RP-HPLC直接测定水果中维生素C含量
1 *刘贵花 潘富友
(台州学院 医药化工学院 浙江临海 317000)
(5 ,m 4.6×250 mm),摘 要:应用反相高效液相色谱法对时令水果中维生素C含量进行直接测定。方法, 色谱柱Eclipse XDB-C18
流动相乙腈-水(40?60 v/v),流速1.0 ml/min,检测波长275 nm。实验结果
明维生素C在10 ~ 640 μg/ml范围内呈良好线性,2R=0.99996,回收率为99.3% ~ 104.5%,RSD=1.65%。本法操作简便,结果准确、重现性好,为测定水果中维生素C的含量提供了一种有效方法。
关键词:水果,维生素C(Vc),反相高效液相色谱(RP-HPLC)
中图分类号: 文献标识码:A 文章编号:
Determination on Vitamin C in Fruits
by RP-HPLC
Liu Guihua, Pan Fuyou
(Taizhou University School of Pharmaceutical and Chemical Engineering Zhejiang Linhai 317000)
Abstract: The vitamin C in fruits of the season was tested directly by reversed-phase high performance 1iquid chromatography.The
methods was that the Eclipse XDB-C Column (5 ,m 4.6×250 mm) was used and the mobile phase was a mixture of acetonitrile and water 18
(40?60 v/v) and The flow rate was 1.0 ml/min and the detection wavelength was 275 nm. The experiment results showed that the better linear relation was achieved when the concentration of vitamin C was 10 ~ 640 μg/ml, the related coefficient was 0.99996 and the rang of recovery was from 99.3% to 104.5% and the relative standard deviation was 1.65%. The mothod is easy to operate with precise result and good reproducibility, which establishes a reliable method for determination of vitamin C in fruits.
Key words: Fruits; Vitamin C(Vc); Reversed-phase high performance 1iquid chromatography(RP-HPLC)
方法所需试剂多且操作繁琐,测定结果准确性也存0 引言 ,6在一定问题,。近年来发展了用高效液相色谱法测
维生素C,又称抗坏血酸(AH2))。医学研究发定维生素C含量的方法,具有高效、快速、稳定、现它不但具有生理活性,而且在人体内能阻止亚硝可靠等特点,但文献报道的所用流动相体系均较复
,1,,7-10,胺的形成,具有一定的防癌作用。但人体自身不杂,一般都采用了缓冲盐或者低浓度酸。本文应能合成维生素C,必须由食物中摄取,所以分析测用反相高效液相色谱法,采用乙腈-水(40?60 v/v)定水果和蔬菜中维生素C含量,将对鉴别水果和蔬作流动相,直接测定了时令常见水果中的维生素C菜的营养价值具有重要意义。目前水果和蔬菜中维含量,取得了理想的效果。
,2,生素C测定的方法除了药典规定的碘量法,还有 ,3,,4,,5,比色法、紫外分光光度法、荧光法等,但这些
收稿日期: 1 实验部分
基金项目:浙江省自然科学基金(M2003115)
1.1 主要仪器与试剂 1 刘贵花,女,在读硕研,(1983-),主要从事色谱研究
*通讯联系人,教授,硕导,panfy@tzc.edu.cn
1
Agilent 1200液相色谱仪,配有VWD检测器;μg /ml的溶液,用0.1%磷酸溶液作参比溶液,在UV-2450紫外分光光度计;Milli-Q纯水超纯水系统; 200~400 nm波长扫描,结果发现在275 nm波长处HS-120D超声波清洗机;AP-01过滤器;FA2004A 电有最大吸收。故本文以275 nm为检测波长。 子天平。 2.3 流动相和流速的确定
甲醇、乙腈(色谱纯),TEDIA公司;抗坏血取抗坏血酸适量,用0.1%磷酸溶液配成约160 酸(分析纯),无锡展望化工试剂有限公司;磷酸(分μg /ml的溶液,实验过程中尝试了甲醇、甲醇-水乙析纯),无锡飞达化工厂;超纯水(由Milli-Q纯水腈、乙腈-水等不同体系及配比的流动相,并对流速超纯水系统制备)。 从0.5,1.5 ml/min之间进行反复实验,结果表明,1.2 色谱分离条件 当流动相为乙腈-水(40?60 v/v),流速为1.0 ml/min
色谱柱:Eclipse XDB-C18(5 ,m 4.6×250 mm),时,不但能得到了良好的峰形、适当的保留时间和流动相:乙腈-水(40?60 v/v),流速:1.0 ml/min, 波较高的理论塔板数,同时能对果汁中其它物质得到长:275 nm;进样量:10 ,l。 较好的分离;而且避免了流动相体系中加入缓冲盐1.3 溶液配制 和低浓度的酸,既保护了色谱柱,又使得实验操作1.3.1
贮备液的配制 更简便,维生素C的定性分析图见图1。
精密称取抗坏血酸0.25 g,置250 ml容量瓶中,
加0.1%磷酸溶液溶解并稀释至刻度,摇匀。得1000
μg /ml的标准贮备液。
1.3.2 标准溶液的配制
分别精密量取1 ml、2 ml、4 ml、8 ml、16 ml、
32 ml 、64 ml的标准贮备液至100 ml量瓶中,用
0.1%磷酸溶液稀释至刻度,得10 μg /ml、20 μg /ml、
40 μg /ml 、80 μg /ml、160 μg /ml、320 μg /ml、640
μg /ml的系列标准溶液。
1.3.3 供试品溶液的配制(样品前处理)
将买来的新鲜水果洗净,晾干后分别置于匀浆
机中匀浆,用布氏漏斗过滤,再精确称取10 g滤液
图1 维生素C的定性分析谱图 至50 ml容量瓶中,用0.1%磷酸稀释至刻度,进样
Fig 1 The qualitative analysis chromatography of Vitamin C 前用0.45 μm针头式过滤器过滤。
1.4 测定方法和结果计算
根据色谱分离条件,将仪器调节到进样分析状2.4 标准曲线和线性范围
态,用平头针头精确量取10 μl进样分析,保存色谱精确吸取上述不同质量浓度的系列标准溶液10 图记录峰面积,并根据质量浓度-峰面积作标准曲线μl,按色谱分离条件进样分析,保存色谱图记录峰用外标法进行计算。 面积。并以质量浓度X(μg/ml)为横坐标,峰面积Y
(mAu*s)为纵坐标作图,得标准工作曲线的回归 方程为Y = 2.51601 + 3.55617 * X,相关系数R2为
0.99996。结果表明:维生素C在10 ~ 640 μg/ml之2 结果与讨论 间呈现良好的线性关系,见图2。 2.1 溶剂的选择
维生素C具有较强还原性,且易受空气、热、
光、碱性物质、金属离子等因素影响,但在酸性溶
,11,液中稳定,为防止分析过程中维生素C的破坏,
实验采用0.1%磷酸溶液作溶剂配制各种溶液。
2.2 检测波长的确定
取抗坏血酸适量,加0.1%磷酸溶液配成约160
2
表1 不同水果中维生素C的含量测定 2500
Table 1 Determination on Vitamin C in different Fruits Y = 2.51601+ 3.55617 * X
2000峰面积质量浓度 每100克中Vc含量2)R=0.99996水果名称 (mAu*s) (μg/ml) (mg) 1500mAu*s563.92 157.89 78.93 菠萝
1000699.79 196.08 98.04 面积(草莓 峰
938.95 263.33 131.67 圣女果 500
1118.34 313.78 156.89 猕猴桃
0
2.6 精密度实验 0100200300400500600700
质量浓度(ug/ml)取草莓供试品溶液,按上述的色谱条件连续进
样6次,保存色谱图并记录色谱图中的维生素C对图2 维生素C的标准曲线
应的峰面积。结果峰面积相对标准偏差RSD为 Fig 2 The standard curve of Vitamin C
0.9416%,表明本法精密度较高,重现性较好。实验
。 结果见表22.5 样品测定
2.7 稳定性实验 2.5.1 样品定性分析
准确称取20.0 mg的抗坏血酸分别置于两洁净精密吸取各供试品溶液10 μl,按色谱分离条件
的50 ml烧杯中,其中一份用超纯水溶解,稀释定进样分析,保存色谱图记录峰面积,并根据在同一
容至50 ml容量瓶中,另一份用0.1%磷酸溶解、稀实验条件下纯物质保留时间定性,得出各水果样品
释定容至50 ml容量瓶中。每隔2小时对两溶液按中维生素C的相对应的归属峰。猕猴桃的色谱分离
色谱分离条件进样分析,保存色谱图并记录色谱图图见图3。
中的维生素C的峰面积,然后计算并比较两溶液中
维生素C含量的变化情况。结果表明:用0.1%磷酸
溶解的维生素C在4 h内较稳定,而用超纯水溶解
的溶液稳定性则相对较差,因此更进一步说明了维
生素C在酸性条件下相对比较稳定;但随着时间的
推移,维生素C含量也将逐渐减少,这同时表明新
鲜水果要尽快食用,以免营养成分流失。实验结果
见表3。
表2 方法精密度实验结果
Table 2 The result of degree of precision of this method
编号 峰面积(mAu*s) 质量浓度(μg/ml) RSD值(%)
图3 猕猴桃中维生素C的分析谱图 1 704.85 197.49 Fig3 The chromatography of V in Chinese gooseberry C2 691.18 193.65 3 707.19 198.15 0.9416 2.5.2 样品定量测定 4 700.08 196.16 精密吸取各供试品溶液10 μl,按色谱分离条件5 692.54 194.04 进样分析,保存色谱图并记录色谱图中的维生素C6 702.94 196.96 对应的峰面积,然后根据外标法对各时令水果中的
维生素C含量进行定量计算,各时令水果的维生素表3 方法稳定性实验结果 ,分析结果见表1。 Table 3 The result of stability of this method
时溶剂为纯水 溶剂为0.1% RSD(%) RSD(%)
3
间 的V量(mg) 磷酸的V量(mg) CC
0 20.00 20.00
2 18.34 19.98
4 16.88 19.88
6 15.46 24.91 18.68 7.68
8 12.90 18.07
10 11.42 17.86
12 9.86 16.15
2.8 回收率实验
回收率实验选在圣女果中进行。分别精确移取
圣女果的供试品溶液5 ml于5个50 ml洁净容量瓶
中,再分别直接准确加入2、4、6、8、10 ml质量
浓度为320 μg /ml的维生素C标准溶液,然后用
0.1%磷酸稀释到刻度,按色谱分离条件测定,保存
色谱图并记录色谱图中的维生素C对应的峰面积,
然后根据外标法定量计算,同时计算回收率,实验
参考文献: 结果见表4。
[1] 彭家泽,刁洁.抗坏血酸的生理功能及其在食品中的应用
[J].食品与机械,1994,(4):29. 表4 维生素C的回收率实验结果
[2] 中国人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药Table 4 The result on recovery ratios of Vitamin C 典二部[M].北京:化学工业出版社,2005:669. RSD编本底 加入量 测得量回收率 [3] 杨宇民,沈毅.催化分光光度法测定生物样品中维生素C 号 (μg/ml) (μg/ml) (μg/ml) (%)
[J] .中国卫生检验杂志,2000,10(5):566-567. 1 26.33 12.80 39.46 102.6% [4] 冰冰,周晓光,朱泮民.紫外光度法测定药品中抗坏血酸的2 26.33 25.60 53.08 104.5% 研究[J].光谱实验室, 2005,22(1):152-153.
3 26.33 38.40 65.38 101.7% 1.65 [5] 曾美云,邱海鸥,郑洪涛,武明丽,汤志勇.动力学荧光法测
4 26.33 51.20 77.17 99.3% 定抗坏血酸[J].分析试验室,2008,27(1):16-18. [6] 何琳琳.抗坏血酸测定方法及存在的问题探讨[J].西南科5 26.33 64.00 91.35 101.6%
技大学学报, 2005,20(1):69-71.
[7] 胡应杰,潘康标,陈昌云,柳闽生.高效液相色谱法测定辣椒中维生素C的含量[J].南京晓庄学院学报,2008,(6):30-32.
3 结论 [8] 陈再洁,郑建明,王智.高效液相色谱法测定维生素C片中VC含量[J].分析仪器,2008,(6):37-39. 本文利用反相液相色谱法直接测定了水果中维
[9] 王艳颖,姜国斌,胡文忠,范圣第等.高效液相色谱法测定草生素C含量,其操作简单,分离时间短,分离效果
莓中维生素,含量[J].大连大学学报, 2006,(2):52-53. 较好,测定结果准确度和重现性也较好,且不受样
[10] 蒋晔,刘红菊,郝晓花.反相高效液相色谱法同时测定,品中其它组分的干扰,特别是流动相体系中不需用
种水溶性维生素[J].药物分析杂志,2005,25(3): 339-342. 到缓冲盐和低浓度的酸,既能保护色谱柱,又能使
[11] 李玉明,白洁.高效液相色谱法分析西红柿中的维生素C实验操作更简便。该法同样可以适用用于其他水果
含量[J].衡阳师范学院学报,2007,28(6):102-103. 或果汁饮料等食品中的维生素C含量的快速测定。
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