重组牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达和纯化
重组牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达和
纯化
第6卷第4期
2007年8月
江南大学(自然科学版)
JournalofJiangnanUniversity(NaturalScienceEdition)
VoIl6
Aug
NO4
2007
文章编号:1671—7147《2007)04—0478—05
重组牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达和纯化
黄
(1.浙江大学材料
磊,阮红,徐志南,顾
与化学工程学院,浙江杭州310027;2.浙
玮彦,岑
江大学城市学
沛霖?
院,浙江杭州310015)
摘要:密码子优化全基因合成了牛肠激酶轻链基因(sBEKLC),采用
pET一39b(+)构建了融合表
达载体,在大肠杆菌中进行了成功表达.37?在含30mg/L卡那霉素
的LB培养基中培养,当细胞
密度(D600)达到0.5时,降低温度到28?,加入终浓度为0.1mM的异
丙基硫代口一D一硫代半乳
糖苷诱导外源蛋白表达,继续培养6h后收集菌体,融合蛋白
(DsbA—sBEKIC)产量达到151.2
mg/L,相当于80.6mg/LsBEKLC.使用渗透冲击技术从细胞周质中提
取sBEKLC,经过亲和层
析可从每升发酵液中得到6.8mgsBEKLC,经检测sBEKIC具有生物
活性.
关键词:肠激酶;融合表达;纯化;生物活性
中图分类号:Q819文献标识码:A
ExpressionandPurificationofBovineEnterokinase
LightChaininRecombinantEscherichiacoli
HUANGLei,RUANHong,XUZhi—nan,GUWei—yan,CENPei—lin
(1.CollegeofMaterialsScienceandChemicalEngineering,ZhejiangUniver
sity,Hangzhou310027,China;2.City
College.Zh~iangUniversity,Hangzhou310015,China;)
Abstract:Acodonoptimizedsequencecodinglightchainofbovineenterokin
asegene(sBEKLC)
wassynthesized,anditwasfusedwithDsbAtoconstructtheexpressionvector(pET39一
sBEKLC).Then,theplasmidwastransformedintoE.coliBI21(DE3)forexpression.The
strainwasculturedinLBmediumcontaining30t~g/mLkanamycinat37?.
Whencelldensity
(D600)reached0.5,IPTGwasaddedtoreachfinalconcentrationof0.1mM.Aftercontinued
cultivationat28?
for6hours,cellswereharvested,thevolumetricproductivityoffusion
proteinreached151.2mg/I,i.e.80.6mg/IsBEKLC.Thecoldosmoticshocktechniquewas
successfullyusedtoextractsBEKICfromperiplasmicspace,andnickelaffinitychromatography
wasemployedtoobtainmaturesBEKIC.Finally,about6.8mgOfsBEKLCwaspurifiedfrom1
literfermentationbrothandtheenzymeactivityofsBEKICwaswelldetected.
Keywords:enterokinase;fusionexpression;purification;enzymeactivity
收稿日期:2006—04—19;修订日期:2006—06—28.
基金项目:国家自然科学基金项目(30370039).
作者简介:黄磊(1977一),男,浙江杭州人,生物化学工程专业博士研究
生.
*通讯联系人:岑沛霖(1945一),男,浙江慈溪人,教授,博士生导师.主要
从事生物化工研究
Email:cenpl@zju.edu.cn
第4期黄磊等:重组牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达和纯化479
Enterokinase(EK)是哺乳动物肠道内的一种
丝氨酸蛋白水解酶,能够特异性地识别(Asp)一Lys
序列,起到把胰蛋白酶原转变成胰蛋白酶的作用.
迄今为止,EK已经分别从猪I】],牛_2和人L3等的肠
道组织中纯化得到.它由轻链和重链组成,两条链
通过一对二硫键相连.重链把轻链锚定到消化道的
细胞膜上,它对相对分子质量大的蛋白的识别起着
辅助作用,但对相对分子质量小的多肽的识别影响
较小,轻链则具有催化活性L4j.1993年牛肠激酶
轻链(BEKLC)的cDNA基因被克隆并表达L5],表现
出了良好的切割融合蛋白的活性.EK对(Asp)一
Iys序列表现出高度特异性,而且酶切反应条件较
为广泛,切出的目标产品首位氨基酸完全忠实于天
然蛋白,这使其在融合表达的下游纯化中有着巨大
的应用价值.目前市售的EK价格非常昂贵,从动物
肠道组织中提取的EK常含有其他蛋白酶的污染,
因此它的广泛应用还存在困难].
生长迅速和具有完善的表达系统使大肠杆菌
成为基因工程领域应用最广泛的宿主菌.但不同物
种间基因密码子使用的偏爱性则是在重组表达外
源基因的障碍,稀有密码子的存在会降低外源蛋白
合成的数量和质量,甚至在基因翻译过程中引发问
,这种影响在极端的实例中对于表达甚至是致命
的I7].所幸的是这个问题可以通过调整编码,去除
有害/稀有密码子的办法来消除I8].
文中将牛肠激酶轻链基因进行密码子优化后
全序列合成(sBEKLC).通过pET一39b(+)表达质
粒,使sBEKLC和DsbA配体在大肠杆菌中融合表
达,并在sBEKIC的C末端添加了his标签.运用
渗透冲击技术提取由DsbA配体引导而分泌到细胞
周质的目标蛋白.经过亲和层析纯化,产品具有良
好的生物活性.
1材料与方法
1.1材料
1.1.1质粒及菌株pOEM—T载体购自美国
Promega公司,pET一39b(+)为美国Navagen公司
产品.E.coliTG1,E.coliBL21(DE3)为本室
保存.
1.1.2培养基Iuria—Bertani(IB)培养基(质量
分数/):酵母膏0.5,蛋白胨1,NaCI1.
1.1.3试剂及用品限制性内切酶SpeI,PstI,
XhoI和T4DNA连接酶购自大连TaKaRaBiotech
有限公司;pfuDNA聚合酶购自上海Sangon公司;
DNA胶回收试剂盒(QIAquickGelExtractionKit)
购自德国Qiagen公司;所用引物自行设计,由上海
Sangon公司合成;Ni—NTAAgarose,购自德国
QIAGEN公司.人防御素一3融合蛋白(TrxA/
HBD3),用于酶活性的鉴定,由本实验室自制,该
融合蛋白中含有肠激酶的识别序列Asp—Asp—Asp—
Asp,Lys一.其余试剂均为市售分析纯.
1.2方法
1.2.1全基因合成采用由重叠延伸组装
(SOEing—assembly)L8及PCR扩增(PCR
Amplicfiation)两步所组成的全基因合成法(PCR—
basedgeneSOEingsynthesis)合成经密码子优化的
基因.按优化好的基因序列,将全序列正负两条
DNA链分为2O部分,分别合成2O条寡核苷酸链
(见表1).重叠延伸组装步骤中将浓度为20M的
以上2O条寡核苷酸链等体积混合,取出】tH加O.5
LpfuDNApolymerase,1LdNTP?2I10×
Buffer,15.5肚LddHO.置于PCR仪中按如下程
序进行SOEing—assembly:94?变性5rain,30次扩
增循环(94?×30S,52?×30S,72?×60S).72
?延伸10rain.PCR扩增步骤中取第一步的产物1
L作为模版,5端引物(Oligomer1)0.5I,3端引
物(0ligomer20)0.5I进行PCR,条件与第一步相
同.用质量分数1的琼脂糖凝胶电泳检验结果.按
照DNA胶回收试剂盒说明书回收产物.
1.2.2表达质粒的构建回收产物连接pGEM—T
载体构建成pOEM—sBEKIC重组质粒,委托上海
Sangon公司对插入序列进行全序列测定.pGEM—
sBEKLC与pET一39b(+)质粒分别用SpeI+XhoI
于37?酶切2h,质量分数1琼脂糖凝胶电泳后,
前者纯化回收酶切产物小片段而后者回收大片段.
回收的两段片段连接后转化E.coliBI21(DE3)感
受态细胞,挑选重组克隆培养,提取质粒DNA,经
PstI单酶切鉴定正确重组克隆,命名为pET39一
sBEKLC.重组菌命名为BI21(DE3)/pET39一
sBEKLC.
1.2.3茵体培养及蛋白表达从新划的平板上挑
取单菌落于装有30mLLB(含Kanamycin30mg/
L)培养基的250mL摇瓶中,220r/min,37?,培养
至D600为0.4.将种子菌液按体积分数5的接种
量接入装有60mILB培养基的500mL摇瓶中,于
220r/min,37?培养至D600为0.5时,降低温度
到28?,加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导外源
蛋白表达,继续培养6h后收集菌体,结束发酵.收
集菌体,超声破碎,15SDS—PAGE分析.
480江南大学(自然科学版)第6卷
表1所用引物
引物序号引物结构(从5端到3端)
TGGCCATACTAGTGGTACCGATGACGATGACAAGATTGTGGGCGGTTCTGAT
TACAGAGCGACCACCCACGGCCATGCGCCTTCGCGGCTATCAGAACCGCCCACAAT
GTGGGTGGTCGCTCTGTATTTCGATGACCAACAGGTTTGCGGCGCATCTCTGGTCAGTC
GGCCGTACACACAATGTGCAGCGGACACCAGCCAATCGCGACTGACCAGAGATGCGC
CACATTGTGTGTACGGCCGTAACATGGAACCATCCAAATGGAAAGCCGTACTGGGTC
GTTTCGATTTGCGGAGAAGTCAGATTACTAGCCATATGCAGACCCAGTACGGCTTTCC
TTCTCCGCAAATCGAAACCCGTCTGATTGATCAGATTGTGATT
AACCCGCATT
GGTGCATCATGGCAATATCATTGTTTTTACGGCGCTTGTTATAATGCGGGTTAATCACAA
ATATTGCCATGATGCACCTGGAAATGAAGGTTAATTACACCGATTATATCCAGCCGA
GACCAGGTGGGAAGACCTGGTTCTCTTCAGGCAAACAGATCGGCTGGATATAATCGG
AGGTCTTCCCACCTGGTCGCATCTGCTCCATTGCAGGCTGGGGCGCCCTGATCTATCAGG
CGTCTGCCTCCTGCAGTACGTCGGCGGTACTACCCTGATAGATCAGGGCGC
TACTGCAGGAGGCAGACGTGCCGCTGTTGTCTAACGAGAAATGTCAGCAACAGATGCCG
CGTAACCAGCACAGACCATATTTTCGGTAATATTATACTCCGGCATCTGTTGCTGACA
TGGTCTGTGCTGGTTACGAAGCCGGCGGTGTCGATAGTTGCCAAGGCGACTC
ACGATTGTTTTCTTGGCACATTAACGGACCGCCGGAGTCGCCTTGGCAACTA
TGCCAAGAAAACAATCGTTGGTTGTTAGCCGGCGTTACCAGTTTTGGTTACCAATGCGC
GGGCGTACACACCTGGACGGTTAGGTAAGGCGCATTGGTAAC
CAAAA
GTCCAGGTGTGTACGCCCGCGTTCCGCGCTTTACCGAATGGAT
TCAGTCCT
AAGCTTCTCGAGGTGCAGAAAGGACTGAATCCATTCGG
1.2.4渗透冲击提取目标蛋白超声破碎会对蛋
白的活性造成损害,也给蛋白分离纯化带来困难.
由于DsbA配体会引导产生的融合蛋白进入细胞周
质,可以使用渗透冲击的方法来获得目标蛋白,从
而避免超声破碎带来的负面影响.取4OmL发酵
液,5000g,10min离心收集菌体,重悬于10mL预
冷溶液A(20mMTris?HC1,1mMNa2EDTA,
20SucrosepH8.0),冰浴30min.5000g,10
min离心后再次重悬于4mL预冷溶液B(20mM
Tris-HC1,1mMNa2EDTA,pH8.0),冰浴30
min.12000g,30min离心收集上清.考马氏亮兰法
测定蛋白含量.
1.2.5目标蛋白的纯化亲和层析在AKTA
Purifier层析工作站(AmershamPharmacia
Biotech)上进行,使用Ni—NTAAgarose
(QIAGEN)作为填料.柱子用3,4倍柱体积的平
衡液(50mMTris?HC1,75mMImidazole,0.5M
NaC1,pH8.O)平衡,1.0mL/min进样后用平衡液
冲柱,直至基线走平.柱上蛋白用洗脱液(50mM
Tris?HC1,200mMImidazole,0.5MNaC1.pH
8.0)洗下,收集蛋白于溶液(50mMTris—HC1,50
mMNaC1,pH8.0)中透析过夜,用质量分数15
SDS-PAGE分析.
1.2.6目标蛋白活性分析以含有肠激酶酶切位
点的人防御素?3融合蛋白作为酶切底物与目标蛋
白进行酶切反应.反应条件为:50mMTris?HC1,2
mMCaC12,50mMNaC1,pH8.0,26?,16h.质
量分数18Tricine?SDS—PAGE分析酶切产物.
2结果与讨论
2.1基因合成
牛肠激酶轻链由235个氨基酸组成.在大肠杆
菌基因中,牛肠激酶轻链中的57个氨基酸所使用
的密码子频率小于12,尤其是其中的18个密码
子(AGG,AGA,CUA,AUA和CCC),已被证明
会对外源基因的表达产生副作用].抑制作用最强
的是精氨酸的两个密码子AGG和AGA,它们会对
外源基因的表达产生致命的影响:表达量严重下降
或容易在翻译中发生阅读框偏移口.为了消除由这
些稀有密码子带来的影响,有必要对外源基因的密
码子进行优化.参照大肠杆菌密码子的使用频率
表,对BEKLC的密码子进行优化设计,设计中对那
些低使用频率的密码子作相应的替换.该序列已经
提交至GenBank,其登录号(AccessionNo.)为:
DQ265741,记作:sBEKLCgene.经过重叠延伸组
装及PCR扩增,sBEKLC被成功合成,其长度为
751bp.用质量分数1琼脂糖凝胶电泳的检验结
果见图1.
00n?”加
第4期黄磊等:重组牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达和纯化481
bp
2000
1000
800
500
1.DNA相对分f质量标准;2.sBEKLCgene
图1sBEKLC的合成
Fig.1SynthesisofsBEKLCgene
2.2表达质粒的构建和蛋白表达
表达质粒pET39一sBEKLC的酶切鉴定见图2,
结构图谱见图3.sBEKIC与DsbA配体融合表达,
融合蛋白由464个氨基酸组成,理论相对分子质量
为51.8ku.BEKLC的晶体结构图显示其蛋白的c
末端暴露于表面,而N末端则藏于内部.有研究表
明,N末端多余的氨基酸残基会影响蛋白酶活_1,
所以本实验在DsbA—sBEKLC融合蛋白中
sBEKLC的上游直接添加了EK的酶切位点,并为
有效分离和回收sBEKLC,在sBEKLC的C末端添加
了his标签.
bp
1000
500
1.DNA相对分子质量标准;2.用PstI酶切质粒pET39一sBEKLC
图2表达载体酶切鉴定图
Fig.2Identificationofconstructedvector
图3表达载体的结构图谱
Fig.3Schematicrepresentationofexpressionvecotr
表达质粒pET39一sBEKLC转化E.coliBL21
(DE3),构建成重组菌BL21(DE3)/pET39一
sBEKIC.用LB培养基培养,IPTG诱导表达外源
蛋白.菌体收集并破碎后,将可溶及不可溶蛋白进
行SDS—PAGE分析(见图4).DsbA—sBEKLC产量
达到151.2rng/L,相当于80.6mg/LsBEKLC.
.11
DabA—sBEKLC
1.蛋白相对分子质量标准;2,3.分别为未经诱导的司溶和不
可溶蛋白;4,5.分别为诱导后的可溶和不可溶蛋白
图4表达产物的SDS—PAGE分析
Fig.4SDS.PAGEanalysisofproteinsfromexpression
vector
2.3渗透冲击提取sBEKLC
肠激酶轻链含有4个二硫键,研究表明,在细
胞质中表达的肠激酶由于胞内环境不利于蛋白的
有效折叠因而没有活性[5].DsbA是硫氧还蛋白的
一
种类似物,能有效帮助和它融合的蛋白的二硫键
正确折叠,作为一种分泌表达体系,它能引导合成
的蛋白进入细胞周质,细胞周质所提供的氧化环境
能使二硫键的折叠更容易且更为正确[1.这种分泌
表达体系还为目标蛋白的纯化提供了一种有效的
方法,即渗透冲击提取细胞周质蛋白而无需破碎细
胞.渗透冲击所得蛋白的SDS—PAGE分析见图5.
DabA.
sBEKLC
sBEKLC
ku
660
450
350
27.0
20.0
14.4
9,5
65
41
1.渗透冲击蛋白;2.芽透蛋臼部分;3.纯化的sBEKIC;
4.蛋白相对分子质量标准
图5渗透冲击蛋白及亲和纯化
Fig.5SDS.PAGEanalysisofsBEKLCproteinextracted
bycoldosmoticshockandpurifiedbynickel
affinitychromatography
2.4sBEKLC的纯化
DsbA-sBEKIC融合蛋白分泌表达于细胞周质
后,有效的折叠环境可使sBEKLC形成具有生物活
性的正确构象,从而发生自催化反应,释放出
sBEKLC.sBEKLC的c末端添加有his标签,可用
亲和层析方便地进行纯化.实际上融合蛋白(DsbA—
sBEKLC)的末端也有his标签,但两种蛋白和填料
的结合牢固程度不同.分离平衡液中含有75mM
的咪唑,在此条件下DsbA—sBEKIC不会被填料吸
UO2OOO44
k
482江南大学(自然科学版)第6卷
附,sBEKLC则不受影响而有效挂柱.由图5可见,
部分分泌到细胞周质DsbA—sBEKIC确实具有生
物活性,通过自催化反应释放出sBEKIC.经过亲
和纯化,sBEKIC产量达到6.8mg/I.
2.5sBEKLC的活性检测
含有肠激酶酶切位点的人防御素一3融合蛋白
用作酶切底物检验sBEKLC的酶切活性.分别取5,
10ng经过纯化的sBEKIC与20g防御素.3融合
蛋白反应,电泳见图6.当sBEKLC用量为5ng时,
16h后95的防御素一3融合蛋白被成功切开.由
于EK的固有酶切特性,酶量(10ng)过多时酶切效
果反而不佳.为防止过度酶切,给sBEKIC添加his
标签还为方便的从反应体系中除去肠激酶提供了
有效手段.细胞破碎得到高表达的DsbA—sBEKLC
3结语
经过密码子优化全基因合成了牛肠激酶轻链
基因,采用pET一39b(+)构建了融合表达载体,为
有效纯化和回收目标蛋白,在sBEKLC的C末端添
加了his标签.在大肠杆菌中进行成功表达,产量达
到151.2mg/LDsbA—sBEKLC,相当于80.6mg/I
融合蛋白没有检测到活性,但本实验室研究发现其可
用于复性研究,并能得到具有生物活性的肠激酶.
TrxA,HBD3
TrxA
HBD3
1.蛋白相对分子质量标准;2.TrxA/HBD3融合蛋白;3.5
ngsBEKIC切割产物;4.10ngsBEKIC切割产物
图6sBEKLC切割融合蛋白检测活性
Fig.6Cleavageoffusionproteinwithdifferentamount
ofpurifiedsBEKLC
sBEKIC.高表达的DsbA—sBEKLC融合蛋白虽然
没有生物活性,但可用于复性来得到活性
sBEKIC.使用渗透冲击技术从细胞周质中提取蛋
白,经过亲和层析可从每升发酵液中得到6.8mg
sBEKIC,sBEKLC经检测具有生物活性,为重组肠
激酶在融合蛋白纯化中的应用提供了可靠的物质
基础.
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(责任编辑:杨勇)
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