【doc】人输卵管细胞对精子存活的影响
人输卵管细胞对精子存活的影响
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222?生殖医学杂志2002年8月第11卷第4期
人输卵管细胞对精子存活的影响
周寒鹰.,姚元庆,尹国武,黄飞,杨瑛,罗亚宁
(1.第四军医大学唐都医院妇产科,西安710038;2.陕西省妇幼保健院,西安710003)
【摘要】目的:研究人输卵管细胞对精子存活的影响.
:人精子与人输卵管细胞
进行体外共培养,并以Earle’S平衡盐液培养的精子作为对照.每日观察精子存活情况,并
以伊红染色检测精子的存活率.结果:在共培养组,人精子存活时间明显高于对照组(P<
0.01).共培养组精子在9,24,48h的存活率分别为(90.82?1.94)oA,(71.46?6.19),
(46.64?5.59);高于对照组相应时间的存活率
(83.554-_5.36),(46.464-_4.59),
(18.36?4.11),差异显着(P均<O.01).结论:人输卵管细胞及其培养液能延长精子的
存活时间.
【关键词】人输卵管细胞;精子;共培养;存活率
【中图分类号]R321.2【文献标识码】A【文章编号】
3845(2002)04—0222—04 1004—
Effectofhumanoviductalcellsonspermviability
ZHOUtJan—ying,YAOYuan—qing-YINGUO—WU
HUANGFei,YANGYing,LUOYa—ning
Department(}Obstettics.@necology,7angduHospital,
‘heFourthMilitaryMedicalUniversity.Xi’an710038
[Abstract]
Objective:Toinvestigatetheeffectofhumanoviductalcellsonviabilityofhu
man
spermatozoainvitro.
Methods:HumanspermswereCO—culturedwithhumanoviductalcellsinvitro.HU—
manspermatozoaculturedwithEarle’Smediumwereusedascontro1.Spermviability
wasobserveddailyandevaluatedbyEosinstaining.
Results:Co—culturedspermssurvivedfor(7.33?1.86)days.Thespermatozoal
survivaldurationinCO—culturedgroupswassignificantlylongerthanthatincontrol
groups(P<0.01).TheviabilitypercentagesinCO—culturedgroupswere(
90.82-+-
1.94),(71.46?6.19),and(46.64?5.59)at9,24,48hrsrespectively.Thecot一
【收稿日期12002—02—18;【修同日期12002—03—18
【作者简介】周寒鹰(197o,),女,重庆市人,硕士,主治医师,从事妇产
科及生殖医学专业
生殖医学杂志2002年8月第11卷第4期
在NSL动物,输卵管是配子输送,储存,受
精及早期胚胎发育的微环境.精子可以在输卵
管内存活数小时到几天,_1j.在这一期间,输卵
管细胞和精子可能互相作用,从而影响精子的
授精功能.研究发现,动物输卵管细胞对精子的
存活,获能,运动,顶体反应,精卵融
合等功能有影响.有关人输卵管细胞对精子
及早期胚胎发育的影响的研究较少一.本实验
通过建立人输卵管细胞与精子体外共培养模
型,观察人输卵管细胞对精子存活的影响.
材料和方法
一
,人输卵管细胞的培养
在输卵管结扎术或全子宫切除术时取部分
正常输卵管,解剖显微镜下纵向切开,撕下粘膜
上皮,磷酸缓冲液(PBS)冲洗,剪碎,移人离心
管.加入5ml0.05胰蛋白酶/0.53mmol/L
二乙烯四乙酸二钠(EDTA)混合液(美国GIb—
CO公司),37C振荡消化45min.PBS液离心冲
洗两遍终止胰蛋白酶的作用后,加入5ml培养
液.培养液为DMEM/F12(美国Gibco公司),
外加碳酸氢钠1.2g/L,青霉素G0.006g/L,
链霉素0.0075g/L,及15胎牛血清(FBS).
接种于四孔培养板(丹麦Nunc公司),37C,
5CO孵箱中培养.24h观察细胞贴壁情况,
每48h更换培养液.待细胞汇合生长达70%
时,即可进行共培养实验.
二,精子的采集和处理
精液标本来源于我院不育症门诊就诊患者
的丈夫,手淫取精,符合世界卫生组织正常标准
的精液].精液完全液化后,通过上游法或Per—
eoll法分离精浆和精子.获得的精子用改良的
Earle’S平衡盐液离心洗涤两遍待用.其改良的
平衡盐液为:Earle’S平衡盐溶液(EBSS,Sigma
公司)外加牛血清白蛋白(BSA)0.3g/L(华美
公司),丙酮酸钠0.0033g/I,青霉素G0.006
g/L,链霉素0.0075g/1,碳酸氢钠0.22g/I
(Sigma公司).本研究共采集13份精液标本,
经处理后与人输卵管细胞进行共培养.
三,输卵管细胞与精子共培养
四孔培养板内的人输卵管细胞在37C,
5CO:孵箱中培养达到70汇合时,用
EBSS/BSA洗两遍.每孔加入3×10精子和1
m1EBSS/BSA共培养.共培养9,24,48h后,
将含精子的培养液轻轻吹打使之混匀,分别移
入离心管,加入新鲜的EBSS/BSA清洗后重新
悬浮,待检.对照组为无输卵管细胞的四孔培养
板内加入3×10精子和1mlEBSS/BSA进行
培养.
四,精子存活检测
1.精子最长存活时间:每日取出培养皿,
相差显微镜下观察精子的运动,判断精子的存
活情况.当95精子死亡时停止观察.
2.精子存活染色:取201精子悬液滴于
载玻片上,加20ffl0.5伊红充分混匀,盖上
盖玻片,显微镜下观察并计数.
五,统计学方法
结果以均数?标准差(?),
示采用t
检验和方差分析.
结果
95的精子死亡在共培养组为(7.33?
1.86)d,而对照组为(3.O0?1.27)d,两组比
较有明显差异(P<0.01).其中共培养组精子
存活最长时间为10d,对照组则仅为5d.精子
与人输卵管细胞共培养或在EBSS/BSA中培
养9,24,48h后的存活率如表1所示,随着培
养时间的增加,两组的精子存活率均逐渐下降.
但在上述各时点,共培养组精子存活率显着高
于对照组(P<0.01).
讨论
在哺乳动物,输卵管为配子输送,储存,受
精及早期胚胎发育提供了微环境.受精过程包
括了精子的获能,运动,顶体反应,精子透明带
结合,精卵融合.上述过程都发生在输卵管内.
生殖医学杂志2002年8月第l1卷第4期
表1精子与人输卵管细胞共培养后不同时点精子存活率(?)
注:与对照组比较,P<O.O1
研究输卵管对精子影响,对于理解受精及体内
微环境对受精的影响具有一定的理论意义,对
于体外受精和胚胎早期培养则有潜在的应用价
值.
以往动物实验发现,输卵管细胞能延长精
子的存活时间l2],诱导精子获能和顶体反
应],增强精子运动],促进精子透明带附着
和精卵结合].本研究结果显示,人输卵管细胞
在体外可延长人精子的存活.我们发现,与输卵
管共培养的精子在48h内的存活率明显高于
普通培养液培养的精子.此外,共培养精子
959/6死亡时间平均为(7.33?1.86)d,最长存活
时间为10d.而对照组精子959/6死亡时间仅为
(3.O0?1.27)d,最长存活时间也只有5d,均
较共培养组短.文献[1叩报道,排卵前6d的精子
仍可导致怀孕.这一临床观察与我们的实验研
究结果相符.
输卵管细胞体外培养的建立使精子与输卵
管的相互作用的研究成为可能l1”].在有或无
共培养时可直接比较精子功能.采用体外共培
养方法避免了人输卵管生殖生理研究的伦理问
题.我们通过这一个体外模型的研究结果可以
推测实际的生殖生理过程.当然,由于是体外实
验,对结果的分析仍须十分谨慎.在以往的研究
中,输卵管单细胞层培养,组织培养和细胞悬液
都已用作共培养研究.我们认为,单细胞层培养
比其他方法具有方法简单,细胞可低温保存,减
少其他类型细胞影响等优点.因此,本实验采用
了输卵管单细胞层共培养研究人输卵管细胞对
精子存活的影响.
输卵管有可能通过两种机制影响精子存
活:细胞间粘附和细胞分泌.扫描电镜研究显
示,精子通过顶体周围的细胞膜粘附于输卵管
细胞u.这种粘附由糖基,岩藻糖及精子质膜
的一些成分调节[1.动物实验表明,动物精子
可以在输卵管内存活12,26h,精子通过与输
卵管上皮的粘附来延长存活时间.观察发现,在
输卵管腔内有2,22的精子存活,与输卵
管内膜表面粘附的精子有16,37存活,粘
附于输卵管内膜皱襞里的精子有51%,69%
存活.还有研究显示,分离出来的动物输卵管细
胞膜可以延长精子存活达48h.但精子与
兔肾脏细胞膜共培养12h后,精子存活明显下
降].这意味着膜接触在维持精子存活上的重
要性,而输卵管细胞膜的这种作用似乎是有细
胞类型特异性的.在人类,Bongso等[1.报道,
精子疏松地附着于体外培养的输卵管细胞.
Pacey等u则观察到人精子粘附于人输卵管培
养组织.
除精子粘附外,输卵管细胞通过分泌输卵
管素(oviductin)作用于精子,延长精子存活时
间,这一作用呈剂量依赖性.Oviductin是输
卵管上皮细胞合成和分泌的一种输卵管特异性
的高度糖酰化的高分子量糖蛋白到.已在仓
鼠,小鼠,大鼠,兔,羊,猪,牛,狒狒及人输卵管
内发现了这种蛋白质的存在[2,曾被命名为雌
激素依赖性糖蛋白,雌激素相关糖蛋白或输卵
管特异性糖蛋白等.为简化命名,目前统称为输
卵管素.从cDNA估计输卵管素核心蛋白的
分子量约60,70×10.(kD).近年的研究发
现,输卵管素影响精子的获能,运动,顶体反应,
透明带附着及体外受精等.
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