【实验报告】离子和体液对离题蛙类心脏的影响

实验四：离子和体液对离蛙类心脏的影响 实验人： 同组人： 【实验目的】 ? 学习离体蛙心的灌流方法。 ? 观察钠、钙、钾等离子，异丙肾上腺素、乙酰胆碱、阿托品、心得安等药物对心脏活动的影响。 【实验原理】     心脏具有自动节律性。离体心脏用理化性质近似于血浆的生理溶液（任氏液）进行灌流，以保持其新陈代谢顺利进行，这种节律性可维持较长时间。 心脏正常节律性活动有赖于内环境理化因素的相对稳定，所以改变灌流液成分，则可引起心脏活动的改变。 心肌细胞生物电活动的基础是钠、钾、钙等跨膜离子流。因此细胞外液中这些离子浓度的变化会对心脏的活动产生不同的影响。 调节心脏活动的神经、体液因素对心脏活动的直接作用是神经递质或激素与心肌细胞相应受体结合，导致心脏活动的增强或减弱。乙酰胆碱与异丙肾上腺素就是通过这种方式发挥作用的。特异的受体阻断剂能阻断相应的递质与受体的作用。 在本实验中通过结扎、插管的方法制得离题活蛙心。 【实验和器材】 蟾蜍，两栖类手术器械，八木氏套管，蛙心夹，万能滑轮，换能器，铁支架，蛙板，任氏液，0.65％NaCl， 4％CaCl2，4％KCl，0.01％异丙肾上腺素，0.01％乙酰胆碱，心得安，阿托品 【实验步骤】 1.    离体蛙心的制备 暴露心脏：同蟾蜍心搏过程描记实验 2.    插管，游离心脏： 将心包膜、动脉膜、肝系膜去除干净。 结扎右主动脉：在右主动脉下穿过两根线，分别结扎，中间剪断。 总结扎线：一端自左主动脉下方穿过，另一端从左右肝静脉下方穿过，打一松结，当心房收缩上提时结扎。将两侧前腔静脉，左右肺静脉结扎在内，注意远离静脉窦。从结扎线以外剪断。 静脉插管：在左右肝静脉和后腔静脉下穿线，打一松结，在左肝静脉远端剪开一楔形切口，将装满灌流液的静脉插管插入静脉，见蛙心膨胀变白后结扎线扣。用灌流液将心脏内血液完全洗出。 左主动脉插管：在左主动脉弓下穿线，打一松结，在动脉管壁远端剪一楔形切口，插入灌流器的导管，见有灌流液流出后结扎线扣。注意动脉插管勿插入主动脉圆锥。 在左肝静脉和左主动脉结扎线外端剪断，将离体蛙心安放于灌流器支架上，调整灌流液液面及动脉套管出口的高度，使心脏收缩时灌流液能顺利搏出心脏，并使灌流液能形成循环，即灌流液自静脉套流入心脏，经心脏由动脉套管流出，滴入静脉套管。 3.    标本及仪器连接 用蛙心夹在心脏舒张期夹住心尖部，蛙心夹上的系线通过弯曲的图钉与换能器相连。 打开软件，示波，选择试验，示波，记录正常心搏曲线。 4.    观察离子和药物对心脏活动的影响： 把蛙心插管内任氏液中滴加0.65％NaCl2滴溶液，观察曲线的变化，待变化明显后，立即将其全部吸出，用新鲜任氏液冲洗2－3遍后，保存于任氏液中，使心脏恢复正常搏动。 按照上述方法向任氏液中依次加入下列试剂，观察记录蟾蜍心脏活动曲线的变化情况： 1) 4％CaCl22滴 2) 4%CaCl2 6滴            3) 4%KCl 1~2滴          4) 0.01%异丙肾上腺素1滴        5) 0.01%心得安 1滴，约1分钟后，异丙肾上腺素 1滴 6) 0.01%乙酰胆碱1滴 7) 0.01%阿托品 1滴，约一分钟后，乙酰胆碱 1滴      用新鲜任氏液换洗使心搏过程恢复正常 注意：制备蛙心标本时，勿伤及静脉窦。心脏插管时，切勿戳穿心壁。各种液体滴管要专用，不可混用。蛙心插管内液面应保持一定高度，以1.5 cm 为宜。每加一种溶液要用滴管混匀，以免所加溶液浮在上面，不易进入心脏。张力换能器应向下倾斜，以免液体进入换能器。滴加试剂后，一旦出现作用应立即用新鲜任氏液换洗2－3次，以免心肌受损，而且必须待心脏恢复正常后方能进行下一步实验，以形成前后对照。滴加药品和换取新鲜任氏液时，须及时标记，以便观察。化学药物作用不明显时，可再适量滴加，密切观察药物剂量添加后的实验结果。随时用任氏液润湿蛙心面。 【实验结果及相关讨论】 1、 任氏液灌流下和0.65%NaCl灌流下的心搏曲线 任氏液的成分和蛙类体液的成分基本一致，因而蛙心在任氏液中的心搏曲线稳定而平缓。如下图所示。0.65%NaCl的成分和任氏液的成分接近，心搏曲线没有明显变化。 Fig 1: 任氏液中心搏曲线 Fig 2: 加NaCl后心搏曲线     从上图来看钠离子对心脏功能的影响并不明显，这主要是由于：Na的内流是形成动作电位的基础，细胞外Na浓度的改变主要是影响动作电位的去极化过程。从理论上说，如果细胞外Na浓度大幅升高，膜内外Na浓度差增大，Na内流加速，引起兴奋所需刺激减小，兴奋性增高。Na内流加速超过了Na外流，使4期自动去极化加速，自律性因此升高。Na内流加速又可是0期去极化速度增高，扩布性兴奋加速，传导性也升高。高钠时由于Na、Ca在细脑膜上的竞争性抑制作用，使Ca内流减少，另方面Na内流的增加还可以通过细胞膜上的Na—Ca交换机制使Ca外流增加，引起细胞内Ca浓度降低，心肌收缩力量减弱。如图所示 Fig 3：加入NaCl的理论样图 然而心肌细胞对钠的变化不敏感，Na浓度必须有很大变化才会引起上述生理特性的改变，而在本次实验中0.65%NaCl与灌流液任氏液中的Na离子的浓度相同，因而未观察到明显变化。 2、 4%CaCl22滴下的心搏曲线 从图中来看，加入4%CaCl22滴后蛙心搏动幅度加大，但心搏周期略微变大，频率略变小。立即用任氏换洗后，心脏曲线则逐渐恢复正常。从Fig4中已看出略微增大钙离子的浓度能加大心脏搏动的幅度。实验中也观察到蛙心比正常时要膨胀些。 Fig 4：4%CaCl22滴心搏曲线     3、 4%CaCl2 6滴下的心博曲线 当进一步加大钙离子的浓度，心肌的搏动幅度超过了心脏的承受能力时，就会出现肌僵现象，心脏在短时间内大幅度搏动后心脏功能衰竭，心脏持续收缩，实验过程也观察到在出现搏动曲线峰值时心脏缩成一小团。 钙离子对心脏搏动的影响主要有以下两个方面： 频率：Ca2+是一种对心脏活动不可或缺的离 Fig 5：4%CaCl26滴心搏曲线     子。在心脏的跨膜电位的产生过程中，心肌细胞膜上的电压门控式的慢Ca2+通道当膜去极到-40mV时被激活，Ca2+顺着浓度梯度向膜内缓慢扩散而倾向于使膜除极化。与此同时还存在微弱的K+外流倾向于使膜复极化，在平台期早期，Ca2+的内流和K+的外流所负载的跨膜正电荷量近似相等，膜电位稳定于1期复极所达到的电位水平。随着时间推移，Ca2+通道逐渐失活，K+逐渐增加，其结果是出膜的净正电荷量逐渐增加，膜内电位于是逐渐下降，形成平台期晚期。此后，Ca2+通道完全失活，内向离子流终止，外向K+流进一步增强，平台其延续为复极3期，膜电位较快地回到静息水平。 当钙离子的浓度增高时，高钙离子加强了钙离子的内流，而使钠离子的内流减少，阈电位升高，于是细胞的兴奋性和传导性都降低。高钙离子可使快反应自律细胞的自律性降低，但使慢反应自律细胞的自律性升高。这是由于膜外钠离子的内流减少，造成了膜内钾离子的外流相对增多，导致快反应自律细胞4期自动滑速度减慢，因而自律性降低；对于慢反应自律细胞，则由于膜外钙离子的内流增多，使4期自动去极化速度变快，因而自律性升高。由于蛙心是受快反应自律细胞控制，所以频率降低。 从Fig 4、5，都可以看出心脏频率减小。 强度：当肌细胞上有动作电位传来时，肌浆网（即纵管系统）释放Ca2+，引起肌浆中Ca2+浓度升高，作为Ca2+受体的肌钙蛋白结合了足够数量的Ca2+，就引起肌钙蛋白分子构想的某些改变，传递给原肌凝蛋白，是后者的构象也发生改变，结果是原肌凝蛋白的双螺旋结构发生某种扭转，把安静时阻止肌纤蛋白和横桥相互结合的阻碍因素出去，出现两者的结合。在横桥和肌纤蛋白的结合、扭动、解离等过程中，细肌丝不断向暗带中央移动，使肌肉收缩。因此，提高细胞外液中Ca2+浓度，也能使肌钙蛋白结合更多的Ca2+，从而增强心肌的收缩作用。因而，钙离子是肌肉收缩的信息通路中的一个重要信号分子，当钙离子的浓度增高时，收缩强度增大。 从Fig 4、5 ，都可以发现收缩强度增大，另外，当离子浓度过高时，引起心脏持续收缩（Fig 5）。 4、 4%KCl 1.5滴时的心搏曲线 从图中来看，加入微量KCl后，心脏的收缩幅度变小。理论上，能够观察到心搏停止于舒张期，然而由于清洗较快，所以效果不明显。 K+ 对心脏搏动的影响主要是由于：K+的外向流动对心肌细胞的复极起着重要的作用。在静息状态下，肌膜对K+的通透性较高，因此静息时K+顺着其浓度梯度由膜内向膜外 Fig 6：4%KCl6滴心搏曲线     扩散而达到平衡电位。在外界刺激的作用下，心肌细胞部分电压门控式Na+通道开放，引起少量的Na+内流，导致肌膜部分去极化，当膜电位由静息水平去极化到域电位水平时，膜上Na+通道开放概率明显增加，导致Na+顺气浓度梯度和电位梯度由膜外快速进入膜内，进一步使膜去极化。这种去极化的结果是K+的平衡状态被打破，K+有向胞外扩散的趋势。但由于在0期除极过程中K+的通透性显著下降，只有当除极相结束时，K+通道的通透性才开始极其缓慢地、部分地恢复，K+的外流也就由初期的低水平而慢慢增加。随着K+通道的通透性升高，跨膜电位依次经过平台期，复极3期，从而使膜电位较快地恢复到静息水平，完成复极化过程。当钾离子浓度过高时，由于静息电位过小，推动钠内流的电位差不足而使去极减慢减弱，甚至不能去极，故兴奋性，传导性都降低，严重时可完全失去兴奋性和传导性。高钾又使复极时膜对钾离子的通透性升高，钾外流加快，从而使快反应细胞4期自动去极速度减慢，自律性降低。 综上，K+外流的普遍增加将影响心肌细胞生物电活动的多个环节： a) 静息状态下K+外流的增加将导致静息电位绝对值增大，因此，静息电位与阈电位的差距扩大，心肌兴奋性有所下降； b) 在窦房结细胞，复极过程中K+外流增加的结果是最大复极电位绝对值增大；另一方面，其4期K+外流的增加将使Ik衰减过程减弱，自动除极速度减慢。这两方面因素均导致窦房结自律性降低，心率因而减慢， c) 复极过程中K+外流增加导致复极加速，动作电位时程缩短，有效不应期也相应缩短。由于动作电位时程缩短，每一个动作电位期间进入细胞内的Ca2+量相应减少。 如Fig 7所示，心脏频率降低，幅度减小。 Fig 7：加入KCl的理论样图 如果继续加大浓度，将导致心动过缓和传导阻滞，严重时可使心搏停止于舒张期。如上图所示。 5、 0.01%异丙肾上腺素1滴时的心搏曲线 加入异丙肾上腺素溶液后，心脏搏动幅度剧烈增大，灌流液呈水柱状从动脉套管中流出，无论从频率还是从幅度上心脏搏动都相当剧烈。立即换上任氏液后，心脏活动虽有减缓的趋势但仍然相对激烈，较难恢复到正常水平。可见即使微量的异丙肾上腺素对心脏活动的影响也是很大的，而且作用时间较长。 异丙肾上腺素（Isoproterenol）是一种强的合成拟交感胺的非选择性β受体激动剂，它核心交感神经末梢释放的递质去甲肾上腺素类似，都能与心肌细胞膜β型肾上腺素能受体相结合，通过使通道蛋白质磷酸化改变膜上离子通道的开放概率和其他亚细胞结构的功能，产生正性变力、正性变时和正性变传导性效应。它主要对β1和β2受体有强大的激动作用，而对α受体几乎无作用。 Fig 8：0.01%异丙肾上腺素1滴心搏曲线 Fig 9：异丙肾上腺素结构式     其作用在心肌细胞膜的β肾上腺素能受体而发挥效应。 1) 对起搏活动的影响，使自动节律细胞的舒张除极加速，自律性增加，称为正性变时作用。 2) 对静息膜电位和动作电位的影响，使自动节律细胞的最大舒张电位轻度增大(过度极化)，这是由于肾上腺素受体具有刺激生电性钠泵的作用之故，引起心肌细胞的兴奋性增强。 6、 0.01%心得安 1滴，约1分钟后，异丙肾上腺素 1滴时的心搏曲线 在未加入心得安前，受上组实验中异丙肾上腺素的影响，心脏活动依然很剧烈，加入心得安后从图中心搏曲线来看，心脏搏动幅度迅速减缓，1min后即使加入异丙肾上腺素后，心脏活动依然保持加心得安后的状态，我们怀疑是心脏搏动太缓慢，不能迅速的把心得安搏出把异丙肾上素博进心脏，我们就 Fig 10：0.01%心得安1滴心搏曲线     进行了人工心脏复苏帮助蛙心搏动，但没见起效，同时蛙心出现了漏液现象。蛙心始终搏动特别缓慢。导致这种现象可能有以下原因：1）该蛙心本身功能可能存在一定问题，应急代偿能力较差，无法承受心得安的药量。2）我们在人工心脏复苏时用力不够合适导致蛙心破漏，内外压力失常无法有效地把药物泵出泵进，心肌功能丧失。 心得安的作用机理主要是心脏仅有β1肾上腺素能受体，对去甲肾上腺素、肾上腺素（或异丙肾上腺素）起反应，结果产生正性肌力作用（增加收缩强度）和正性变时性效应（增快心率）。心得安通过于心肌及心脏传导组织β受体部位与儿茶酚胺进行竞争，结果产生负性肌力和负性变时变性效应。 Fig 11：心得安结构式     7、 0.01%乙酰胆碱1滴时心搏曲线 有于我们的蛙心抵抗不住心得安的药效，一直没有恢复过来，在加入乙酰胆碱后心博曲线没有变化，心脏已经完全衰竭，对外来药物刺激没有反应。理论上加入乙酰胆碱后，心脏搏动会变缓慢，心率降低。 乙酰胆碱（acetylcholine, Ach）是迷走神经兴奋时，节后纤维所释放的一种神经递质，它能够激动心肌细胞膜上的M型胆碱能受体，产生负性变力、负性变时和负性变传导性等效应。有研究表明，乙酰胆碱能普遍提高K+通道的开放概率，促进外向K+流，是迷走神经心肌效应的主要机制。另外有研究表明，乙酰胆碱能直接抑制Ca2+通道、减少内向Ca2+流 Fig 12：0.01%乙酰胆碱1滴心搏曲线 Fig 13：乙酰胆碱结构式     的作用。另外，当左侧迷走神经兴奋时，房室交界慢反应细胞动作电位幅度减小，兴奋传导速度减慢，这也是乙酰胆碱抑制Ca2+通道、减少Ca2+内流的结果。小剂量Ach即能激动M胆碱受体，产生与兴奋胆碱能神经节后纤维相似的作用，引起心率减慢。大剂量Ach作用下，全部神经节（具N1胆碱受体）兴奋的结果是心肌收缩力加强。 8、 0.01%阿托品 1滴，约一分钟后，乙酰胆碱 1滴的心搏曲线 由于我们的蛙心已经衰竭，在这组实验中心搏曲线依然没有发生变化，心搏曲线维持在加入心得安后的水平。 理论上阿托品为竞争性M胆碱受体阻断药，对M胆碱受体有高度的选择性及有较强的亲和力，阻断Ach对M胆碱受体的激动作用。加入阿托品后心脏会恢复由于加入乙酰胆碱而导致的心率变低的状态。 Fig 14：阿托品结构式     阿托品与M胆碱受体结合后内在活性很小，一般不产生激动作用。阿托品对M胆碱受体亚型的选择性较低，对M1、M2、M3受体均有阻断作用。大剂量阿托品对N1(神经节)胆碱受体有阻断作用。阿托品对Ach的生物合成、贮存、释放过程均无影响。 【结论】 蟾蜍心脏上存在β1肾上腺素能受体（对去甲肾上腺素、肾上腺素或异丙肾上腺素起反应）、M型胆碱受体（对乙酰胆碱或胆碱受体激动药及阿托品等抑制剂起反应）。心脏的活动由心交感神经和心迷走神经来调节。心交感神经兴奋时（如运动、劳动、情绪激动时）心跳加快加强；心迷走神经兴奋时（如睡眠时）心跳减慢。心脏的活动还受一些体液因素的调节。如血液中有一些内分泌素，如肾上腺素和甲状腺素能使心跳加快加强。体内的电解质如钾、钙离子也影响心跳，钙离子增高可使心肌收缩加强，心跳加快。钾离子增高可使心肌收缩力减弱，心跳减慢。温度的高低也可影响心率。如温度升高，可使心跳加快，温度下降可使心跳减慢。总之，心脏的活动是受神经、体液和环境等因素影响的。本实验有效的证明了体液调节对心脏的作用。 【参考文献】 《人体及动物生理学》王玢 高等教育出版社  1998 《动物生理学实验》 魏香 清华大学出版社