附件1:人感染猪链球菌病样品采集与实验室检测
附件1 人感染猪链球菌病样品采集与实验室检测
一、样品采集
1(采样器材
?无菌封闭性好的试管~最好使用负压采血管或带螺口盖的塑料管~避免使用玻璃试管。
?可以清楚标记且标记不易脱落的记号笔。
?可以方便采集组织标本的无菌容器。
?无菌的剪刀、镊子和手术刀。
?血平皿和增菌培养瓶。
?乳胶手套、隔离服、防护口罩等。
?带有冰袋或者冰排的安全可靠的保温运输容器。
?采样送检单。
2(样品种类
?现症病人非抗凝全血
?现症病人抗凝血
?脑脊液标本
?尸体解剖应无菌采集淋巴结、脾、肝、心腔血、胸,腹,水
?如有病死猪也可进行解剖~取淋巴结、脾、肝、心腔血、肉
3(血液和脑脊液标本采集方法
?无菌抽取血液10ml分置于有抗凝剂和无抗凝剂的无菌试管或者负压采血管中
按常规方法腰穿采集3,5ml脑脊液标本置于无菌试管中。 ?
?采集的标本立即接种血平皿和/或增菌培养瓶~置于35,37?培养。
4(样品运输保存
?所有的原始标本在转运过程中应置于安全密闭的容器中。
?标本应冷藏运输。
?用于检测的标本可在4~8?冰箱暂放。
?剩余标本应放置于-70?保存。
5(注意事项
?严格无菌操作~防止标本污染。
?用于分离培养的标本应在抗菌治疗前采集。
?应尽可能床边接种血平皿和增菌培养瓶。如无法床边接种~样品应尽快送实验室~并立即检测。
?在标本采集过程中~注意安全防护。使用乳胶手套、隔离服、防护口罩。采取预防
~防止针头等锐器刺伤。
二、实验室检测
1(推片镜检
抗凝血或脑脊液可推片进行革兰氏染色镜检。阳性标本可见中性粒细胞内吞噬颗粒~细胞外偶尔可见革兰氏阳性链球菌。
2(猪链球菌分离鉴定
?血平板接种
血液或脑脊液等标本可直接接种于新鲜羊血琼脂平板,如无血平板可用含8 %胎牛血清的营养琼脂平板代替,。组织标本可直接涂抹平板或剪碎用无菌生理盐水洗涤~洗液接种平板。平板置37?5% CO培养箱或者烛缸中培养24,722
小时。也可在37?普通培养箱中培养。
?增菌培养
无菌部位采集标本置脑心肉汤或含8%新生牛血清葡萄糖肉汤或商品化血培养瓶中~37?增菌培养24小时,1周~逐日观察~接种新鲜羊血琼脂平板~置37?5% CO培养箱或者烛缸中培养24,72小时。对污染标本接种选择增菌培养2
液,含15微克/毫升多粘菌素B~30微克/毫升萘啶酮酸的脑心培养基,增菌约15小时后接种血平板~或直接划线接种含两种抗生素的羊血琼脂平板培养基~在蜡烛缸或CO2培养箱中培养24,72小时。
?形态学鉴定
猪链球菌在血平板上呈直径l,2毫米的细小菌落~灰白色~半透明~边缘整齐~凸起~光滑~α溶血,偶尔也有弱β溶血或α溶血、β溶血现象均不明显,。
挑取平板上可疑菌落革兰氏染色镜检。猪链球菌无芽胞~刚分离的猪链球菌为典型的革兰氏阳性链球菌~链长达二十多个~多次传代培养后细菌形态不典型~结晶紫着色不良~多为短链或不成链的球杆菌。
?筛检生化试验
猪链球菌触酶试验阴性~可与葡萄球菌区别。
?血清学检测
用
分型诊断血清~进行乳胶凝集试验或玻片凝集试验。确定所分离的菌株为R群~与2型猪链球菌分型血清反应。
目前国内无血清供应。据报道,加拿大和澳大利亚有商品化血清分型试剂。
?生化鉴定
在血平板上挑选可疑菌落进行革兰氏染色和触酶试验~如符合链球菌特征~接种血平板纯培养后进行生化鉴定。
梅里埃API 20 strep等生化鉴定系统可鉴定2型猪链球菌。
?PCR检测
采用PCR技术可以检测猪链球菌种特异性基因16S rDNA、猪链球菌2型和1/2型特异的荚膜多糖基因(cps2j)、毒力因子溶菌酶释放蛋白基因(mrp)和细胞外蛋白因子基因(ef)~有条件的实验室可以采用。
猪链球菌种特异性基因16S rDNA检测可以鉴定猪链球菌,猪链球菌特异的荚膜多糖基因(cps2j)检测可以鉴定猪链球菌2型和1/2型,毒力因子溶菌酶释放蛋白基因,mrp,和细胞外蛋白因子基因,ef,检测可以鉴定高致病性的猪链球菌。