时间分辨荧光免疫法定量测定孕妇血清中甲胎蛋白含量
时间分辨荧光免疫法定量测定孕妇血清中
甲胎蛋白含量
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1784.中华临床医师杂志(电子版)2010年l0月第4卷第1O期ChinJClinicians(ElectronicEdition).October15.201O.V01.4.No.10
时间分辨荧光免疫法定量测定孕妇血清中
甲胎蛋白含量
谭玉华霍道贵廖思红谭子军
【摘要】目的探讨孕妇血清甲胎蛋白(MSAFP)含量与孕周,孕妇体质量和孕妇年龄的关系.
方法自建MSAFP时间分辨荧光免疫测定法(TRFIA)并对其进行评价,采用自建方法定量检测孕妇
血清3711例,建立
参考值,分析AFP浓度与孕周,孕妇体质量和孕妇年龄的关系.结果自建
AFP.TRFIA方法灵敏度优于1.0U/ml,线性范围为1.O0—1000.O0U/ml,分析内,分析间变异系数
(cv)分别不超过10.O%,15.O%,与国外同类试剂比对结果相关性好(r=0.9856).在13,13
周",14,l4周",15,15周",16,16周",17,17周",18—18周",19—19周",20,20 周",21,21周"各孕周的MSAFP含量中位数(肘)分别为16.51U/ml,23.81U/IIll,29.98U/rid, 32.96U/ml,36.86U/ml,43.01U/ml,49.61U/ml,59.66U/ml,71.11U/nil.各孕周MSAFP平均浓度
或浓度中位值与孕周呈线性正相关,r分别为0.9766,0.9832.各体质量段MSAFP浓度与孕妇体质量
呈负相关,r在一0.9929一一0.9142.同孕周组内,各年龄段间的MSAFP浓度均数差异无统计学意义
(P>0.05).结论自建AFP-TRFIA法检测性能能满足临床应用的需要.MSAFP浓
度与孕周和孕
妇体质量密切相关,在产前筛查时要准确校对以上因素.
【关键词】甲胎蛋白类;遗传筛查;荧光免疫测定
Quantitativetestofhumanalphafetoproteininmaternalserulnbytime-resolvedfluorolmmunoassay
TANYu—hua,HUODao—
gui,LIAOSi-hong,TANZi-jurLGuangzhouFenghuaBioengineeringCo.,Ltd., Guangzhou510730,China
Correspondingauthor:TANYu—hua.Email:tanywhy@yahoo.com..cn
【Abstract】
ObjectiveTodevelopatime-resolvedfluoroimmunoassay(TRFIA)formatemalserDm alphafetopmtein(MSAFP)asanaidinprenatalscreening,evaluatetheimpactofgestationalweeks,
maternalW6't,gestationalagesonMSAFPlevels.MethodsTheassaymethodologyofself-mademethod
Wasevaluated.ThelevelofAFPwasquantitativetestedbyself-mademethodin3711healthymaternalserum
samples.ThereferencevalueofnormalWasstudied.Statisticswasusedtoanalyzetheimpactofgestational
weeks,maternalweight,gestationalagesonMSAFPlevels.ResultsThesensitivityofself-mademethod
Wasbetterthan1.O0U/m1.ThelinearrangeWas1.O0U/mlto1000.00U/nil.Theintra-assayandinter—
assaycoefficientsofvariation(CV)waslowerthan10%and15%,respectively.Theaccordanceofourkit
tIltheimportedkitWasgood(P>0.05),andtheaccordancecoefficientwas0.9856.Themedianof
MSAFPlevelWas16.51,23.81,29.98,32.96,36.86,43.01,49.61,59.66,71.11U/IIllin13—
13,
l4.14,15.15,16.16,17.17',
18.18,l9—19,20-20,21-21gestationalweek,
respectively.Fromthe13thweektothe21thweek.theMSAFPlevelsshowedpositivelinecorrelationwitll
gestationalweeks.TheMSAFPlevelsshowednegativecorrelationwitllmaternalweight.buttheMSAFP
levelsshowednocorrelationtIlmaternalages.therewasnostatisticalsignificanceforMSAFPaveragelevels
withgestationalagesinthegroupofages(P>0.05).CondusionsAlltheresults DOI:10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2010.10.004
基金项目:广州经济技术开发区,广州高新技术产业区,广州出口加工区,广州保税
区科技项目(广州市生物
产业发改委资金配套类,2008Ss—P126)
作者单位:510730广州市丰华生物
有限公司(谭玉华,谭子军);中山大学附属第
三医院产科实验室(霍
道贵),输血科(廖思红)
通讯作者:谭玉华,Email:tanywhy@yahoo.COrn.cn
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论着?
中华I临床医师杂志(电子版)2o10年1O月第4卷第10期
ChinJClinicians(ElectronicEdition),October15,2o10.Vo1.4,No.10 oftheparametersshowedthatthemethodwedevelopedcouldmeettheneedofthec~nicappficadon.
Gestationalweeks,maternalweightbearsdirectlyonthelevelsofMSAFPforprenatalscreening.
【Keywords】alpha—fetoproteins;Geneticscreening;Fluoroimmunoassay
母血清甲胎蛋白(maternalserumalpha-fetoprotein,MSAFP)是胎儿先天性缺陷常用
的筛查指标之一.甲
胎蛋白(AFP)最早由卵黄囊少量合成,卵黄囊退化后由胎儿肝脏大量合成,肠和肾也能微量合成AFP.胎儿
血中的AFP经排尿进入羊水并通过胎盘屏障渗入母血.母体血清中AFP约在妊娠10周时可检测到.1984
年Merkatz等最先发现怀有21-三体胎JL(DownSsyndrome,DS)的MSAFP含量降低,以后的研究发现MSAFP
降低与18一三体,l3一三体儿有关,并且AFP也是孕中期筛查胎儿神经管缺陷(neuraltubedefects,YrD)的有
效指标.由于我国幅员广阔,各地区发展不平衡,经济技术和对出生缺陷产前筛查的认识不足,缺少进行产
前筛查的试剂,设备仪器和专业技术人员等原因,部分地区仍无法开展DS,NTD等先天性疾病的产前筛查.
为了使产前筛查在全国深入开展和普及,通过多年研究,MSAFP时间分辨荧光免疫法(time.resolvedfluoroim—
munoassay,TRFIA)在本实验室建立成功,笔者利用自建方法定量测定了371l例孕母血清样本的AFP的含
量,探讨了MSAFP浓度与孕周,孕妇体质量和孕妇年龄的关系,结果分析如下. 材料和方法
1.标本:按《产前筛查技术规范》?,经知情同意,收集了3711例孕单活胎(已超声确定)的孕妇血清
样本,年龄在18.0—44.9岁,平均为(28.5?3.6)岁,经孕周计算(孕妇月经规则者孕周以末次月经第1天
算起,月经不规则者以超声确定孕周),孕周为l3—2l周?,孕妇体质量在33.5,102.0kg,平均体质量为
7.3)kg. (54.3?
2.试剂与仪器:产前筛查AFP的TRHA定量测定试剂盒,泰莱TRFIA仪,恒温振荡仪,全自动洗板机和
企业质控品(广州市丰华生物工程有限公司);参比试剂DELFIA.AFPKit(美国PerkinElmer公司);国家标
准品(中国药品生物制品检定所);室间质评样本由中国卫生部临床检验中心统一发放.
3.自建检测方法:采用双抗体夹心TRFIA一步法原理.准确吸取25
品(复孔)和待测样本依次
加入包被有AFP单克隆抗体的微孔反应板中,每孔加入100p,lAFP单克隆抗体铕标记工作液,室温振荡反
应1.5h,洗板6次,加人增强液100l/,孔,振荡5min后,反应板放入泰莱TRFIA仪内检测荧光值,并用随
仪器配备的拟合分析软件进行结果分析.
4.统计学分析:参考文献[3]对方法学进行主要性能指标评价;剂量一反应曲线由仪器自动给出;检
测结果采用均数?标准差(贾?s)
示;按孕周进行分组,参考文献[4]方法建立本实验室的MSAFP中位
值(median,),并计算各孕周的浓度均值和中位倍数值(multiplesofmedian,MoM);各孕周AFP平均浓
度和中位值与孕周的关系采用线性回归分析;并按同孕周组内孕妇体质量分组(组段按30.0—39.9kg,
40.0—49.9kg,50.0,59.9kg等以此类推分段),计算每组段平均体质量和相应体质量组段的AFP平均
浓度,各组AFP浓度与孕妇体质量的关系采用线性回归性分析;同孕周组内再按孕妇年龄分组(<30.0
岁组,30.0,34.9岁组,/>35.0岁组),计算相应组的AFP平均浓度和标准偏差,组间AFP平均浓度采用
两独立样本t检验,方差齐性采用F检验,检验水准=0.05,P<0.05表明差异具有统计学意义.
结果
1.方法学评价:(1)剂量一反应曲线:采用双对数LOG—LOG_B最佳曲线
拟合模式,曲线的线性相
关系数(coefficientofcorrelation,r)达0.9998,且lO批次曲线检测的20%,50%,80%有
效剂量(20%,
50%,80%effectivedose,ED20,ED50,ED80)的变异系数(coemcientsofvariation,cv)均在1O.00%以内,
剂量一反应曲线稳定;(2)灵敏度:优于1.0U/ml;(3)特异性:检测500ng/ml癌胚抗原,100mg/L白蛋
白,AFP表观值均不高于1.00U/ml,本方法特异性强;(4)线性范围:在1.O0,1000.O0U/ml内,r达0.9990;
(5)准确度:自研试剂校准品与AFP国家标准品的相对效价在0.90—1.10内,校准品定值准确;(6)精密度:实
验内CV%不超过10.0%;实验间CV%不超过15.0%,测量精密度良好;(7)HOOK效应:检测浓度为10000
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U/II1lhAFP国家标准品时,未见HOOK效应;(8)热稳定性:自研试剂盒经37cI=3d烘烤后,性能指标能达到企
业产品标准的要求;(9)室间质量评价:2007,2009年参加卫生部临检中心室间质量评价,3次l5个样本,实测
值与靶值偏倚在一7.86%一7.45%,均在卫生部室间质量评价接受标准(425U/ml,靶值?5U/ml;>25U/llll,
靶值?30%)内;(1O)试剂盒比对:自研试剂与参比试剂同时检测了218例孕妇血清样本的AFP浓度,结果的线
性回归方程为白喇)=0.9223(参比试剂)一0.4885,r=O.9856. 2.实验室参考值的建立及AFP浓度与孕周的关系:通过检测了3711例孕妇血清样本,按孕周建立了参
考值,检测结果详见表1.在13—2l周?内,随孕周的增加MSAFP浓度呈线性上升,MSAFP平均浓度或浓
度中位值与相应孕周呈线性关系,回归方程分别为MsA畔均浓度)=6.3265X(孕周)一62.916,r=0.9766;
I,(MsAFP浓度中位值)=6.2543(孕周)一65.934,r=0.9832.
表13711例正常单胎孕母血清中的AFP检测结果
注:MoM为中位倍数值
3.AFP浓度与孕妇体质量的关系:MSAFP浓度(y)与同孕周内的孕妇体质量()呈负相关,同孕周内
的各体质量段AFP浓度均值与孕妇体质量用线性回归分析,相关系数r在一0.9142,一0.9929.结果见
表2.
表2AFP浓度与孕妇体质量的回归方程与相关系数
13周"组因样本较少,未做进一步分组分析 注:13,
4.AFP浓度与孕妇年龄的关系:母血清AFP浓度与孕妇年龄的线性回归方程为y(姒啦度)=
-
0.2644X(孕妇年龄)+52.829,r=-0.04123,P>0.05.同孕周组内各年龄组段间AFP平均浓度差异无统计
学意义(采用两独立样本t检验,t或tI为一1.64—1.97,P>0.05).结果见表3. ,
2010年1O月第4卷第lO期ChinJClinicians(FAeetronicEdition).October15,2010,Vo!.4,No.1O
表3孕妇年龄对AFP检测结果的影响
讨论
1984年发现怀有DS的孕妇AFP含量低于正常孕妇,这在产前筛查史上是一个划时代的进步,首次可
以用于35岁以下孕妇的产前筛查,为后来探索孕妇血清中其他标记物奠定了基础,为大规模产前筛查指引
等标记免疫了方向.AFP测定方法有酶联免疫,化学发光,电化学发光,TRFIA法.TRFIA法作为一项新兴
的标记免疫检测方法,将抗原抗体反应与荧光物质发光和时间分辨三者结合,该技术灵敏度可高达
10.mol/L[5】.自建AFP—TRFIA法通过方法学性能评价,该方法具有灵敏度高,特
异性强,稳定性好,测定范
围宽等优点,室间质量评价比对好.
利用自建AFP定量检测方法检测3711例孕周为13,21周?的孕妇血清发现,各孕周MSAFP平均浓
度或浓度中位值与孕周呈线性正相关.母血清AFP浓度与同孕周内的孕妇体质量呈负相关.但同孕周组
内各年龄段间AFP平均浓度差异无统计学意义,母血清AFP浓度与孕妇年龄无相关性,但孕妇年龄仍可以
影响筛查的阳性率和估计检出率J.MSAFP随妊娠时间而发生变化,产前筛查中为了消除孕周对血清学指
标的影响,采用统一的筛查标准,常采用将指标值转化成同孕周的MoM值_7剖,每个实验室应建立自己的参
考值或对参考值进行确认.
AFP最先用于NTD筛查,检出率为85%,一般以MSAFP>2.5MoM为标准,为目前其他标记物无法取
代的NTD筛查标记物.而AFP单独用于DS筛查的阳性检出率约为25%,一般以MSAFP<0.4MoM为标
准,也有以MSAFP<0.7MoM为标准l9J.一些仅用单一标记物进行产前筛查的实验室仍然主要使用这一标
记物.我国是一个人口大国,我国的大城市约有20%,25%的围产儿死亡是由出生缺陷造成的?…,NTDs是
一
组高发的严重先天畸形,占总先天畸形的20%,25%_l..,而Ds的发生率约占活产新生儿的1/800,1/
600H?.为此,在产前尽早发现胎儿的先天缺陷,对优生优育,降低围产儿死亡率具有重大意义.AFP—TR—
FIA方法学的建立及其试剂盒的研制,并且TRFIA产前筛查FreeHCG13定量测定试剂盒也在本实验室研制
成功J,这为推动国内产前筛查有着积极的重要意义.国外已推出
TRFIAAFP/FreeHCG13双标记的一体
化试剂盒,这也是今后国内需努力的攻克课题.
志谢感谢冯健明,沈健,何海荣,季涛,李贵情,吴道贫等同志对本研究的支持与帮助 参考文献
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(收稿日期:2010-04-27)
(本文编辑:戚红丹)
谭玉华,~rilt-lt,廖思红,等.时间分辨荧光免疫法定量测定孕妇血清中甲胎蛋白含量[J/CD].中华临床医师杂志:电子版,2010,4(10)
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