【word】 未成熟树突状细胞对T细胞活化及其IFN叫和IL-12
达的影响
未成熟树突状细胞对T细胞活化及其IFN
叫和IL-12表达的影响
事罗清等未成熟树突状细胞对T细胞活化及其IFN一和IL.12表达的影响第3期
doi:10.3969/j.issn.1000—484X.2011.03.004
未成熟树突状细胞对T细胞活化及其IFN叫和IL.12表达的影响?
李罗清孙圣刚?曹学兵?王云甫?(湖南省岳阳市一人民医院神经内科,岳阳414000)
中国图
分类号R392.1文献标识码A文章编号l000-484X(2o11)03.0209-04
[摘要]目的:探讨未成熟树突状细胞(DC)对T细胞活化及其IFN一和IL-12表达的影响.方法:通过诱导Lewis大鼠
骨髓前体细胞,获取未成熟(iDC)和成熟(mDC)两种状态的DC;将两种DC用乙酰胆碱受体(AChR)负载后进行T细胞重复刺
激,交叉刺激和无关抗原刺激试验,观察T细胞增殖情况并测定T细胞IFN一,IL-12的表达水平.结果:(1)AChR负载的iDC可
明显抑制T细胞增殖,且这种被抑制的T细胞对AChR负载的mDC的交叉刺激也不引起增殖,但对无关抗原OVA负载的mDC
的刺激可产生明增殖.(2)与mDC组比较,AChR负载的iDC初次和重复刺激均明显抑制T细胞IFN一和IL-12的表达.结
论:iDC可诱导抗原特异性T细胞耐受,耐受机制可能与Thl细胞因
子IFN一和Il厂l2的抑制有关.
[关键词]树突状细胞;T细胞;免疫耐受;细胞因子
Effect0fimmaturedendriticcellsontheactivationofTcellsandtheexpression0f
?1N.YandIL.12byTcells
LILuo—Qing,SUNSheng
一,CAOXue—Bing,WANGYun—Fu.DepartmentofNeurology,YueyangFi
rstPeopleHospi—
tal,Yueyang414000,China
[Abstract]Objecfive:Toinvestigatetheeffectofimmaturedendriticcells(DCs)ontheactivationofTcellsandtheexpressionofIFN一
andIL-12byTcells.Methods:IrmnatureandmatureDCs(iDCsandmDCs)wereinducedf南mratbonemarrowprecursoreeHs.Afterpulsed
withacetylcholinereceptor(AChR).DCswereusedt()stimulateTceHsbyanystimulationsofrepetitive,crossorindependentwithantigen0一
valbumin.FheproliferationofTcellsandtheexpressionofIFN一了
and1L-12byTcellsweremeasured.Results:(1)TheAChRpulsediDCsin—
hibitedtheproliferationofTcells.Their~hibitedT(„ellsdidn?tpropagatewhenrestimulatedbyAChRpulsedmDCsbutpropagateintensively
whenrestimulatedbyovalbuminpulsedmDCs.(2)ComparedwiththeresponsesofmDCs,theexpressionsofIFN一andIL-12byTceHsstimu—
latedwithAChR—pulsediDCswereinhibited.Conclusion:iDCscouldindu
cetheantigen—specifictoleranceofTcells,whichisrelatedtothein—
hibiti()nofThlproductionofIFN一7andIL-12.
[Keywords]Dendriticcells;Tcells;Inmmnetolerance;Cytokine
树突状细胞(Dendriticcell,DC)既可启动免疫应
答,也可诱导中枢和外周耐受.DC提呈抗原最终表
现为免疫激活还是免疫耐受的决定因素目前尚不十
分清楚.一种观点认为,机体内存在不同的DC亚
群,它们分别负责不同的功能?J.但近来研究表明,
DC亚群的功能并非一成不变,如从人的前体细胞分
化而来的DC,对不同的活化刺激物表现出不同的反
应l2J.因此,这种一类细胞对应一类免疫反应的观
念受到了挑战,并提出了另外一种观点:DC的不同
成熟状态有着不同的功能_lJ.本研究旨在探讨未成
?本文为湖北省自然科学基金项目(No.2006ABA344)和湖北省教育
厅科学研究项口(No.2004Z001)
?华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科,武汉430022
?郧阳医学院附属太和医院神经内科,十堰442000
作者简介:李罗清(1972年一),男,博士,副主任I篡师,硕七生导师,主要
从事神经免疫的基础与临床研究,E-Il1:l?x1s@163.CO/ll.
熟DC对T细胞活化,分化及功能的影响.
1材料与方法
1.1主要试剂与动物RPMI1640培养基,胎牛血
清,逆转录试剂盒,TRIZOL为美国Gibco公司产品.
PCRMarker(DL一2000)购自大连宝生物公司.细胞因
子:rrlL一2,n-IL一4,rrGM—CSF均为Sigma公司产品.大
鼠IFN一了ELISA检测试剂盒为R&D公司产品.乙酰
胆碱受体(AChR)由本实验室提取.健康lewis大
鼠,购自北京维通利华实验动物技术有限公司.
1.2DC的体外诱导,抗原负载及灭活按本实验
室已有方法培养Lewis大鼠DC_3J.收集疏松粘附于
培养板底的DC,第6天加入LPs的同时,未成熟组
和成熟组分别加入50/~g/ml的AChR或50lzg/ml的
OVA,置37?,5%的c孵箱中,用完全培养基继
续培养18小时即得AChR负载的iDC(AChR+iDC),
AChR负载的mDC(AChR+mDC)和OVA负载的
mDC(OVA+mDC).充分洗涤后重悬于RPMII640
完全培养基,加入终浓度为25g/Inl的丝裂霉素C,
于37~C孵育30分钟灭活后,以RPMI1640培养液洗
涤3次,调整细胞浓度为4×lO5ml作为刺激细胞.
1.3混合淋巴细胞反应
1.3.1AChR负载的DC重复刺激T细胞尼龙毛
柱法分离Lewis大鼠脾脏T细胞.取24孔培养板,
每孔分别加入106T细胞,再加入105AChR负载的
iDC或mDC刺激,用完全培养基调整终体积为1ml.
置37oC,5%的C0?孵箱中培养.每组设4个复孔,
每个刺激循环后行细胞计数.第6天加入终浓度为
100u/ml的Ib2扩增T细胞.2周后,同前条件加
入It?AChR负载的iDC或mDC再次刺激.再次刺
激后第3天加入终浓度为100U/ml的IL一2扩增T
细胞.再次刺激l周后,同条件加入1o5AChR负载
的IDC或mDC行第3次刺激.第3次刺激后第3天
加人终浓度为100U/ml的IL-2扩增T细胞.
1.3.2淋巴细胞增殖测定取96孑L培养板,每孑L
分别加入2×lO5AChR负载的DC重复刺激前的T
细胞作反应细胞(NT);再分别加2×lo4,1×lO4,5×
lO3AChR负载的iDC或mDC作刺激细胞,终体积为
200td;每浓度设3个复孑L.37%,5%CO2孵箱中培
养.4天后每孔加人5mg/r~的MrITI12Ol,继续培
养4小时.离心弃上清,每孑L加入DMSO100l,测
各孔490肿波长的光密度值(A490),结果以3孔均
值表示.同前方法,反应细胞改为AChR负载的iDC
或mDC重复刺激3次后的T细胞(iDC.3T或mDC一
3T),测定其对AChR负载的iDC或mDC的增殖活
性.同前方法,刺激细胞改为OVA负载的mDC,测
定AChR负载的iDC或mDC重复刺激3次后的T细
胞对OVA负载的mDC刺激的增殖活性.
1.4上清液中IFN.7水平的测定取AChR负载的
iDC或mDC初次刺激前后和重复刺激3次后的各组
细胞培养上清液,用0.45/zm的滤膜除去杂质后,采
用酶联免疫吸附试验(EHSA)检测IFN一7浓度.
1.5RT-PCR测定T细胞I~12p35mRNA的表达
收集AChR负载的iDC或mDC初次刺激前和重复刺
激3次后的各组T细胞,用TRIZOL试剂提取细胞总
RNA.在逆转录酶M—MLV的作用下,将mRNA逆转
录成cDNA分子.然后通过PCR扩增IL-12p35和
参照/3-aetin的eDNA.IL-12p35的上游引物为:5C—
GCTACCTCCTCTYC1_I?3,下游引物为:5GC1]rrCTG-
GTGCAGAGTC3,扩增产物长度为500bp.l3一actin
的上游引物为:5AGCAGAGAATGGAAAGTCAAA3.
中国免疫学杂志2011年第27卷
下游引物为:5ATGCTGCTFACATGTCTCGAT3,扩增
产物长度为266bp.PCR总反应体积501.反应条
件为:94qC预变性5分钟,94?变性30秒,48?(B—
actin为54c【=)退火30秒,72cc延伸45秒,共进行32
个循环,72?加强延伸7分钟.将lO扩增产物于
琼脂糖凝胶电泳,紫外透射仪下观察并摄像.
1.6统计分析数据以?s表示,多个实验组间
比较采用单因素方差分析one—wayANOvN),两两比
较采用最小显着差(ISD)法.两组之间的比较采用
t检验.以=0.05为检验显着性水准.
2结果
2.1淋巴细胞增殖测定
2.1.1重复刺激AChR+mDC初次和重复刺激均
能诱导强烈的T细胞增殖,3个刺激循环后T细胞
扩增了50,80倍.而AChR十iDC初次和重复刺激
均只引起微弱的T细胞增殖(结果见表1,2).
2.1.2交叉刺激和无关抗原刺激AChR+mDC重
复刺激3个循环后的T细胞对AChR+iDC的刺激
引起较弱的增殖反应,而AChR+iDC重复刺激3个
循环后的T细胞对AChR+mDC的刺激不引起增
殖.AChR+mDC和AChR+iDC重复刺激3个循环
后的T细胞均能对无关抗原OVA负载的mDC的刺
激产生明显增殖,前者增殖反应更强(结果见表3).
2.2上清液IFN.水平的测定AChR+mDC初次
和第3次重复刺激后,其上清液中IFN.7的含量较
刺激前均明显增高.而AChR+iDC初次和第3次
重复刺激后,IFN一丫的含量与刺激前比较均无明显
差异,并显着低于AChR+mDC组(结果见表4).
2.3IL-12p35mRNA的表达5组T细胞~-actin
mRNA表达恒定,无明显差异,表明该实验方法可
靠,结果具有可比性.AChR+mDC初次和第3次重
复刺激后,IL-12p35mRNA的表达水平均明显上调.
而AChR+iDC初次和第3次重复刺激后,IL-12p35
mRNA的表达与刺激前比较均无明显差异,并显着
低于AChR+mDC组(结果见图1).
表1重复刺激过程中T细胞增殖(×119mlI1)
Tab.1ProliferationofTcellswhenstimulatedrepeaU~yby
DCs(×lO6ml一)
Note:ComparedwithAChR+mDCgroup,1)Jp<O.05,2)P<0.01
澶笠盛塾挝突状绁胞对T咀也活化及其IFN.7和lL.12表达的影响
第3
表2A0IR负载的mDc和iDc初次和重复刺激T细胞增殖的能力
Tab.21r|IecapabilityofAChRpulsedDCsstimulatingTcellsthefirstorrepetit
ive
Note:ComparedwithAChR+niDC:NTgroup,1)尸
<0.01;Compared,MthAChR十rrd)C:mDC一
3—1group,2)P<0.Ol;ComparedwithAChR+iDC:NTgroup
3)P<005
表3重复刺激3循环后的T细胞对交叉刺激和无关抗原刺激的增殖
能力
Tab.3ProliferationofTcellsstimulatedbyDCsfor3cycleswhenrestinmlatedcrosslyorbyindependentantigen
Note:Compa~twithAChR+nd)C:iDC一
3Tgroup,1)P(0.05;ComparedwithOVA+mDC:m1)C一
3Tgroup.2),<O.05;Compm?edwithAChR+iDC:mDC一3T
group,3)P<0.Ol
表4重复刺激过程中上清液中IFN吖的含量(pg/m1)
Tab?4ThecontentofIFN-7insupernatantwhenstimulatedrepeatedlybyDCs(pg/n~)
图1T细胞IL-12p35mRNA的表达
Fig.1ExpressionsofIL-12p35mRNAbyTcells
Note;A.BeforestimulatedbyDC;BAfterthefitststimulatedbyAChR+
iDC;C.Afterthethirdstimulat{xlbyAChR+iDC:D.Anerthefirst
stimulatedbyAChR+m1)C;E.AfterthethinlstimulatedbyAChR+
m1)C.
3讨论
DC既可以激活也可以耐受的方式提呈抗原,其
功能特征取决于其成熟状态和局部微环境.T细胞
的充分活化至少需要获得两个相关的刺激信号,一
是T细胞受体(TCR—CO3)介导的抗原特异性信号(第
一
信号),二是由B7一CD28等共刺激分子介导的抗原
非特异性信号(第二信号).缺少共刺激信号的抗原
提呈可导致克隆性T细胞无能,未成熟DC表面
MHC,共刺激分子及其它辅助分子的表达水平较低,
所以虽然它们具有很强的抗原摄取加工能力,但由
于缺少第一和/或第二信号的刺激而不能活化T细
胞,导致T细胞的无能或低反应性,从而诱导抗原特
异性耐受.未成熟DC可诱导T细胞无能并显着延
长移植物的存活时间l.抗原负载的未成熟DC可
诱导1型糖尿病耐受E.体外实验也发现,未成熟
Dc可诱导抗原特异性T细胞无能l.受者T细胞
与供者未成熟DC共同培养后,当再用供者免疫源性
DC刺激时,细胞因子的分泌明显减少且T细胞呈现
明显的低反应性E』.本研究中,AChR负载的mDC
初次和重复刺激均能诱导强烈的T细胞增殖,而
AChR负载的iDC仅在初次刺激时引起较弱的T细
胞增殖,重复刺激则明显抑制其增殖;当这些经
AChR负载的iDC重复刺激3个循环后的T细胞再
用AChR负载的mDC刺激时,也不能引起增殖;但当
用无关抗原OVA负载的mDC刺激时,则产生明显的
增殖反应.提示未成熟DC可引起T细胞无能,且这
{}瑚
种无能是抗原AChR特异性的.
免疫细胞间的相互作用是通过细胞因子介导
的.IFN.-/主要由活化的Thl型T细胞产生,可通过
上调淋巴细胞或诱导抗原提呈细胞MHC1/类分子的
表达来促进抗原提呈和特异性免疫识别,促进巨噬
细胞Fc受体的表达并激活巨噬细胞,参与B细胞免
疫应答.IL-12主要由活化的巨噬细胞,树突状细胞
和中性粒细胞产生,可通过促进IFN一的产生而诱导
CD4ThO细胞向Thl细胞分化,在Thl反应中处于
不可或缺的地位_8j.近来研究发现,免疫系统中可
能存在一个IL-12/IL-10免疫调节环路,控制着机体
对自身免疫性疾病的易感性j.在此环路中,IL一12
促进IFN一7产生,而IFN.7一方面通过上调B细胞共
刺激分子的表达促进体液免疫;另一方面通过上调
抗原提呈细胞MHCII的表达增强其向CD4T细胞
提呈抗原的能力,诱导Thl细胞分化.同时IL-12可
通过下调IL-10等Th2细胞因子而拮抗免疫抑制细
胞的功能.未成熟DC诱导的1型糖尿病耐受与T
细胞IFN.的表达下调有关_l.体外未成熟Dc诱
导的T细胞无能与其IL-2,IL一4,IL-12,IFN一7的表达
抑制有关J.我们发现,成熟Dc初次和重复刺激均
引起IFN.7和IL-12的表达显着增强,呈典型的Thl
细胞因子分泌模式;而未成熟DC初次和重复刺激
时,IFN一和IL-12p35的表达均无明显变化.由此我
们推测,未成熟DC诱导产生抗原特异性T细胞耐受
的机制,可能与Thl型细胞因子IFN一和IL—l2的抑
制有关.
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42l_429.
[收稿2010-09.O1修回2010-11-19]
(编辑张晓舟)
“第六届全国中医药免疫学术研讨会”征文通知
为了促进中医药免疫学理论的研究以及免疫学理论和技术在中医
药研究和临床中的应用,活跃学术气氛,经筹备,”第六
届全国中医药免疫学术研讨会”定于2011年9月16日在辽宁沈阳召开,并给予l类继续教育学分.
主要内容包括:免疫性疾病的中医药治疗;中药免疫药理及药效学研究;免疫学与中医药理论;免疫学技术的进展及在中
医药研究中的应用;中药多糖与免疫(专题).论着,综述,文摘不限.
截稿日期为2011年8月30号,提倡电子邮件投稿,亦接收纸质稿件.
通讯地址:广州市机场路l2号广州中医药大学免疫研究室
邮政编码:510405联系人:周联王青
电话:020.36585479传真:020—36585094
电子邮箱:immunology@gzhtcm.edu.cn或immunology@tom.con.
中国免疫学会中医药免疫分会
2011年3月