重组牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达和纯化

重组牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达和纯化 重组牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达和 纯化 第6卷第4期 2007年8月 江南大学(自然科学版) JournalofJiangnanUniversity(NaturalScienceEdition) VoIl6 Aug NO4 2007 文章编号:1671—7147《2007)04—0478—05 重组牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达和纯化 黄 (1.浙江大学材料 磊,阮红,徐志南,顾 与化学工程学院,浙江杭州310027;2.浙 玮彦,岑 江大学城市学 沛霖? 院,浙江杭州310015) 摘要:密码子优化全基因合成了牛肠激酶轻链基因(sBEKLC),采用 pET一39b(+)构建了融合表 达载体,在大肠杆菌中进行了成功表达.37?在含30mg/L卡那霉素 的LB培养基中培养,当细胞 密度(D600)达到0.5时,降低温度到28?,加入终浓度为0.1mM的异 丙基硫代口一D一硫代半乳 糖苷诱导外源蛋白表达,继续培养6h后收集菌体,融合蛋白 (DsbA—sBEKIC)产量达到151.2 mg/L,相当于80.6mg/LsBEKLC.使用渗透冲击技术从细胞周质中提 取sBEKLC,经过亲和层 析可从每升发酵液中得到6.8mgsBEKLC,经检测sBEKIC具有生物 活性. 关键词:肠激酶;融合表达;纯化;生物活性 中图分类号:Q819文献标识码:A ExpressionandPurificationofBovineEnterokinase LightChaininRecombinantEscherichiacoli HUANGLei,RUANHong,XUZhi—nan,GUWei—yan,CENPei—lin (1.CollegeofMaterialsScienceandChemicalEngineering,ZhejiangUniver sity,Hangzhou310027,China;2.City College.Zh~iangUniversity,Hangzhou310015,China;) Abstract:Acodonoptimizedsequencecodinglightchainofbovineenterokin asegene(sBEKLC) wassynthesized,anditwasfusedwithDsbAtoconstructtheexpressionvector(pET39一 sBEKLC).Then,theplasmidwastransformedintoE.coliBI21(DE3)forexpression.The strainwasculturedinLBmediumcontaining30t~g/mLkanamycinat37?. Whencelldensity (D600)reached0.5,IPTGwasaddedtoreachfinalconcentrationof0.1mM.Aftercontinued cultivationat28? for6hours,cellswereharvested,thevolumetricproductivityoffusion proteinreached151.2mg/I,i.e.80.6mg/IsBEKLC.Thecoldosmoticshocktechniquewas successfullyusedtoextractsBEKICfromperiplasmicspace,andnickelaffinitychromatography wasemployedtoobtainmaturesBEKIC.Finally,about6.8mgOfsBEKLCwaspurifiedfrom1 literfermentationbrothandtheenzymeactivityofsBEKICwaswelldetected. Keys:enterokinase;fusionexpression;purification;enzymeactivity 收稿日期:2006—04—19;修订日期:2006—06—28. 基金项目:国家自然科学基金项目(30370039). 作者简介:黄磊(1977一),男,浙江杭州人,生物化学工程专业博士研究 生. *通讯联系人:岑沛霖(1945一),男,浙江慈溪人,教授,博士生导师.主要 从事生物化工研究 Email:cenpl@zju.edu.cn 第4期黄磊等:重组牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达和纯化479 Enterokinase(EK)是哺乳动物肠道内的一种 丝氨酸蛋白水解酶,能够特异性地识别(Asp)一Lys 序列,起到把胰蛋白酶原转变成胰蛋白酶的作用. 迄今为止,EK已经分别从猪I】],牛_2和人L3等的肠 道组织中纯化得到.它由轻链和重链组成,两条链 通过一对二硫键相连.重链把轻链锚定到消化道的 细胞膜上,它对相对分子质量大的蛋白的识别起着 辅助作用,但对相对分子质量小的多肽的识别影响 较小,轻链则具有催化活性L4j.1993年牛肠激酶 轻链(BEKLC)的cDNA基因被克隆并表达L5],表现 出了良好的切割融合蛋白的活性.EK对(Asp)一 Iys序列表现出高度特异性,而且酶切反应条件较 为广泛,切出的目标产品首位氨基酸完全忠实于天 然蛋白,这使其在融合表达的下游纯化中有着巨大 的应用价值.目前市售的EK价格非常昂贵,从动物 肠道组织中提取的EK常含有其他蛋白酶的污染, 因此它的广泛应用还存在困难]. 生长迅速和具有完善的表达系统使大肠杆菌 成为基因工程领域应用最广泛的宿主菌.但不同物 种间基因密码子使用的偏爱性则是在重组表达外 源基因的障碍,稀有密码子的存在会降低外源蛋白 合成的数量和质量,甚至在基因翻译过程中引发问 题,这种影响在极端的实例中对于表达甚至是致命 的I7].所幸的是这个问题可以通过调整编码,去除 有害/稀有密码子的办法来消除I8]. 文中将牛肠激酶轻链基因进行密码子优化后 全序列合成(sBEKLC).通过pET一39b(+)表达质 粒,使sBEKLC和DsbA配体在大肠杆菌中融合表 达,并在sBEKIC的C末端添加了his标签.运用 渗透冲击技术提取由DsbA配体引导而分泌到细胞 周质的目标蛋白.经过亲和层析纯化,产品具有良 好的生物活性. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1质粒及菌株pOEM—T载体购自美国 Promega公司,pET一39b(+)为美国Navagen公司 产品.E.coliTG1,E.coliBL21(DE3)为本室 保存. 1.1.2培养基Iuria—Bertani(IB)培养基(质量 分数/):酵母膏0.5,蛋白胨1,NaCI1. 1.1.3试剂及用品限制性内切酶SpeI,PstI, XhoI和T4DNA连接酶购自大连TaKaRaBiotech 有限公司;pfuDNA聚合酶购自上海Sangon公司; DNA胶回收试剂盒(QIAquickGelExtractionKit) 购自德国Qiagen公司;所用引物自行设计,由上海 Sangon公司合成;Ni—NTAAgarose,购自德国 QIAGEN公司.人防御素一3融合蛋白(TrxA/ HBD3),用于酶活性的鉴定,由本实验室自制,该 融合蛋白中含有肠激酶的识别序列Asp—Asp—Asp— Asp,Lys一.其余试剂均为市售分析纯. 1.2方法 1.2.1全基因合成采用由重叠延伸组装 (SOEing—assembly)L8及PCR扩增(PCR Amplicfiation)两步所组成的全基因合成法(PCR— basedgeneSOEingsynthesis)合成经密码子优化的 基因.按优化好的基因序列,将全序列正负两条 DNA链分为2O部分,分别合成2O条寡核苷酸链 (见表1).重叠延伸组装步骤中将浓度为20M的 以上2O条寡核苷酸链等体积混合,取出】tH加O.5 LpfuDNApolymerase,1LdNTP?2I10× Buffer,15.5肚LddHO.置于PCR仪中按如下程 序进行SOEing—assembly:94?变性5rain,30次扩 增循环(94?×30S,52?×30S,72?×60S).72 ?延伸10rain.PCR扩增步骤中取第一步的产物1 L作为模版,5端引物(Oligomer1)0.5I,3端引 物(0ligomer20)0.5I进行PCR,条件与第一步相 同.用质量分数1的琼脂糖凝胶电泳检验结果.按 照DNA胶回收试剂盒#说明#回收产物. 1.2.2表达质粒的构建回收产物连接pGEM—T 载体构建成pOEM—sBEKIC重组质粒,委托上海 Sangon公司对插入序列进行全序列测定.pGEM— sBEKLC与pET一39b(+)质粒分别用SpeI+XhoI 于37?酶切2h,质量分数1琼脂糖凝胶电泳后, 前者纯化回收酶切产物小片段而后者回收大片段. 回收的两段片段连接后转化E.coliBI21(DE3)感 受态细胞,挑选重组克隆培养,提取质粒DNA,经 PstI单酶切鉴定正确重组克隆,命名为pET39一 sBEKLC.重组菌命名为BI21(DE3)/pET39一 sBEKLC. 1.2.3茵体培养及蛋白表达从新划的平板上挑 取单菌落于装有30mLLB(含Kanamycin30mg/ L)培养基的250mL摇瓶中,220r/min,37?,培养 至D600为0.4.将种子菌液按体积分数5的接种 量接入装有60mILB培养基的500mL摇瓶中,于 220r/min,37?培养至D600为0.5时,降低温度 到28?,加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导外源 蛋白表达,继续培养6h后收集菌体,结束发酵.收 集菌体,超声破碎,15SDS—PAGE分析. 480江南大学(自然科学版)第6卷 表1所用引物 引物序号引物结构(从5端到3端) TGGCCATACTAGTGGTACCGATGACGATGACAAGATTGTGGGCGGTTCTGAT TACAGAGCGACCACCCACGGCCATGCGCCTTCGCGGCTATCAGAACCGCCCACAAT GTGGGTGGTCGCTCTGTATTTCGATGACCAACAGGTTTGCGGCGCATCTCTGGTCAGTC GGCCGTACACACAATGTGCAGCGGACACCAGCCAATCGCGACTGACCAGAGATGCGC CACATTGTGTGTACGGCCGTAACATGGAACCATCCAAATGGAAAGCCGTACTGGGTC GTTTCGATTTGCGGAGAAGTCAGATTACTAGCCATATGCAGACCCAGTACGGCTTTCC TTCTCCGCAAATCGAAACCCGTCTGATTGATCAGATTGTGATT AACCCGCATT GGTGCATCATGGCAATATCATTGTTTTTACGGCGCTTGTTATAATGCGGGTTAATCACAA ATATTGCCATGATGCACCTGGAAATGAAGGTTAATTACACCGATTATATCCAGCCGA GACCAGGTGGGAAGACCTGGTTCTCTTCAGGCAAACAGATCGGCTGGATATAATCGG AGGTCTTCCCACCTGGTCGCATCTGCTCCATTGCAGGCTGGGGCGCCCTGATCTATCAGG CGTCTGCCTCCTGCAGTACGTCGGCGGTACTACCCTGATAGATCAGGGCGC TACTGCAGGAGGCAGACGTGCCGCTGTTGTCTAACGAGAAATGTCAGCAACAGATGCCG CGTAACCAGCACAGACCATATTTTCGGTAATATTATACTCCGGCATCTGTTGCTGACA TGGTCTGTGCTGGTTACGAAGCCGGCGGTGTCGATAGTTGCCAAGGCGACTC ACGATTGTTTTCTTGGCACATTAACGGACCGCCGGAGTCGCCTTGGCAACTA TGCCAAGAAAACAATCGTTGGTTGTTAGCCGGCGTTACCAGTTTTGGTTACCAATGCGC GGGCGTACACACCTGGACGGTTAGGTAAGGCGCATTGGTAAC CAAAA GTCCAGGTGTGTACGCCCGCGTTCCGCGCTTTACCGAATGGAT TCAGTCCT AAGCTTCTCGAGGTGCAGAAAGGACTGAATCCATTCGG 1.2.4渗透冲击提取目标蛋白超声破碎会对蛋 白的活性造成损害,也给蛋白分离纯化带来困难. 由于DsbA配体会引导产生的融合蛋白进入细胞周 质,可以使用渗透冲击的方法来获得目标蛋白,从 而避免超声破碎带来的负面影响.取4OmL发酵 液,5000g,10min离心收集菌体,重悬于10mL预 冷溶液A(20mMTris?HC1,1mMNa2EDTA, 20SucrosepH8.0),冰浴30min.5000g,10 min离心后再次重悬于4mL预冷溶液B(20mM Tris-HC1,1mMNa2EDTA,pH8.0),冰浴30 min.12000g,30min离心收集上清.考马氏亮兰法 测定蛋白含量. 1.2.5目标蛋白的纯化亲和层析在AKTA Purifier层析工作站(AmershamPharmacia Biotech)上进行,使用Ni—NTAAgarose (QIAGEN)作为填料.柱子用3,4倍柱体积的平 衡液(50mMTris?HC1,75mMImidazole,0.5M NaC1,pH8.O)平衡,1.0mL/min进样后用平衡液 冲柱,直至基线走平.柱上蛋白用洗脱液(50mM Tris?HC1,200mMImidazole,0.5MNaC1.pH 8.0)洗下,收集蛋白于溶液(50mMTris—HC1,50 mMNaC1,pH8.0)中透析过夜,用质量分数15 SDS-PAGE分析. 1.2.6目标蛋白活性分析以含有肠激酶酶切位 点的人防御素?3融合蛋白作为酶切底物与目标蛋 白进行酶切反应.反应条件为:50mMTris?HC1,2 mMCaC12,50mMNaC1,pH8.0,26?,16h.质 量分数18Tricine?SDS—PAGE分析酶切产物. 2结果与讨论 2.1基因合成 牛肠激酶轻链由235个氨基酸组成.在大肠杆 菌基因中,牛肠激酶轻链中的57个氨基酸所使用 的密码子频率小于12,尤其是其中的18个密码 子(AGG,AGA,CUA,AUA和CCC),已被证明 会对外源基因的表达产生副作用].抑制作用最强 的是精氨酸的两个密码子AGG和AGA,它们会对 外源基因的表达产生致命的影响:表达量严重下降 或容易在翻译中发生阅读框偏移口.为了消除由这 些稀有密码子带来的影响,有必要对外源基因的密 码子进行优化.参照大肠杆菌密码子的使用频率 表,对BEKLC的密码子进行优化设计,设计中对那 些低使用频率的密码子作相应的替换.该序列已经 提交至GenBank,其登录号(AccessionNo.)为: DQ265741,记作:sBEKLCgene.经过重叠延伸组 装及PCR扩增,sBEKLC被成功合成,其长度为 751bp.用质量分数1琼脂糖凝胶电泳的检验结 果见图1. 00n?”加 第4期黄磊等:重组牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达和纯化481 bp 2000 1000 800 500 1.DNA相对分f质量;2.sBEKLCgene 图1sBEKLC的合成 Fig.1SynthesisofsBEKLCgene 2.2表达质粒的构建和蛋白表达 表达质粒pET39一sBEKLC的酶切鉴定见图2, 结构图谱见图3.sBEKIC与DsbA配体融合表达, 融合蛋白由464个氨基酸组成,理论相对分子质量 为51.8ku.BEKLC的晶体结构图显示其蛋白的c 末端暴露于表面,而N末端则藏于内部.有研究表 明,N末端多余的氨基酸残基会影响蛋白酶活_1, 所以本实验在DsbA—sBEKLC融合蛋白中 sBEKLC的上游直接添加了EK的酶切位点,并为 有效分离和回收sBEKLC,在sBEKLC的C末端添加 了his标签. bp 1000 500 1.DNA相对分子质量标准;2.用PstI酶切质粒pET39一sBEKLC 图2表达载体酶切鉴定图 Fig.2Identificationofconstructedvector 图3表达载体的结构图谱 Fig.3Schematicrepresentationofexpressionvecotr 表达质粒pET39一sBEKLC转化E.coliBL21 (DE3),构建成重组菌BL21(DE3)/pET39一 sBEKIC.用LB培养基培养,IPTG诱导表达外源 蛋白.菌体收集并破碎后,将可溶及不可溶蛋白进 行SDS—PAGE分析(见图4).DsbA—sBEKLC产量 达到151.2rng/L,相当于80.6mg/LsBEKLC. .11 DabA—sBEKLC 1.蛋白相对分子质量标准;2,3.分别为未经诱导的司溶和不 可溶蛋白;4,5.分别为诱导后的可溶和不可溶蛋白 图4表达产物的SDS—PAGE分析 Fig.4SDS.PAGEanalysisofproteinsfromexpression vector 2.3渗透冲击提取sBEKLC 肠激酶轻链含有4个二硫键,研究表明,在细 胞质中表达的肠激酶由于胞内环境不利于蛋白的 有效折叠因而没有活性[5].DsbA是硫氧还蛋白的 一 种类似物,能有效帮助和它融合的蛋白的二硫键 正确折叠,作为一种分泌表达体系,它能引导合成 的蛋白进入细胞周质,细胞周质所提供的氧化环境 能使二硫键的折叠更容易且更为正确[1.这种分泌 表达体系还为目标蛋白的纯化提供了一种有效的 方法,即渗透冲击提取细胞周质蛋白而无需破碎细 胞.渗透冲击所得蛋白的SDS—PAGE分析见图5. DabA. sBEKLC sBEKLC ku 660 450 350 27.0 20.0 14.4 9,5 65 41 1.渗透冲击蛋白;2.芽透蛋臼部分;3.纯化的sBEKIC; 4.蛋白相对分子质量标准 图5渗透冲击蛋白及亲和纯化 Fig.5SDS.PAGEanalysisofsBEKLCproteinextracted bycoldosmoticshockandpurifiedbynickel affinitychromatography 2.4sBEKLC的纯化 DsbA-sBEKIC融合蛋白分泌表达于细胞周质 后,有效的折叠环境可使sBEKLC形成具有生物活 性的正确构象,从而发生自催化反应,释放出 sBEKLC.sBEKLC的c末端添加有his标签,可用 亲和层析方便地进行纯化.实际上融合蛋白(DsbA— sBEKLC)的末端也有his标签,但两种蛋白和填料 的结合牢固程度不同.分离平衡液中含有75mM 的咪唑,在此条件下DsbA—sBEKIC不会被填料吸 UO2OOO44 k 482江南大学(自然科学版)第6卷 附,sBEKLC则不受影响而有效挂柱.由图5可见, 部分分泌到细胞周质DsbA—sBEKIC确实具有生 物活性,通过自催化反应释放出sBEKIC.经过亲 和纯化,sBEKIC产量达到6.8mg/I. 2.5sBEKLC的活性检测 含有肠激酶酶切位点的人防御素一3融合蛋白 用作酶切底物检验sBEKLC的酶切活性.分别取5, 10ng经过纯化的sBEKIC与20g防御素.3融合 蛋白反应,电泳见图6.当sBEKLC用量为5ng时, 16h后95的防御素一3融合蛋白被成功切开.由 于EK的固有酶切特性,酶量(10ng)过多时酶切效 果反而不佳.为防止过度酶切,给sBEKIC添加his 标签还为方便的从反应体系中除去肠激酶提供了 有效手段.细胞破碎得到高表达的DsbA—sBEKLC 3结语 经过密码子优化全基因合成了牛肠激酶轻链 基因,采用pET一39b(+)构建了融合表达载体,为 有效纯化和回收目标蛋白,在sBEKLC的C末端添 加了his标签.在大肠杆菌中进行成功表达,产量达 到151.2mg/LDsbA—sBEKLC,相当于80.6mg/I 融合蛋白没有检测到活性,但本实验室研究发现其可 用于复性研究,并能得到具有生物活性的肠激酶. TrxA,HBD3 TrxA HBD3 1.蛋白相对分子质量标准;2.TrxA/HBD3融合蛋白;3.5 ngsBEKIC切割产物;4.10ngsBEKIC切割产物 图6sBEKLC切割融合蛋白检测活性 Fig.6Cleavageoffusionproteinwithdifferentamount ofpurifiedsBEKLC sBEKIC.高表达的DsbA—sBEKLC融合蛋白虽然 没有生物活性,但可用于复性来得到活性 sBEKIC.使用渗透冲击技术从细胞周质中提取蛋 白,经过亲和层析可从每升发酵液中得到6.8mg sBEKIC,sBEKLC经检测具有生物活性,为重组肠 激酶在融合蛋白纯化中的应用提供了可靠的物质 基础. 参考文献: [1]MarouxS,BarattiJ,DesnuelleP.Purificationandspecificityofporcineenterokinase[J].JBoilChem,1971,246:5031—5039. [2]AndersonIE,WalshKA,NeurathH,et,a1.Purification,specificityandsomemolecularproperties[J].Biochemistry, 1977,16:3354-3360. [3]MageeAI,GrantDA,TaylorJH.Furtherstudiesonthesubunitstructureandoligosaccharidemoietyofhuman enterokinaserJ].ClinChimActa,1981,115:241—254. [4]IuD,FuttererK,KorolevS,eta1.Crystalstructureofenteropeptidaselightchaincomplexedwithananologofthe trypsinogenactivationpeptide[J].JMolBiol,1999,292:361—373. 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