健康教育教案小学全册

用微卫星标记技术对国内BALB/c小鼠遗传质量的分析陈振文1欧阳兆和2王承利3李瑞生21.首都医科大学实验动物科学部北京1000542.军事医学科学院实验动物中心北京1000713.沈阳军区总医院动物实验科沈阳110015摘要为了解和掌握国内BALB/c小鼠遗传质量状况验证微卫星标记技术在近交系小鼠遗传检测中应用的可靠性本实验应用所筛选的小鼠不同染色体上的14个微卫星位点通过PCR扩增对北京上海沈阳广州长春重庆和哈尔滨7个地区11个厂家提供的BALB/c小鼠进行遗传质量分析结果北京上海哈尔滨及广州地区7家BALB/c小鼠在14个位点均呈现一条清晰条带且群体间呈单态性沈阳广州长春和重庆4个群体有8个位点在群体内表现杂合或呈多态性其中沈阳和长春分别在1个位点上表现多态性和杂合广州另一群体有4个位点出现杂合或多态性重庆群体有7个位点表现为杂合或多态性在D10Mit180位点与上海群体比较呈现多态性关键词BALB/c小鼠微卫星标记遗传质量检测AnalyzingGeneticQualityofBALB/cmousestrainsinChinabyMicrosatelliteMarkingChenZhen-wen1,OuyangZhao-he2,WangCheng-li3(1.DepartmentofLaboratoryAnimalScience,CapitalUniversityofMedicalSciences,Beijing100054,China2.LaboratoryAnimalCenter,AcademyofMilitaryMedicalSciencesBeijing100071,China3.LaboratoryAnimalCenter,ShenyangMilitaryGeneralHospital,Shenyang,110015)AbstractElevenBALB/cmousestrainsofBeijing,Shanghai,Shenyang,Haerbin,Guangzhou,ChongqingandChangchunweremonitoredinordertoassurethegeneticqualityofinbredBALB/cmousestrainsinChinaandestimatethecredibilityofmicrosatllitemarking.14microsatelliteslociondifferentchromosomeswereinvestigatedbyPCRanalysis.ItshowedthatallthesemicrosatellitesDNAlocidisplaysingleallelicgenebandinmousestrainsofBeijing,ShanghaiandHaerbin.ButthemicecamefromShenyang,Guangzhou,ChongqingandChangchundisplaypolymorphismsorheterozygosis,amongwhichtheShenyangandChangchunstrainsdisplaypolymorphismsandheterozygosisattwoseparateloci.FourlocidisplaypolymorphismsorheterozygosisinoneoftheGuangzhoumousestrains.TheChongqingstrainsdisplaypolymorphismsandheterozygosisatsevenloci,whichdisplaypolymorphismsandheterozygosisattheD10Mit180locuscomparedwiththeShanghaistrains.Keywords:BALB/cmouse;MicrosatelliteMarking;Geneticmonitoring近交系动物是严格按近亲交配方式培育出的动物理论上其基因纯度可达99.8%个体间的差异几乎为零因而广泛地应用于生物学医学药学等研究和生产领域BALBc小鼠自1923年开始近交培育到目前为止近交代数已超过200代世界各国均有生产和应用是生物医学研究中应用最为广泛的近交系之一我国于1979年从美国引进该品系经20多年的饲养繁殖已形成一定规模在国内已形成几十个群体对其群体内和群体间实施遗传分析不仅可了解和掌握我国BALBc小鼠的遗传一致性和变异情况而且通过比较分析将阐明不同BALBc小鼠群体实验的可比性和重复性并为我国实验动物的保种和引种措施的建立和完善提供依据本实验应用本实验室筛选的14个微卫星位点和建立的微卫星标记Microsatellitemarking遗传检测方法对国内7个地区11个有代表性的BALBc小鼠群体进行检测旨在了解国内BALBc小鼠的遗传状况同时近一步验证已建立的微卫星标记遗传检测方法的可靠性为该技术的应用奠定基础1与方法1.1材料1.1.1实验动物由北京4家以下简称京1京2京3京4上海沈阳广州2家以下分别简称穗1穗2长春重庆和哈尔滨7个地区11家BALBc小鼠生产厂家提供每个群体随机抽取动物6只雌雄各半年龄体重及等级不限所有动物均具有当地动管会颁发的实验动物遗传质量合格证动物脱颈致死取脑组织冰冻备用1.1.2引物合成在不同染色体上筛选的14个微卫星位点为D1Mit365D2Mit30D3Mit51D4Mit235[作者简介]陈振文男1959研究员专业方向实验动物遗传学D5Mit48D6Mit102D7Mit281D9Mit23D10Mit180D11Mit128D12Mit147D14Mit102D15Mit5D17Mit36位点引物序列均来自MouseGenomeDatabase[1]由上海博亚生物技术有限公司合成1.2方法1.2.1小鼠基因组DNA的提取取小鼠脑组织约0.1g,用酚/氯仿法[2]提取DNA经紫外分光光度计测A260/A280值稀释为100ng/�l作为DNA模板4�保存备用1.2.2PCR扩增每个PCR反应体系为50�l其中10×buffer5ul上游引物下游引物各0.2mol/L4×dNTP200mol/LTaq酶1.25UMgCl21.55.0mmol/l模板DNA100ng反应条件于94�预变性3min94�变性30s5065�复性30s72�延伸1min循环30次扩增最后一个循环后置72�继续延伸7min扩增产物4�保存1.2.3电泳和银染检测取PCR产物10�l在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳硝酸银染色[3]1.2.4结果判读根据聚丙烯酰胺凝胶上DNA泳动距离或用凝胶成像分析仪并结合软件ImageMasterTotalLabVersion1.11进行结果判读在同一生产群内的6只动物如果电泳表现为一条带且泳动距离一致则所检动物在该位点是纯合的并与MGD(MouseGenomeDatabase)中所规定的等位基因片断allelefragment大小相一致则在该位点未发生遗传变异若发生以下三种情况则表明已发生遗传变异1电泳虽只表现为一条带但彼此间泳动距离不相一致2在排除影子带后仍表现两条带3电泳虽只表现为一条带且彼此间泳动距离一致但与MGD中所规定的等位基因片断大小不相符出现上述三种情况的小鼠均经两次以上重复试验以排除假阳性结果2结果14对引物对每个群体的6只小鼠均能有效稳定地扩增京1京2京3京4上海哈尔滨及穗2群体内6只BALBc小鼠在同一位点均呈现一条泳动距离相同的电泳带并与MGD中所规定的等位基因片段大小相符表明所检动物在14个所选位点不仅纯合而且呈单态性即所检位点没有发生遗传变异见图1123456M图1北京地区BALBc小鼠在微卫星位点D5Mit48的扩增结果1-6北京地区BALBc小鼠Mmarker25bpDNAstepladderFig.1PCRamplificationproductsinsixBeijingBALB/cmiceattheD5Mit48locus.Lanes1-6:sixBeijingBALB/cmiceMMolecularmarker25bpDNAstepladder其他群体则出现了位点的杂合和多态性其中长春BALBc小鼠群的34号动物在D2Mit30位点出现杂合见图2沈阳群体中的5号BALBc小鼠在D15Mit5位点的电泳图带与其它动物及MGD中所规定的等位基因片段大小不相符表现多态性穗1的4号鼠在D2Mit30和D10Mit180位点上出现杂合见图3在D6Mit102位点出现多态性见图46号鼠在D5Mit48位点出现多态性来自重庆地区的群体经与上海群体和MGD中所规定的等位基因片段大小比较发现6只动物在7个位点上存在问题其中D1Mit365位点1号鼠表现多态性D2Mit30位点3号鼠表现多态性4-5号鼠出现杂合D3Mit51位点1号鼠表现多态性D5Mit48位点1号鼠表现多态性235号鼠出现杂合D6Mit102位点256号鼠出现杂合见图5D7Mit281位点4号鼠表现多态性D10Mit180位点14号鼠出现杂合6只BALBc小鼠在该位点与上海的群体及MGD中所规定的等位基因片段大小比较均不一致表现为多态性见图6M123456图2长春BALB/c小鼠在微卫星位点D2Mit30的扩增结果1-6长春地区BALBc小鼠Mmarker25bpDNAstepladderFig.2PCRamplificationproductsinsixChangchunBALB/cmiceattheD2Mit30locus.Lanes1-6:sixChangchunBALB/cmiceMMolecularmarker25bpDNAstepladder123M456789图3穗1和上海BALB/c小鼠在微卫星位点D10Mit180的扩增结果1-3上海BALBc小鼠4-9穗1BALBc小鼠Mmarker25bpDNAstepladderFig.3PCRamplificationproductsattheD2Mit30locusofHui(1)andShanghaiBALB/cmiceLanes1-3:ShanghaiBALB/cmiceLanes4-9:Hui(1)BALB/cmiceMMolecularmarker25bpDNAstepladder123456M图4穗1地区BALB/c小鼠在微卫星位点D6Mit102的扩增结果1-6穗1地区BALBc小鼠Mmarker25bpDNAstepladder.Fig.4PCRamplificationproductsinsixHui(1)BALB/cmiceattheD6Mit102locus.Lanes1-6:sixHui(1)BALB/cmiceMMolecularmarker25bpDNAstepladderM123456图5重庆地区BALB/c小鼠在微卫星位点D6Mit102的扩增结果1-6重庆地区BALBc小鼠Mmarker25bpDNAstepladder.Fig.5PCRamplificationproductsinsixChongqingBALB/cmiceattheD6Mit102locus.Lanes1-6:sixChongqingBALB/cmiceMMolecularmarker25bpDNAstepladder12M345678图6重庆地区BALB/c小鼠及上海BALB/c小鼠在微卫星位点D10Mit180的扩增结果1-2上海地区BALB/c小鼠3-8重庆地区BALB/c小鼠Mmarker25bpDNAstepladderFig.6PCRamplificationproductsinChongqingandShanghaiBALB/cmiceattheD10Mit180locus.lanes1-2:ShanghaiBALB/cmice;Lanes3-8:ChongqingBALB/cmice;M:Molecularmarker25bpDNAstepladder3讨论3.1微卫星标记在近交系动物遗传监测中的应用微卫星又称STRshorttandemrepeat广泛存在于原核真核生物基因组中核心序列为26bp的串联重复序列重复次数从几次到数十次从而形成了微卫星的高度多态性利用微卫星侧翼序列设计引物进行PCR扩增,由于重复次数不同形成片段长度不同,经电泳分离银染后就可表现不同的电泳带型从而判断是否发生遗传污染或遗传变异在同一品系内如果电泳表现为一条带,且泳动距离一致则所检动物在该位点上是纯合的表明没有发生遗传污染或遗传变异如果电泳呈现二条带应注意排除影子带[4]或泳动距离不一致即出现多态性,表明位点是杂合或发生了遗传变异近交系动物是基因高度纯合的动物群体其等位基因纯合度理论上可达99.8%可以看作是基因型完全相同的群体用一定数量的引物对微卫星进行扩增如均表现为一条图带则表明基因位点的纯合符合近交系要求反之发生了遗传污染或遗传变异因此应用微卫星标记方法不但可以进行纯合位点的判定而且能对基因位点的变异情况进行分析适于近交系动物的遗传检测[5]微卫星DNA不但具有高度的多态性而且有丰富的可供个体识别标志的微卫星位点小鼠基因图谱已包含了7377个微卫星DNA其中有6580个显示多态性[6]能够更全面地反映基因组的遗传及变异情况[7]本实验所选用的14对引物和实验方法是本实验室经大量试验和反复筛选出的其对我国常用近交系小鼠均具有有效稳定的扩增效果能有效地区分不同品系及亚系对动物的亲缘关系的判定突变系的鉴别也得出了肯定结果[8]本实验通过对国内11个BALBc小鼠群体进行检测结果进一步验证了该14对引物和实验方法可行性和精确性3.2关于国内BALBc小鼠的遗传质量分析本实验所选取的BALB/c小鼠分别来自国内实验动物事业较为发达地区群体均来源于当地较大实验动物生产厂家这11个群体基本上反映了目前我国BALB/c小鼠的遗传质量状况有一定的代表性实验应用微卫星标记技术对每个群体内群体间进行了比较并与MGD中每个位点在BALB/c小鼠中所表述的等位基因片段大小进行对比结果北京的4个群体上海哈尔滨及广州的一个群体在14个微卫星位点上无论是群体内还是群体间均表现为单态性并与MGD中所规定的等位基因片段大小相符这7个群体动物在所检位点是纯合一致的没有发生遗传变异后经进一步了解发现这几个群体都具有较为规范的繁殖方式和严格的生产管理大多具有基础群或血缘扩大群以提供种子哈尔滨群体虽然较小但该群体是从北京某种群引种不足1年的群体因而变异的可能性极小另外4个BALB/c群体或多或少地存在遗传质量问题尤为严重的是重庆群体6只动物在7个位点上存在差异,经与上海群体比较同时参照MGD中规定的等位基因片段大小对比6只动物均呈多态性说明该群体可能受到了严重的遗传污染经调查发现这4个群体均系饲养时间较长的群体大多没设立提供种子动物的基础群或血缘扩大群饲养管理及繁殖方式也存在一定漏洞有的可能已形成了亚系在调查中发现国内大部分生产厂家对自己饲养的BALB/c小鼠的遗传背景并不十分明确只知道是BALB/c而BALB/c有多个亚系如BALB/ccdBALB/cJBALB/cAnN等[9]该群体属于哪个亚系就不清楚了本实验中个别群体的多态性是否是某亚系所特有就不得而知从中也反映了我国目前实验动物种子管理保种和引种存在一定问题各地的实验动物质量检测水平也不平衡需建立科学的管理体系关于本实验所应用的14对引物是否能正确地反映近交系的遗传质量还需进一步验证本实验所阐明的变异群体和正常群体间的差异将在以后的工作中开展研究参考文献[1]MouseGenomeDatabase(MGD),MouseGenomeInformaticsProject[W],TheJaksonLaboratory,BarHarbor,ME.WorldWideWeb(URL:http//www.informatics.jax.org).[2]胡兰,陈松,季安全,等.法医物证检验技术及应用[M].北京:人民法院出版社,1997,357.[3]BrantJ.Bassam,GustavoCaetano-Anollés,etal.FastandsensitivesilverstainingofDNAinpolyacrylamidegels[J].Analyticalbiochemistry,1991,196:80-83.[4]RoxanneY.Walder,MICHAELR,etal.Shottandemrepeatpolymorphicmarkersfortheratgenomefrommarker-selectedlibraries.MammalianGenome,1998,9:1013-1021.[5]F.Benavides,E.Glasscock,etal.PCR-basedmicrosatelliteanalysisfordifferenttiationandgeneticmonitoringofnineinbredSENCARmousestrains[J].LaboratoryAmimals,2001,35:157-162.[6]LeonardC.Schalkwyk,MsrtinJung,etal.Panelofmicrosatellitemarkersforwhole-genomescansandradiationhybridmappingandamousefamilytree[J].GenomeResearch,1999,9:878-887.[7]TautzD.HypervariabilityofsimplesequencesasageneralsourceforpolymorphicDNAmarkers[J].NucleicAcidsRes,1989,17(16):64636467.[8]欧阳兆和陈振文等.微卫星DNA多态性分析在常用近交系小鼠遗传监测中的应用[J].中国实验动物学报2004,待发表.[9]施新猷.医用实验动物学[M].西安陕西科学技术出版社1989,98.