琼脂糖凝胶电泳
实验三 琼脂糖凝胶电泳
一、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中,并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基,因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,因而可依据DNA分子的大
A, 也可以分离相对分小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DN
子质量相同,而构型不同的DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量
参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB),其分子可插入DNA的碱基之间,形成一种络合物,在254,365nm波长紫外光照射下,呈桔红色荧光,因此也可对分离的DNA进行检测。
一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb,50kb范围内的DNA片段。本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法。
二、仪器及试剂
1.仪器及耗材:
水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像
系统、微波炉、微量移液器、透明胶带、点样板或parafilm、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒、吸头等。
2.试剂及配制:
50×TAE缓冲液的配制:2 mol/L Tris-乙酸,0.05 mol/L EDTA(pH 8.0)
配制1000 ml
Tris 242 g
冰乙酸 57.1 ml
0.5 mol/L EDTA 100 ml
加入600 ml去离子水后搅拌溶解,将溶液定容至1 L后。高温高压灭菌,室温保存。
1×TAE缓冲液的配制:
称量20 ml的50×TAE缓冲液,再加入980 ml的去离子水。
溴化乙啶贮存液:10 mg/ml 溴化乙啶
配制:100 ml
称取1 g溴化乙啶,置于100 ml烧杯中,加入80 ml去离子水后搅拌溶解。将溶液定容至100 ml后,转移到棕色瓶中。室温保存。
6×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,30%甘油。
配制:10 ml
溴酚蓝 25 mg
二甲苯青FF 25 mg
甘油 3 ml
用6×TAE缓冲液定溶至10 ml,分装成1 ml/管。-20?保存。
其它试剂:DNA样品、DNA Ladder 、琼脂糖、
琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下:
1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口
倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液.
2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65?左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板
面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加 1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.
3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序).
4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.
(5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min. (6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存.
凝胶电泳操作注意事项
作者:未知 来源:本站原创 时间:2005-11-29
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1. 缓冲系统:在没有离子存在时,电导率最小,DNA不迁移,或迁
移极慢,在高离子强度的缓冲液中,电导很高并产热,可能导致DNA变
性,因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时,常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。
2. 琼脂糖:不同厂家、不同批号的琼脂糖,其杂质含量不同,影响
DNA的迁移及荧光背景的强度,应有选择地使用。
3. 凝胶的制备:凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致,溶解的凝胶应及时倒入板中,避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡,影响电泳结果。
4. 样品加入量:一般情况下,0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定,过多的量会造成加样孔超载,从而导致拖尾和弥散,对于较大的DNA此现象更明显。
5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移,加入DNA标准参照物进行判定是必要的。
6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率,平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。
7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度,迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子,制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。