人工合成铁(Ⅱ)半胱氨酸SOD模拟物的毒性及血清半衰期研究
人工合成铁(?)半胱氨酸SOD模拟物的
毒性及血清半衰期研究
中国现代实用医学杂志,2005年12月,第4卷,第12期
?
论着?
人工合成铁(II)半胱氨酸SOD模拟物的毒性
及血清半衰期研究
薄芯李京霞
【摘要】本文对人工合成的铁(n)半胱氨酸SOD模拟物的毒性及其吸收后血清半衰期进行
了初步探索.通过灌胃急性
毒性,慢性毒性,遗传毒性和灌胃后吸收入帆清的药时变化进i5-T研究研究结果
明:此物对
小鼠灌胃的LD50为大干5000mg/kg.
连续给药1月后,小鼠的心,肝,胸腺,脾,肺,肾和肠宵等脏器在形状,人小和颜色上与正常组织
无明显差异;用800mg/kg
的剂量给小鼠灌胃7d,小鼠的晴多染红细胞微核率有-定增长(尸<005);经:同浓度给药后,
血清中血药浓度峰值时间为6O,
2l0min,--’b衰期为904l80rain证明此药为微毒物质,适当剂量口服后无明显蓄积毒性,大剂
量使用时可导致一定的染色体损
伤,血清药浓度半衰期随给药浓度有所变化此药可在植物生长调节剂,医药或化妆品,饲料,
食品中的抗氧化添加剂及着
色抑菌的防腐添加剂等中代替天然SOD
【关键词】铁(TT)半胱氯酸SOD模拟物I.D微核率药峰时间血清半衰期
StudyofToxicit),andEfficacyofFe.(,rsteineCompoundSODSimulacrum.BoXin.Li.1ingxiaNormalCollegeofBeijingUnion
UniversityBcijingl000l1.china
【Abstract]ExaminingthetoxicityandefficacyofFecysteinecompound.aSODsimulacruminthistest.Thetestmakesupof
acutetoxicity.chronictoxicityandpo13ch]-omaticel’,,throcyte(PCE)inicronucleusrate(MNR)testsinmouseInaddition.SODactMty
changesin]nicebloodal’emeasuredare]?oralcxposureResultstUlnouIthathalflethaldose(ID)exceed5000mg/kgwhichfallsinthe
nfinimumtoxicityaccol?dingtothenationalclassificationConsecutivelystomachdosinglbrsevenda3,SshowthePCEmicronucleusrates
aref292?067)‰,(227?090)%..(182?ll8)%0respectivelyItindicatesthatundel’theexperimentalconditionsFe-cysteine
compotmdhasnocun3ulativetoxicit3Highdosagecaninc,easethePCEMNR(,)<005)Aftcrthestomachdosingatdosage800mkg
400mg/kg.200mg/kg.themedicinepeakstimesinmicesel’umappemat60rain.150rainand2l0minFhe
sel’timhalflift:timesal’e90rain
120rain.180minButthehalflifetimeftl2)cankeep1longtimeinthegroupoldosage8{}{}mg/kg.
【Key,v131dslFe>-cysteinecompotmdHall’lethaldose(LD5u)Micronucleusrate(MNR)Serumpe
aktimeSerumhalf-life
time(t『2)
中图分类号:R96文献标识码:A文章编号:1726—619X(2005)12-0001—03
超氧化物歧化酶(Superoxidcdismutasc.SOD)足生物体
内的一种金属酶它通过催化超氧离_f歧化分解,保护机体免
受自由基毒害.SOD活性部位的金属离子与酶蛋自都在催化
反应中起到关键作用I.从生物制品内提取的天然SOD可广
泛用于植物生长调节剂,医药或化妆品,饲料和食品中的抗氧
化添加剂及着色抑菌的防腐添加剂..似天然SOD在非生理条
件下的生物活性受使J1j:境和存放时州等I素的影响很大,很
容易失活变性,甚至腐败变质,敝使用与保存条件比较苛刻.
而且,由于天然SOD的分子较大,穿透乍物膜的能力较差,
外部医用时难以进入皮下,而导致其清除氰化物的作用受到
一
定限制.近年来含有不同金属离子的人1:合成SOD模拟物
开始出现J,本试验ll}l所检测的物质铁(II)胱氯酸(Fe—Gly)
就是近年来研制成功的一种SOD模拟物其为自色粉末状固
体,微溶于水,小溶于乙醇和甲醇..在体外,它的水溶液具有
较明显的化学活性,并与天然SOD相近十支研究此物质在生
【作者单位】:北京联合大学师范学院应用lj物技术系(100011)
物体内的牛物学{舌性和毒性,验证它对生物的安全性,对其在
医药和化妆美容品l{]的推广应用具有重要的意义.所以,我们
运用毒理学和药动学实验
,对此物质的急性毒性(acute
toxicity),蓄积毒一le1.(cumulativetoxicit3r),遗传毒性(genetic
toxicit3)中的小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率(mice
polycluomaticcrythrocyteinicrontlcleusrate.PCEMNR)及血药
浓度的药峰时问(medicinepeaktime)和血清半哀期(serum
half-lifetime)等药学指标进行了研究,为此物质的实际应用
提供一定的参考依据.
1材料与方法
l_1实验材料
1.11试剂和器材铁(II)半胱氨酸,本系化学教研室合成;
研成粉末后加蒸馏水,配成实验所需不同浓度的悬浊液,用时
摇匀;配制l0%水溶淀粉悬浊液,加热至淀粉溶解,冷却到
60.,加入适量铁(11)半胱氨酸混匀,可防止药物沉淀造成
给药剂量不SOD试剂盒,南京建成生物工程研究所生产.
吉姆萨色素,CHROMA进口,上海化学试剂采购供应站分装.
2
高速离心机,TGL.I6B型,上海安亭科学仪器厂.ELXS00型
酶标仪.GZ-I多用振荡器,北京冰箱电器厂.SYZ型石英亚
沸高纯水蒸馏器,江苏宜兴勤华玻璃仪器厂.
ll1.2实验动物昆明小鼠,体重I8,22g,雌雄各半,北京
大学医学科学院动物房提供.
1.2实验方法
1.2.1小鼠灌胃急毒LD50的测定-j’J选用体重19,2Ig小鼠
随机分6组,每组2O只,雌雄各半,禁食6h后进行试验.每
只小鼠灌胃药液O.5ml,观察72h内小鼠的死亡情况.给药剂
量见表l.
表1铁(11”)半胱氨酸小鼠灌胃急毒IDs?结果表
25002000
30002000
35002000
>6000
45002000
50002000
60002000
1-2.2小鼠灌胃蓄积毒性的测定-j选用体重I9,2Ig小鼠随
机分2组,分别为铁(II)半胱氨酸组和阴性对照组,每组
2O只,雌雄各半.铁(II)半胱氨酸组给药剂量为500mg/kg,
阴性对照组给生理盐水.每日l4:30定时灌胃给药,每只小
鼠给药容量为O.5ml.连续给药35d,第36天称重后用断颈法
处死,进行解剖,观察心脏,肝,脾,肺,肾和肠胃等器官的
形态,大小和颜色,并与阴性对照组进行比较.
1.2_3小鼠骨髓嗜多染红细胞微核测定选用体重I9,21g
小鼠随机分4组,每组12只,雌雄各半,分别为高,中,低
剂量组和阴性对照组.用灌胃法每天上午l0:O0给药,连续
给药7d,第8天上午l0:O0取材,制作骨髓涂片.经Giemsa
染色后,在显微镜下计数PCEMNR,每只小鼠计数l000个
PCE.给药剂量见表2.
1.2.4小鼠灌胃给药的血清药峰时间和半衰期测定【4,61选用
体重29,3lg小鼠随机分3组,每组l0只,雌雄各半.给药
前不禁食.灌胃给药后,于不同时间进行眼底静脉丛采血,分
别测定血清中SOD活性.测定方法为在南京建成生物工程研
ChineseJournalofCurrentPracticalMedll2QQ,!:Q2
究所提供的SOD试剂盒检测方法加以改进,用酶标仪代替721
分光光度计,并对采样量加以调整.每个样品的血清取样量从
15pl改为3HI,并对所用试剂用量相应进行了调整.检测波长
改为490nm.给药剂量见表3.
表2铁(II)半胱氨酸对小鼠骨髓PCE微核的影响
注:为f榆验中005
2实验结果
2.I小鼠灌胃急毒LDn的测定结果见表I.并在试验3d后,
在任意2个时问点每组随机选择4只小鼠进行解剖,发现动物
的胃中没有白色的受试物残渣,硬块及异物,胃的大小和颜色
均正常,肠道巾无结节和脓水.由于最高剂量为6000mg/kg,
仍没有小鼠死亡,按国家新药审批办法和美国化学物质急性分
级标准(WHO,I977)中关于急性毒性试验中的最大量试验
要求,如口服量大于5000mg/kg仍不产生急性毒性,症状或
死亡,即属于微毒物质,可不必做进一步的试验,.
2.2小鼠灌胃蓄积毒性的测定结果:给药35d后各试验组小鼠
的体重与阴性对照组无明显差别,分别为(27.94?2.77)g和
(26.83?194)g在解剖中,发现各剂量组小鼠的心,肝,胸
腺,脾,肺,肾和肠胃等器官的形态,大小和颜色与阴性对照
组无明显差异
2l3小鼠骨髓嗜多染红细胞微核测定结果见表2.对测定数据
进行t检验后,发现只有高剂量组(800mg/kg)’的微核率与阴
性对照组有显着性差异(P<005),而中,低剂组与阴性对照
组之间无显着性差异.
2.4小鼠灌胃给药后血清药活性测定结果见表3及图l.根据
结果计算出不同给药浓度F的药物吸收进入血清的药峰时间
和半衰期(t).不同的给药剂量会由于吸收情况不同而呈现不
同的药峰时间,但到达血药浓度峰值后达到半衰期也有所差异,
维持半衰期的时间也各有不同.
表3铁(1I)半胱氨酸灌胃给药后血药浓度的变化
3讨论
目前研究人员已对天然SOD进行了较系统的研究,已测
定出不同SOD的金属离子含量及亚基分子量,了解了SOD酶
蛋白的分子结构及其N-末端氨基酸残基的理化性质和免疫学
特性.天然SOD上带有不同的金属离子,根据其金属的差
异,可分为cu,Zn-SOD,Mn-SOD和Fe.SOD三种.由于SOD
的生理活性与金属离子有关,研究人员运用配位化学理论,将
金属离子连接于小分子有机化合物配基上,制成了SOD模拟
物(SODsimulacl1』m).它们既可避免天然SOD不足,又与天
然SOD功能相似,还具有生物活性高,分子量小,不易分解
等优点.我们曾对铜(II)甘氨酸进行过急性毒性,蓄积毒性,
嗜多染红细胞微核率及血清血药浓度峰值及半衰期的研究
中国现代实用医学杂志,2005年I2月,第4卷,第12期
…
,结果发现,虽然铜(71)甘氨酸的SOD活性较高,但在
生物体内具有一定的毒性,小鼠口服给药的lDs0=4I8.79?
17.72mg/kg.根据化学物质急性毒性分级标准(WHO,1977),
属于中等毒性物质,中毒小鼠在死亡前的主要表现为运动障
碍,抽搐,腹泻等症状,故其有一定的神经毒性,对消化系统
也有刺激作用.其还有一定的蓄积毒性,对消化系统的影响可
导致其吸收能力下降,而体重减轻.同时,高剂量小鼠的尾骨,
脊椎骨和股骨变脆易断,可能影n~Nd,鼠的钙吸收及代谢过
程.在遗传毒性检测中,l00mg/kg组的微核率与阴性对照有
显着性差异(P<0.05).说明由于铜在生物体内具有较明显的
毒性,故以铜离子作为活性中心合成的SOD模拟物在食品医
药中使用受到一定限制.以铁离子作为活性中心合成的SOD
3
模拟物在生物体内的毒性较小,缺点为其活性较低,且二价铁
(Fe)具有不稳定性,易于转变为三价铁(Fe)而彻底失
去SOD活性.我们曾对铁(II)酪氨酸进行过急性毒性,蓄
积毒性,嗜多染红细胞微核率及血清血药浓度峰值及半衰期的
研究…l,其在形成水溶液时需要较低的pH值,在使用中受到
一
定限制.故此次我们又对铁(7I)半胱氨酸进行相同指标的
检测.铁(II)半胱氨酸的稳定性极好,可在室温下以固体形
式保持6个月以上,而未发现有明显的SOD活性降低现象.
其水溶解度虽然也较低,但可在中性溶液中溶解,在实践应用
中更适于用于食品和药品中.其在体外最小作用浓度可达
l04mg/ml
,与铁(『7)酪氨酸和天然SOD相近.
图I:小鼠灌胃给药后血药浓度变化图
通过小鼠灌胃给药的急毒试验结果可知,此物质属于微毒
物质,可以安全地使用在食品和药品中.
通过小鼠蓄积毒性试验结果可知,在较长时间给药后,解
剖中未发现小鼠的各主要脏器,包括免疫器官(脾和胸腺)有
异常现象,并对小鼠的消化系统没有任何影响,故小鼠的体重
增长正常.
小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率变化是食品和药品遗传毒
性检测的一个指标.通过结果可见:800mg/kg剂量组的微核
率与阴性对照组相比有明显差异(P<005),而400mkg,
200mglkg剂量组与阴性对照组之间无显着性差异说明在适
当剂量下,此药引起细胞染色体损伤的作用并不大,但用药量
较大时,需考虑其具有一定的遗传毒性.在药品,食品和化妆
品中使用时,需注意其使用量应限制在一定剂量的安全范围
内.
通过小鼠灌胃给药后的血清中药峰值出现的时间可知,此
药进入血清中的速度随给药剂量的增加而明显上升.不同的给
药剂量虽然相差较大,但三种不同给药剂量的小鼠血清中血药
峰值基本相同,说明动物对于此药的吸收有一定限度.此药在
血清中浓度变化可判断其半衰期为90,180rain左右,当给药
剂量较大时,半衰期维持时间较长,有可能在达到药峰值后,
随血清中药物浓度的下降,肠道中未被吸收的药物进一步吸收
以进行补充所致.
总之,铁(II)半胱氨酸是一种微毒的人工合成SOD模
拟物,其对动物体内内脏器官的无明显的蓄积毒性,在适当剂
量时不表现出对染色体的破坏作用.口服时,此药的吸收入血
量有一定限度,血清半衰期为90,180rain.而由于此物质具
有与天然SOD相似的生物学活性,在通过进一步的药理研究
后,可能可以作为天然SOD的替代品应用于药品,食品和化
妆品行业.
致谢:在此论文进行期间,我系李金老师和孙静雷同学参加了部分实
验工作,特此致谢.
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