应 后,白光闪烁刺激次,光强度 /,通频带, 。
持续
检查后用氧氟沙星点眼,防止发生暴露性角膜炎。 波波幅指波波谷至波波峰之间的垂直距离,大小以微伏肌为 单位,结果用均数?标准差?表示。
.旺染色
石蜡切片常规脱蜡水化:石蜡切片置于染色缸中,?二甲苯 ,二
甲
。
苯 ,%酒精 ,%酒精 ,%酒精 ,自来水
苏木素染色
,自来水漂洗遍,盐酸酒精分化数秒钟,自来水漂洗, %氨水泛蓝,自来水漂洗。
。
%伊红染色 。%酒精脱水 ,%酒精 ,无水酒精
二甲苯透明 ,中性树胶封片,光镜观察并摄影记录。 .视网膜厚度测量及神经节细胞计数
倍镜下观察视网膜瓶染色切片,从视神经乳头两侧约岫处开始各 取个视野,每个视野每间隔姗取个点,共取个点,利用图像分 析系统测量视网膜内层厚度指视网膜内届膜到外核层和外丛状
层交界之间
的距离。
每只实验眼共个数据,取其平均值即为视网膜内层厚度。 每个视野从距视神经胁处对 内的节细胞进行计数,即每张片子 对舳内的节细胞进行计数。
.
原位凋亡检测
石蜡切片常规脱蜡水化:石蜡切片置于染色缸中,?二甲苯 ,二
甲
。
苯 ,%酒精 ,%酒精 ,%酒精 ,自来水
用溶液冲洗次,每次 ,擦干组织周围液体。将切片置于湿盒中, 在样本区域上滴加“新鲜配置的蛋白酶工作液蛋白酶工作液的配 置: 蛋白酶 。
?水浴 。冲洗次,每次 。擦干组织周围液体,滴加 。
反应混合液于样本区域上,?水浴
冲洗次,每次 ,擦干组织周围液体。
。
滴加 溶液,?水浴
冲洗次,每次 ,擦干组织周围液体。
滴加 工作液,直到显现浅棕色背景,冲洗。
温州医学院硕士学位论文
苏木素复染
,自来水漂洗遍,盐酸酒精分化数秒钟,自来水漂洗, %氨水泛蓝,自来水漂洗。
酒精梯度脱水,二甲苯透明,中性树脂封片。 .凋亡细胞计数
倍镜下观察染色切片,从视神经乳头两侧约 处开始各取 个视野,每个视野再分别从视网膜节细胞层和内核层选取姗的区
域进行阳性细胞计数劓。
分层计算每张切片个视野的平均阳性细胞密度,以此作为每张切
片
和的阳性细胞密度,单位/。
.统计学分析
采用
.软件进行统计分析,同一时间点组间进行单因素方差分析
.为差异有显著性意义。
检测和视网膜细胞凋亡结果采用 的 统计学方 法分析。
视网膜内层厚度和神经节细胞数目变化采用 的统计学方
法分析。温州医学院硕?学位论文
结果
.检测
.
波
?.脚、治疗组.
再灌注,治疗组
?.脚和?治疗组.?.帅波波幅较缺血 前均明显降低,组之间无统计学差异.。再灌注,组.. ,
?和组 ?.肌波幅略有降低,二者之间无明显差异 而组.?.?波幅明显升高,较组和组均有显著差异. 脚波
和.。再灌注,组..帅和组.
幅快速升高,组.? 波幅继续升高,此时组波波幅相接近 无明显差异.。见表
.
肼波
再灌注,组.?.?、组. 肌和组.
?.?波波幅较缺血前均明显降低,但组之间无统计学意义,组和 组较组波幅略高。再灌注,组.?.肘波幅基本无变化, 组.?.?波幅略有降低,组.?.肌波幅明显升高, 较组和组均有显著差异.。再灌注,组.?.脚和
组.. 波幅升高,组..脚波幅继续升高,较
组和组均有显著差异.。见表
.缺血再灌注损伤视网膜组织学变化
正常大鼠视网膜结构,可见三层细胞拔,从玻璃体腔向巩膜方向
依次为
神经节细胞层、内核层、外核层。神经节细胞层的细胞呈单层排
列,内核层和外
核层呈多层排列。视网膜神经细胞胞核较大,里圆形或椭圆型,
染色较浚,排列
整齐。内核层主要有双极细胞、水平细胞、无长突细胞及细胞的细胞核
组成,胞核较小,染色较深,厚度约为外核层的/。外核层由光感受器细胞核
组成,胞核较小,染色较深。视网膜内层厚度为视网膜内届膜到外棱层
和外丛状层交界之问的距离。见图
治疗组:再灌注后 ,视网膜组织水肿,其中以神经纤维层与内
网状层的水肿最明显,数目减少,内核层细胞排列紊乱,部分细胞固缩变
,视网膜组织水肿已经减退,视网膜内层
形,外核层变化不明显;再灌注后
,
厚度接近正常,排列较稀疏,数目显著减少;再灌注后
数目基本不再减少,但细胞固缩变形,出现空泡。内核层细胞数目较少,外核层
变化不明显,神经纤维层明显变薄,视网膜组织萎缩。结果表明缺血再灌注模型温州学院硬?学位论文
建立成功,且生理盐水对损伤无保护作用。见图
治疗组:视网膜组织病理变化与组相似。与组相比,再
灌注后 ,视网膜厚度太于组,并有统计学差异.,数目也略
大于组,再灌注 组数目也略大于组,但均无统计学差异.。
见图、
州治疗组:视网膜病理变化与、组同期比较有以下几 个特点:?再灌注组视网膜组织水肿,厚度明显大于、组.和 ,与正常大鼠相比,数目减少,但多于、组,并只与组有统 计学差异.。?再灌注组视网膜内层厚度与、组相接近., 数目随时间的增加而减少,但均多于、组 。再灌注组 视网膜无明显萎缩现象,内层厚度大于与、组均有差异,和., 数目稍有减少,但仍多于、组.。见图、
.视网膜细胞凋亡
如图所示,正常大鼠视网膜组织未发现有棕黄色着色的阳性细
胞。治
疗组、治疗组、?治疗组,在再灌注后
、 、
的神经节细胞层和内棱层均可观察到阳性细胞。见图 .视网膜利嗡节细胞凋亡细胞数
组:再灌注后,中阳性细胞数目达到最高,到再灌注阳性细胞数 目有所减少,再灌注阳性细胞数目与相比基本不变。 组:再灌注后、、,中阳性细胞数目均差别不大。与组相比, 再灌注后阳性细胞数目明显少于组,而再灌注、与组差别不大。 组:同样在再灌注后,中阳性细胞数目最多。到再灌注阳性细胞 数目有所减少,再灌注阳性细胞数目与相比基本不变。与、组相
比,
备时间点阳性细胞数目均少于、组。再灌注后,组与、组比较均
有统
计学差异 和.,再灌注后,组与、组亦均有统计学差 异.和.。见圈
.视网膜内核层凋亡细胞数
组:再灌注后,中阳性细胞数目达到最高;到再灌注阳性细胞数 目有所减少,再灌注阳性细胞数目继续减少。
组:再灌注后、、,中阳性细胞数目的变化规律同组相似。 与组相比,再灌注后,阳性细胞数目少于组,而再灌注和阳性细 胞数目均与组差别不大。
组:在再灌注后,中阳性细胞数目虽多,到再灌注数量有所减少, 再灌注阳性细胞数与相比基本不变。与、组相比,各时间点阳性
细胞温卅医学院硕士学位论文
数目均少于,组。再灌注后,组与组之问有统计学差异.。 再灌注后,组与、组之问均有统计学差异 。见圈
表再灌注后不同时间点 波变化?
.组别 缺血前
注:料表示 治疗组与船治疗组比较;
。
表示?治疗组与组比较
表再灌注后不同时间点 波变化? ,?
注:表示治疗组与治疗组比较 ;
表示 治疗组与?组比较。
图视网膜内层厚度变化
组:治疗;组:治疗;组;治疗:
表示组与组比较. ;表示组与组比较. 。
表示组与组比较.;表示组与组比较 ?表示组与组比较.;温州医学院硕?学位论文 图神经节细胞数目变化
组:治疗;组:咄治疗;组:??治疗; 表示组与组比较. ;料表示组与组比较. 表示组与组比较 ;表示组与组比较.。 圉神经节细胞层中阳性细胞数
组:治疗;组:治疗;组:?治疗;
十表示组与组比较 ;十表示组与组比较. 。
表示组与组比较 ;表示组与组比较温州医学院硕士学位论文
图内核层中阳性细胞数
组:治疗;组:治疗;组: 治疗;
;表示组与组比较.
表示组与纽比较.
表示组与组比较.。