人乳头瘤状病毒HPV感染与抑制癌基因p16突变在食管鳞癌中研究(可编辑)
人乳头瘤状病毒HPV感染与抑制癌基因p16突变在食管
鳞癌中研究
河北医科大学
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任。 (。0蠢I
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二级学院领导盖章:
’
研究生虢蚜导师繇
0吖乙年弓月3,D日
河北医科大学研究生学位论文独创性声明
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文中特别加以标注和致谢等内容外,文中不包含其他人已经发表或撰
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文责自负。
研究生躲射
b日
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05802
Y21
目 录
中文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1
英文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„4
6突变在
研究论文人乳头瘤状病毒 肿V 感染与抑癌基因p1
食管鳞癌中的研究
前言„„„??„„????„„„„????„„„„????„????„????„“„””„“„„“7
刚吾„„„““„”„„„„”„„„„”„“„”„“„””„“„„“,
材料与方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„7
结
果??????????„„??„„„„„??„„„????„((„„„((”„??„”一一“„((。16
8
附图„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1
讨 仑??„„„„„„„„„„„„„„„??„??„„„????„„一„„“26
结论„„„„„„„„„„„„„„„„„“((„„„„”„„„28
参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„28
6突变在食管鳞癌中
综述 人乳头瘤状病毒 HPV 感染与抑癌基因p1
相关研究的进展„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„31
致谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„44
个人简历„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„45
中文摘要
人乳头瘤状病毒 HPV 感染与抑癌基因p16突变在
食管鳞癌中的研究
摘 要
背景:食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,死亡率较高。发病率有
明显的地区特点,河北省中南部,太行山地域及河南省北部是本病世界
发病率最高的地区,其组织类型主要为食管鳞癌 95, 。本病早期症状
不明显,易被忽视,早期治疗预后较好,中晚期患者占大多数,症状明
显,预后较差,因此针对此病的病因学研究成为预防、早期诊断、治疗
的关键。人乳头瘤病毒 HPV 自20世纪初被发现以来,其与多种肿瘤
的关系陆续得到确认。以宫颈癌为例,现已开发出针对HPV感染的相关
疫苗,这成为宫颈癌预防上的一座里程碑。1982年S ,l ianen首先提出
HPv感染与食管癌的发生有关,1987年我国学者周健等首次在国内进行
食管鳞癌与HPV感染关系的研究,之后困内外学者针对HPV感染和食
管癌的关系进行了大量研究,发现在一些地区,HPV感染与食管痛有
关,在另一些地区,二者之间则无关,甚至同一地区,不同研究方法和
研究人员都会得出相反的结论,因此,HPV感染与食管鳞癌之间的关系
6基因是近年来发现的一种新型抑癌基因,是第一种
仍未得到确定。p1
能作刚于细胞周期的抑癌基因,其在肿瘤发生发展中的作用逐渐受到重
6基因
视。p16基因在肿瘤发展过程巾发生改变,究竟是何原因导致p1
发qj变异,HPV感染是否是导致食管鳞癌中p16基因变异的原因仍未得
到证实。
目的:本研究旨在应用聚合酶链反应技术 PCR 联合DNA探针技
术对河北省中南部地区食管鳞癌患者HPV感染情况进行研究,以明确二
者之间的关系,为进一步研制HPV疫苗提供依据。本研究应用单链构象
6基因第二外显子突变进行初筛,以明确
多态性 SSCP 技术对标本p1
其在食管癌发病过程中的变化以及HPV感染与p16基因突变的关系。
方法:对47名河北省中南部地区食管鳞癌患者以及37名河北省石
DNAmini
kit试
剂
家庄+m健壤志愿者食管组织进行取材,采用QlAamp
ARRAYl-1PV
Test试剂盒对
禽提取组织DNA,应用LJNEAR
Genotypiilg
中文摘要
内对照,检测DNA质量。除试剂盒阳性、阴性对照外,同时采用mV
阳性宫颈癌组织做阳性对照,DEPC水做阴性对照,并采用船VE6基因
引物对标本DNAmV感染情况进行复检,排除由于实验操作、污染、
技术、
等问题造成的假阴性及假阳性结果。mV感染检测完成之
后,使用标本DNA进行SSCP分析:应用p16基因第二外显子引物对组
引物分为三段进行设计 ,PCR产物加入变性液后高温变性5分钟,然
后立即骤冷保持DNA单链状态,进行4?恒温非变性聚丙烯酰胺凝胶电
1
泳,电泳结束后银染观察结果。统计学分析采用SPSS3(O及SAS8(O完
成。
结果:
1食管鳞癌患者中HPV感染率O,,正常对照组HPV感染率为O,,试
剂盒阳性对照呈现i5订性,宫颈癌标本HPV感染呈现阳性,食管癌患者中
HPV
E6基因为O,,正常对照组HPVE6基因为O,,宫颈癌标本mV
E6基因为附陛,此结果和试剂盒检测结果一致。
6第二外显子基因缺失率为O,,基因突变率为
2食管鳞癌患者中p1
44(7,。正常对照组p16第二外显子基因缺失率为0,,基因突变率为
o,。以病理分期为标记分组,采用k个独立样本的非参数检验方法检验
,fi同病理分期的p16基因是否呈现差异;结果显示,渐近显著性p值为
O(035,卡方值为6(691,认为痫理分期越晚,p16第二外显子基因突变率
越商。
6基因第二外显子在食管鳞癌中与性别、年
3采用Pearson相关分析,pl
龄、吸烟史、饮涌史、家族史及淋巴结转移的渐进显著性p值分别为:
O(496、0(143、O(000、O(547、O(113、O(005。
6基因变异是否
有
4以HPV感染为标记分细(,检验HPV感染与否与p1
与p16基因第二外显子在食管鳞癌中的变异无关。
结论:
1中(国河北省中南部地区HPV感染与食管鳞癌无关。HPV感染可能不是
食话;鳞癌的病冈。
中文摘要
2
p16基因第二外显子基因变异与食管鳞癌有关。
3食管鳞癌病理分期越晚,p16基因第二外显子突变越明显。p16基因第
二外显子突变与患者吸烟史及淋巴结转移情况有关。
4船V感染可能并非食管鳞癌中p16基因第二外显子突变的原因。
关键词:食管鳞癌;HPV;p16基因
英文摘要
and
Human
Theresearchabout
papilloma
cellcarcinoma
mutationin
esophagealsquamous
p16gene
ABSTRACT
the isoneofthemost
carcinomaof
esophagus
Background:The
insouth
with
inChina
common mortality(ThepreValence
malignancies high
ofHenan
andnoIrth
mountains
ofHebei
proVince
Taihang
province,the
is
oftheword(The
isthe esophageal
re mainlyhistologicaltypes
gions hi曲est
ofthisdiseasearenot
ceU
symptoms
carcinoma 95, (Theearly
squamous
treatment
and
overlooked(An
appropriate
obvious,and earl ,diagnosis
easily
when
areinadVanced
ofthe
leadabetter stage
prognosis(Mostpatients
of
Sothe
reasonof
whichisthe
preVention
diagnosed, poorprognosis(
to
are
andtreatment
VerylmportantlmproVe
etiologyearlydiagnosis
assoclatewlth
demonstratedto
prognosis(Humanpapilloma、m’us HPV was
ofthe20th
foulldatthe
tumoursinceitwas century(For
manV beginning
is forthe
Human necessar 7
example, papillomavirus HPV infection
Vaccine
successofHPV
forcervicalcancer(The
develoDment proph 7lactic
cancer ofhulllankind(
milest011eofcervical
isthe
develoDment preVention
in
HPVandESCC
onthelinkbetween
the氕rstreseal’c11
Svrianencomplete
f-orthenl’sttinlein
didthesaJneresearch
like
1982(SomescholarsZhouiian
bet、veenHPVand
workoutthe ESCC,much
in1987(To
China relatjonship
f(oundthatin
andabl’oad(Therasearches
beendoneathonle
researchhas
anotherareathe
ofESCC(Butin
HPV bethereason
areathe
some might
methodsand
aerathedif佗rent
inthesarne
contrary(Even
resultmight
between
the
coulddif(ferent
researchersget l‘esults(Theref-ore,relationship
l6 new
notbeen
hasstill
HPVinfectionandESCC connnned(pgene,a
thefirstonewhichcall
in
ofthetulnor
member
suppressorgenespeople,is
ln
andmore role
cell a1110re
actsatthe
preVentlng
lnlportant
cycle(Itplays
reason
tulllourcell(Butwhatisthe
16 in
isknownthat
cancer(It change
p gene
f(orthe inESCC?
inf’ecti011tjlereal1’eason
HPV
ofthe change
chan2e?Is
英文摘要
chain
use
reaction PCR
applicationpolymerase
Objectives:Thisstudy
ofHPVinfectionin
todetectthesatuation
DNA
technologies
joint probe
forVaccine
basis
areaofHebeiand允rther
ESCCinsouthcentre
provide
use chain
reasearchalso
P01ymerase
development(The
screenthe cancer
strandconfomation esophageal
polymo巾hism sscp to
andtoworkout
for the ofl6 exon2
andcontrol
findingchangep gene
groups
HPVinfection
andthe between
intheESCC
the
relationship
change process
andESCC(
SCC
came仔omtwo
Methods:Thetissue
samples groups(EsophageaI
fromsouthem
of47
from
wereobtained
samples surger ,specimenspatients
micosawereobtained
thecontr01
ofHebei
area esophageal
province(In group
f(romthe of
volunteerswhocame
from37
city
healthy
endoscopically
DNA(AndHPV
wasusedtoex”act
DNAminikit
Shijiazhuang。QIAamp
TestkitoftheDNA(
ARRAYHPV
wasdetectedwithLlNEAR
Genotyping
additionto
a1controltoensureDNA
wasusedasintem
quality(1n
6一Globin
cen7jcalcancer
ofthe
and control
the kit,HPVpositiVe
positivenegative
controlandDEPC
usedas the water,the
tissreswere
negatiVe
positive
16
E6
DNAwasdetectedHPV
contr01(HPV p genes
using geneprimer
tothree toenhance
usedto the
exon2
primer parts
primers、、jas PCR design
with
intoPCR
hightemperature
degenerationproducts
sensitiveness ,andjoin
DNA of
for5minutes(The
to
gel
degeneration electrophoresispolyacrylamide
methodwas
stain
outin4?(Af:[erthe
wascarried
electrophoresis,silVer
wasconductedSPSS
usedtoviewthe using
expression(StatisticalanaJysis
13(OandSAS8(O(
Results:
cellcarcinoma
rateofHPVwas0,in
1 Theinfection
esophagealsquamous
the Vecontrolofthe
control in
the kit,
positi
group,positiVe
patients,0,in
wasO,in
E6
inthecervical
geneexpression
positive specimen,HPV
cerVicalcancer
control the
0,inthe
cancer,and group,positiVein
esophageal
samples
is
mutationrate
Deletionu’as0,incontrol
Pl6exon2
2 2ene group,the
5
英文摘要
16exon2 mutationratewasO,
incontrol
Deletionwas
O,,the
44(7,(p gene
the of16
inthe
testwasusedtodetect
group(Rank―sum changep gene
showedthatthe
different Theresults ficant
path0109icalstage asymptoticsigni
was
12(738(Theresultsshowedthatthe
Value valuewas
O(002,chi-square
Va“ation(
later 16 exon2
stages,the
pathology higherp gene
be、Vteen16
3 Pearsonrelated
gradualsigni丘cant p genes
Using analysis,the
exon2of
patients’age,gender,smokinghistory,drinkinghistory,
f(amily
nodemetastasis
histo巧andlymph
O(005(
4 detectthe betweenl 6 exon2andHPV
To
inf’
ection,
relationshipp gene
Fisher methods showedthat
exactly analysis p O(05(
Conclusion:
1 Inthesouthcentreofhebei in
cell
theesophageal China,
proVince squamous
carcinomaandHPVinfectionisirrele、7ant(I PVinfectionnotbethe
may
reasonof cellcarcinoma(
esophagealsquamous
2 l6 exon2andESCChaVesome
relationships(
p genes
more16 exon2
3 Thelater ofESCC
,thep genes Esophageal
patholog 7stages
16 exon2 hi node
and
mutations(pgenes patientsslnokingsto叫andlymph
metastasishaVesome
relatiollships(
of 6exon2mutations(
4HPVinfectionisnotthereason1 1
16
Key?70rds:ESCC;HPV;pgene
6
研究论文
6突变在
人乳头瘤状病毒 HPV 感染与抑癌基因p1
食管鳞癌中的研究
(^上--J一
刖 舌
食管癌是一种恶性程度高、死亡率高的消化道恶性肿瘤,在我国癌
症发病率中居第四位,以食管鳞状细胞癌多见 95, 。患者早期通过
手术治疗,预后较好,但由于早期无明显特异性症状,常被忽视,一旦
出现相关症状,如吞咽困难,吞咽痛,胸骨后疼痛,声音嘶哑,体重下
降等,已是中晚期,预后较差。因此针对其病因进行预防成为当前研究
的重点。
食管癌的病因学研究目前已取得较大的进展,但尚未完善。20世纪
初HPV首次被人类所认知,通过一个世纪的努力,HPV感染与宫颈痛
982年HPV
之间的关系则已经确定,并已研制出相关疫苗进行预防,1
感染首次进入食管癌病因学研究的范畴,1987年我国学者第一次研究
HPV感染与食管癌之间的关系,通过近30年的研究,目前HPV感染在
食管癌病因学中的地位仍未确定,各种研究之间结果各异,而食管痛的
发病率和夕E亡率仍居高不下,如HPV被证明是食管癌的瘸因,那么就可
进一步针对感染型别进行疫苗的研制,从根本上降低食管癌的发病率。
p】6基因是第一个被发现作用于细胞岗期的抑癌基因,其与恶性肿
1
6基因变异在食管癌中也
多
瘤之间的关系越来越得到研究者的关注。p
有报道,究竟是何种凶素导致p16基因发生变异,HPV感染是彳、 是原因
之一仍不可知,本实验应用PCR结合DNA探针技术对食管鳞癌中HPV
感染情况进行探索,并应用sscp技术对p16基因第二外显子变异情况进
行研究,从而明确其在食管鳞癌中的作用,为临床预防、诊断提供依
据。
材料与方法
1材秘
研究论文
1(1组织标本
本研究采用病例对照研究方法,病例组标本为食管鳞癌组织标本,
均经由患者同意,并通过伦理委员会审批,采白河北医科大学第四医院手
术切除新鲜标本。用O(5mlRNAlater迅速完全浸泡,(80?超低温冰箱冷
冻保存。
正常食管组织标本均经由健康志愿者同意,并通过伦理委员会审
批,采自河北医科大学第四医院食管镜室。用O(5mlI?A1ater迅速完全
浸泡,(80?超低温冰箱冷冻保存。
HPV阳性宫颈癌组织标本经由患者同意,并通过伦理委员会审扎匕,。
采自河北医科大学第四医院手术切除新鲜标本。术前己确诊为HPV阳
性。用O(5mlRNAlater迅速完全浸泡,(80?超低温冰箱冷冻保存。
所有标本均来自中国河北省中南部地区。
根据统计学计算样本含量,病例组共取47例,对照组共取37例。
9例,女性18例,男女比
岁,平均年龄为61(64土7(25岁。对照组男性1
瘤平均分期:2(72土O(498。两组性别分布经X2检验 F O(1
13,p (7365 0
O(05 无统计学意义,两组性别分布无差别。两组年龄分布经两样本t
检验 p O(05 ,有统计学意义,说明两组年龄分布有差别,经
6
基冈
pearson相关性分析,证实年龄与本实验所研究的HPV感染及p1
变异无关 p O(05 。
1(2仪器
数显水浴恒温振荡箱 SHA―C型 江苏省金坛市江南仪器厂
PCR仪 VERlTI型 美国ABI公司
德国Heraeus公司
低温高速离心机 TTICH一400型
(20?低温冰箱 青岛海尔公司
(80?超低温冰箱 日本三洋公司
核酸蛋白测定仪 NANODROPl000型 美国NanoDl。op公司
凝胶成像系统
美国Image公司
DYY(6C型r乜泳仪 北京市六一仪器厂
上海l 1达陕学应用研究
黟j
ZD一11Ib快速生物医学实验仪
研究论文
DYC(24EN电泳槽 北京六一仪器厂
似(1050恒温循环器
河南兄弟仪器设备有限公司
DYY(1
OC型三恒电泳仪 北京六一仪器厂
JA2003N电子天平 上海上平仪器公司
790
1型电磁搅拌器 上海华光仪
器仪表厂
85(2B恒温磁力搅拌器 金坛市医疗仪器厂
单道可调移液器 O(1(2(5u1
德国eppendorf公司
单道可调移液器 O(5(10u1
德国eppendorf公司
单道可调移液器 10(100u1
德国eppendorf公司
单道可调移液器 20一200u1
德国eppendorf公司
单道可调移液器 100一looOul
德国eppelldorf公司
1
OuI带滤j签无菌盒装短吸头 美国
AXYGEN公司
200u1带滤芯无菌盒装黄吸头 美国AXYGEN公司
l000u1带滤芯无菌盒装蓝吸头 美国AXYGEN公司
1(3主要试剂
蒸馏水 河北医科人学第四医院制剂科
DNAMinikit 250
QIAamp 德国QIAGENE公司
LINEARARRAYHPV Test
美国Roche公
司
Genotyping
白色体系 美国
Promega公。司
DEPC才 美国Promega
公司
30,聚丙烯酰股溶液 上海
双螺旋公司
Alfa
硝酸银 99(9+,
Aesar公司
琼脂糖1009
Invitrogen公司
TEMED】001111
美国sigllla公司
溴酚蓝52 美国Amresco公司
二甲苯蓝l
g 美国s酒11a公司
其它试剂为国产分析纯
2方法
2(】食管组织标本取材
预先将冻存鹤;高压灭菌,烤箱56?烘干备用。超净台内将RNAlater
何个冻存管rfl分装0(5111l,4。C侏存。食管纷f驯ji4二墩材时选取手术切除
研究论文
的新鲜食管鳞癌标本 术前食管镜已活检病理确诊 ,使用无菌剪刀,
快速剪取癌组织约黄豆大小,迅速浸入装有RNAlater的冻存管中,并立
即送(80?超低温冰箱冻存。正常食管标本取材时选取健康志愿者,使用
组织,迅速浸入装有RNAlater的冻存管中,并立即送(80?超低温冰箱
冻存。
宫颈癌组织标本同食管癌组织标本处理法。
2(2食管组织HPVDNA分型检测
2(2(1
DNA提取步骤
1 将冻存管取
用QIAGENE公司DNA提取试剂盒提取DNA。
出,室温放置,直至管内RNAlater彻底融化,用无菌镊子将组织块从
RNAlater中取出,用目艮科剪剪下一小块组织 约绿豆大小 ,剩余细(织
2 加入l
菌的大EP管中,用眼科剪将其尽量剪碎。
80ulATL,加入
20ul蛋白酶K,盖上盖子,放在涡旋振荡器上振荡混匀,放入56?1亘温
一般1(3小时即可完成
水浴箱中进行组织裂解,直至标本彻底裂解。
0
5秒,70。C水浴l
此步骤 3 低速瞬时离心,加入200ulAL,涡旋l
分钟,加入200ul无水乙醇,涡旋15秒,将大EP管巾所有液体移至收
集管中,加入500ulAW1,室濉8000转离心1分钟,取出后弃去收集
0800转离心6
管,将吸附柱放入新的收集筒:中,加入500ulAW2,室温1
分钟,弃去收集管,将吸附柱放入新的收集管中,室温全速离心1分
钟,弃去收集管,将吸附柱放入无菌大EP管中,加入1ooulAE室温放
置1分钟,室温8000转离心1分钟,弃去吸刚柱,(20?保存大EP管中
的DNA提取液。
2(2(2
DNA浓度和纯度的测定
用1ulDEPC水将核酸测定仪初始化调零,取1ulDNA样r钎,进行检
2(O之间说明DNA纯度较高,提取过程正确,无蛋白质等污染。可用于
后续实验。
2(2(3
PCR扣。增
研究论文
――――――――――――――――――――――――――――――――
――――――――――――――――――――――一一
PCR扩增采用Roch公司的LINEARA对认Y船V
Test,
Geno妙ping
系如下:
聚合酶链反应 PCR 体系 100u1
试剂名称
体积
50ul
。工作液
5ul
萎样本DNA
45ul
管AE
共计 1
00ul
50ul
对工作液
照阳性,阴性对照液 50ul
管共计
100ul
P
应条件
?预变性2分钟,95?预变性9分钟,循环参数:95?变性30
秽
?退火1分钟,72?延伸1分钟,共40个循环,升降温速率
50,。72?终末延伸5分钟,72?保存。升降温速度 。
2(2(4
HPV
DNA分型I令测
将PCR产物从PCR仪中取出,迅速J]口入1
00u1DN,并用移液器充
分混匀。使PCR产物充分变性。
打开水浴篇进行力H热至53?,将SSPE和SDS放入37?水浴箱中至
充分溶解,备用。
Buf隆r 1
配锈!?701(king
Hybl(idization00个样,4丈量
试剂名称
体积
SSPE
100ml
三蒸水 388m1
SDS
12(5ml
共计
500(5m1
――――――――――――――――――――――――――――――――
――――――――――――――――――――――一一
AmbjentWash
Buffer 1
酉己制Working 00个样本量
试剂名称
体积
研究论文
SSPE 133ml
2520ml
三蒸水
SDS 13(3ml
2666(3ml
共计
AmbientWash
Wash
Buffer:从Working
配制WorkingStringent
Buffer中按照每个样本5ml的量取出。放入无菌烧杯中。
Wash
Buffer放
将WorkingHybridizationBuffer和WorkingStringent
入53?士2?的水浴箱中备用。
CitrateBuffer 1OO个样本量
配制Working
试剂名称 体积
CIT 25ml
475ml
三蒸水
500ml
共计
将HPv检测条用无菌镊子取出,标记,依次放入24孔板内,每孔
Buffer,按编号依次加入75ul
内加入4ml预热的WorkingHybridization
变性的PCR扩增产物,振荡混匀。盖上盖子后将24孔板放入53?士2?
水浴摇床内,60RPM振荡30分钟。
配制Workil(19Conjugate 100个样本量
试剂名称 体积
1(5ml
SA(HRP
AmbientWashBut’fer500m1
Working
501(5ml
其计
将24孔板从水浴摇床中取 I,『 j真空泵将孔内的液体吸干。每孔加
入4ml AmbientWashBuffer,前后振荡3―4次后,立刻用真空泵
Worl in2
WashBuffer,
将孔内液体吸干。每孔加入4nll预热的Wol‘kingStringent
盖上盖子,放入56?士2?的水浴摇床中,60I冲M振荡15分钟,真空泵
吸干孔内液体,每孔加入4m1
WorkingConjugate,盖上盖子,室温摇床
60I计M 孵育30分钟。真空泵吸干孔内液体,每孔加4mlWo水in2
Amb;c11t、、,ash
研究论文
Wash
Ambient
孔加4ml
Working
AmbientWashBuffer,
钟。真空泵吸干孔内液体,每孔加4m1
Working
Citrate
Buffer,盖上盖子,室温摇床 60I冲M 孵育5分钟。
Working
Substrate 1OO个样本量
配制Working
试剂名称 体积
SUBA 400ml
SUBB 】00mJ
500ml
共计
本试剂避光保存
真空泵吸干孔内液体,每孔加入4ml
Substrate,室温摇床
Working
60RPM 显色5分钟。真空泵吸干孔内液体,每孔加4ml三蒸水,将
HPV检测条用无菌镊子夹出,置丁洁净平面,读取结果。
2(2(5读取检测结果
将HPV检测条置于比对卡中心的缺口内,并将检测条上的黑色条带
色情况。
2(2(6阳性对照复检
本复检采用HPVE6基因进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳分离检
测。 采用引物序列为上游:
一F游
试剂名称 体积
1Oul
白色体系
6u1
DEPC水
2u1
DNA模板
1ul
E6基因上游引物
1ul
E6基因下游引物
20ul
共计
研究论文
反应条件:94?预变性5分钟,循环参数:94?变性45秒,55?退
存。
PCR结果采用2,琼脂糖凝胶电泳分离,扫描成像,用凝胶成像分
析系统进行分析。
2(3
p16基因突变情况检测