书书书
中华人民共和国出入境检验检疫行业
!"
!
#!"#$
"
!$#$
山羊传染性胸膜肺炎检疫技术
$
%&'&()*(+
,
'-)-.-/0-'.-()&
1
*-%2.&
,
'*(+
,
/+%'-
,
(+%3-(*&
!$#$4##4$#
发布
!$##4$%4$#
实施
中 华 人 民 共 和 国
国家质量监督检验检疫总局 发 布
版权所有 · 禁止翻制、电子发售
书书书
前
!!
言
!!
本标准按照
!"
!
#$%$
"
&''(
给出的规则起草#
本标准修改采用$陆生动物诊断试验与疫苗手册%&
&''(
版'第
&%)%*
章#
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口#
本标准起草单位(中华人民共和国山东出入境检验检疫局#
本标准主要起草人(郑小龙)梁成珠)朱来华)孙敏)徐彪)邓明俊)岳志芹)肖西志#
!
!"
!
#!"#$
"
!$#$
版权所有 · 禁止翻制、电子发售
山羊传染性胸膜肺炎检疫技术规范
#
!
范围
本标准规定了山羊传染性胸膜肺炎的病原分离与鉴定)微量间接血凝试验)补体结合试验和聚合酶
链式反应&
+,-
'技术#
本标准适用于山羊传染性胸膜肺炎的诊断和检疫#
!
!
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的#凡是注日期的引用文件*仅注日期的版本适用于本文
件#凡是不注日期的引用文件*其最新版本&包括所有的修改单'适用于本文件#
!"
!
#.)/(%&/
"
&''0
!
食品微生物学检验
!
染色法)培养基和试剂
%
!
临床诊断
%%#
!
临床症状
山羊传染性胸膜肺炎的典型特征是极度高热&
.$1
"
.01
'*发病率和死亡率很高*妊娠山羊易流
产#在高热约
&2
"
02
后*出现明显的呼吸症状(呼吸加速*状态痛苦*偶尔出现呼噜声*持续性地剧烈
咳嗽#在病程后期山羊失去运动能力"""前腿分开站立*颈项僵硬前伸*有时候嘴里不断地流出涎液#
%%!
!
判定
根据临床症状可以作出初步判定#如要确诊需送实验室做进一步检查#
&
!
病原分离鉴定
&%#
!
设备和器材
生化培养箱)显微镜)无菌棉拭子)载玻片)灭菌平皿)灭菌试管和试管架)酒精灯#
&%!
!
培养基和试剂
$'3
马血清马丁肉汤)
$'3
马血清马丁琼脂*见附录
4
#
生化用培养基(按
!"
!
#.)/(%&/
"
&''0
中第
0
章的规定#
&%%
!
样品的采集与处理
&%%%#
!
用无菌棉拭子采集患病动物鼻腔分泌物*移入含抗生素&青霉素
$''5
!
67
和链霉素
$''
#
8
!
67
'
的灭菌生理盐水中+或用注射器无菌穿刺采取胸腔液#
&%%%!
!
无菌采集死亡动物的胸水和纵隔淋巴结*以及肺病变部的病料*特别是硬变部位和非硬变部位
交界处的样品#
&%%%%
!
采集样品应尽快低温&
'1
"
.1
'运往实验室*如无法立即送往实验室*应将样品置于
9&'1
冷冻保存#
$
!"
!
#!"#$
"
!$#$
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&%&
!
病原分离培养
在无菌条件下剪碎病料*用无菌接种环钩取样品接种于
$'3
马血清马丁肉汤内+鼻腔拭子浸出液
和胸腔液用灭菌吸管吸取
'%$67
"
'%067
接种于
$'3
马血清马丁肉汤*接种后置
0)1
培养#同时
取上述病料在
$'3
马血清马丁琼脂平板上划线接种*平板用胶布封口*置
0)1:3
二氧化碳培养箱中
培养#
每天检查肉汤培养物生长情况即颜色变化和有无絮状物出现#肉眼观察出现混浊时*表示有细菌
污染*应将培养物经孔径
'%.:
#
6
的滤膜过滤后再移植*用
$
!
$'
的量接种于肉汤培养基或用接种环钩
取培养物在琼脂平板上划线培养#
在平板上培养
$.2
*每
$2
"
02
用解剖镜&放大
:
倍
"
:'
倍'配以透射和入射光源检查一次+继代
时切下带有孤立菌落的琼脂块*表面朝下*在新鲜琼脂平板表面上并稍推动*或将其投入新鲜肉汤培养
基内#也可用巴氏吸管将带有单个菌落的琼脂块吸出*在新鲜肉汤培养基中培养#
作初次分离用的肉汤培养基接种后培养
)2
*如果仍不见生长迹象*要进行盲传#每份样品的培养
物*包括一次盲传继代至少检查
0
周后*方可废弃#
&%'
!
结果判定
&%'%#
!
培养特征
在低次代中*固体培养基上可产生畸形菌落*小型)无芯)形状不规则#经过传代*形成圆形)露滴状
的小菌落*直径
$66
"
066
*大小不一+在
.'
倍显微镜下可看见典型的煎蛋样菌落*部分有脐眼#挑
取典型菌落或取肉汤培养物涂片*用瑞氏染色法进行染色*显微镜下可看到大小不一)形态多样的紫色
小点*有圆形)逗点形)棒形)环形和不规则形等*但以圆形居多#
&%'%!
!
生化特征
分别接种各类生化反应培养基*具体的生化反应内容见表
$
#
表
#
!
生化反应特征
项
!!
目 生化特性 项
!!
目 生化特性
发酵葡萄糖
;
膜斑形成
<
水解精氨酸
9
液化血清
;
分解尿素
9
吸附鸡红细胞
9
还原美蓝
;
溶血素测定
;
!!
注(
;
(阳性
!
9
(阴性#
'
!
微量间接血凝试验
'%#
!
仪器设备
分析天平)离心机)
=
型血凝板)微量振荡器)
:'
#
7
可调移液器)恒温箱等#
'%!
!
试剂和材料
标准抗原)标准阳性血清和标准阴性血清)磷酸盐缓冲液&
+">
?
@)%&
')阿氏液&试剂配制见附
录
4
'*
$3
致敏绵羊红细胞&见附录
"
'#
&
!"
!
#!"#$
"
!$#$
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'%%
!
操作方法
'%%%#
!
微量间接血凝试验操作术式见表
&
#在
=
型微量血凝板上*每孔加
+">&:
#
7
#
表
!
!
微量间接血凝试验操作术式 单位为微升
'%%%!
!
每排第
$
孔加血清
&:
#
7
*反复吹打充分混匀*移出
&:
#
7
至第
&
孔+吹打混匀*移出
&:
#
7
至第
0
孔*依次类推作等量倍比稀释至第
$$
孔*第
$$
孔弃去
&:
#
7
#孔
$&
不加血清设立为红细胞对照*同
时设立阳性血清和阴性血清对照孔#
'%%%%
!
每孔加入
$3
致敏绵羊红细胞悬浮液
&:
#
7
*立即置微型振荡器上振荡或手持血凝板绕圆圈
混匀#
'%%%&
!
置湿盒中
0)1
静置
$A
或室温&约
&'1
'下静置
&A
左右*判定结果#
'%&
!
结果判定
'%&%#
!
阴性对照和红细胞对照应无凝集现象*红细胞沉积呈圆形*边缘整齐#阳性对照应出现全部红
细胞或
"
:'3
红细胞凝集#
'%&%!
!!
(
$''3
红细胞凝集*凝集颗粒均匀地分布在整个孔底*呈薄状+
;;;
(
):3
红细胞凝集*孔底
红细胞呈滴状*凝集边缘不整齐+
;;
(
:'3
红细胞凝集*孔底形成环状*周围有凝集颗粒*但不成膜状+
;
(
&:3
红细胞凝集*孔底形成一个小团*但小团边缘不整齐*周围有少量凝集+
9
(红细胞完全不凝集*
红细胞在孔底形成小团*小团边缘整齐*周围无凝集颗粒#
若各对照组成立*试验结果可信*以被检血清出现
:'3
红细胞凝集&
;;
'的血清最高稀释度作为
其抗体效价#
'%&%%
!
被检血清抗体效价
"
$B/
时判为阳性+被检血清抗体效价
#
$B/
时判为阴性#
(
!
补体结合试验
(%#
!
材料与仪器
(%#%#
!
被检血清(见附录
"
#
(%#%!
!
绵羊红细胞(见附录
"
#
(%#%%
!
补体#
(%#%&
!
山羊传染性胸膜肺炎阴性血清)阳性血清#
(%#%'
!
山羊传染性胸膜肺炎补体结合抗原#
(%#%(
!
溶血素#
(%#%"
!
稀释液(巴比妥缓冲液&见附录
4
'#
(%#%)
!
(*
孔
5
型微量滴定板)酶标仪#
0
!"
!
#!"#$
"
!$#$
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(%!
!
预备试验&溶血素)补体)抗原等效价测定'
(%!%#
!
溶血素效价测定&通常一个月左右测定一次'
(%!%#%#
!
稀释溶血素(先将溶血素稀释成
$B$''
的基础液&如(溶血素以石炭酸防腐时*取
'%$67
加
(%(67
稀释液*如以甘油为保存液*则取
'%&67
加
(%/67
稀释液*混合均匀'*再按表
0
进一步稀释#
表
%
!
溶血素稀释法
要
!!
素
稀释倍数&
$BC
'
:'' $''' $:'' &''' &:'' 0''' 0:'' .''' :'''
$B$''
溶血素!
67 '%& '%$ '%$ '%$ '%$ '%$ '%$ '%$ '%$
稀释液!
67 '%/ '%( $%. $%( &%. &%( 0%. 0%( .%(
全量!
67 $%' $%' $%: &%' &%: 0%' 0%: .%' :%'
(%!%#%!
!
溶血素效价测定的方法*按表
.
#
表
&
!
溶血素效价测定法&总体积
#!'
!
$
'
要
!!
素
稀释倍数&
$BC
' 对照
:'' $''' $:'' &''' &:'' 0''' 0:'' .''' :'''
$B:''
溶血素
补体 红细胞
稀释的溶血素!
#
7 &: &: &: &: &: &: &: &: &: &:
" "
稀释液!
#
7 :' :' :' :' :' :' :' :' :' ): ): $''
$B&'
补体!
#
7 &: &: &: &: &: &: &: &: &:
"
&:
"
&%:3
红细胞悬液!
#
7 &: &: &: &: &: &: &: &: &: &: &: &:
温育
0)1
水浴
&'6DE
!!
按表
.
操作结束后*取出微量反应板*对照不出现溶血现象#微量反应板轻微震动混匀后*
:.'E6
读取
FG
值*与标准比色孔&见附录
,
'比较*观察溶血度*
结果#
(%!%#%%
!
溶血素效价确定(能使
&:
#
7
的
&%:3
红细胞悬液在
0)1
水浴箱内
&'6DE
出现完全溶血
&
$''3
'的最小溶血素量*称为一个溶血素单位*或溶血素效价#测定补体)抗原和做正式试验时*溶血
素的用量为
&
个溶血素单位或称工作量#
(%!%#%&
!
制备致敏红细胞悬液(按测定的溶血素效价稀释溶血素至
&
个标准单位*缓慢加入到等量的
&%:3
绵羊红细胞悬浮液中*混合均匀*置
0)1
水浴箱中温育
&'6DE
*即制备成致敏红细胞悬液#
(%!%!
!
补体效价测定
每次进行补体结合反应试验*应于当日测定补体效价#先用稀释液*将补体做
$B&'
稀释*然后按
表
:
进行操作#
表
'
!
补体效价测定&总体积
#!'
!
$
'
要
!!
素
孔
!!
号 对照
$ & 0 . : * ) / ( $' $$
$B&'
补体!
#
7 : $' $: &' &: 0' 0: .' .: :'
"
.
!"
!
#!"#$
"
!$#$
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表
'
&续'
要
!!
素
孔
!!
号 对照
$ & 0 . : * ) / ( $' $$
稀释液!
#
7 .: .' 0: 0' &: &' $: $' : ' :'
补加稀释液!
#
7 &: &: &: &: &: &: &: &: &: &: &:
温育
0)1
水浴
&'6DE
致敏红细胞!
#
7 :' :' :' :' :' :' :' :' :' :' :'
温育
0)1
水浴
&'6DE
!!
按表
:
操作结束后*取出微量反应板*对照不出现溶血现象#微量反应板轻微振动混匀后*
:.'E6
读取
FG
值*与标准比色孔&见附录
,
'比较*确定出现
:'3
溶血时补体的最高稀释倍数为补体的效价*
即该浓度为此反应体系下
$
个补体溶血单位&
,@
:'
'#正式试验补体工作浓度为
:
个
,@
:'
#
(%!%%
!
抗原效价的测定
按表
*
进行抗原效价的测定#
表
(
!
抗原效价测定&总体积
#!'
!
$
'
要
!!
素
抗原稀释倍数 对照
$B$' $B:' $B): $B$'' $B$:' $B&'' $B0'' $B.'' $B:'' $B$'
稀释的抗原!
#
7 &: &: &: &: &: &: &: &: &: &:
稀释的阳性血清!
#
7 &: &: &: &: &: &: &: &: &:
"
0)1
水浴
&'6DE
:,@
:'
补体!
#
7 &: &: &: &: &: &: &: &: &: &:
稀释液!
#
7
" " " " " " " " "
&:
温育
0)1
水浴
&'6DE
致敏红细胞!
#
7 :' :' :' :' :' :' :' :' :' :'
温育
0)1
水浴
&'6DE
!!
注(每一血清稀释度&
$B:
*
$B$'
*
$B&:
*
$B:'
*
$B):
*
$B$''
'各做一行*共计
*
行#
!!
按表
*
操作结束后*取出微量反应板*对照不出现溶血现象#微量反应板轻微振动混匀后*
:.'E6
读取
FG
值*与标准比色孔&见附录
,
'比较*观察溶血度*记录结果#
抗原效价的确定(在对照成立时*与阳性血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度为抗原
效价*即为
$
个单位抗原*正式试验抗原使用
&
个单位*即为该抗原的工作浓度#
(%%
!
正式试验
(%%%#
!
要素准备
按
*%&
的测定结果对各要素作稀释#
被检血清&见附录
"
'#
工作抗原(按测定的效价稀释成工作浓度&
&
单位抗原'*用
&:
#
7
#
:
!"
!
#!"#$
"
!$#$
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工作补体(按测定的效价稀释后工作浓度&
:,@
:'
'*用
&:
#
7
#
致敏红细胞悬液&见
*%&%$%.
'(用
:'
#
7
#
阳性血清(灭活后*
$B:
稀释*用
&:
#
7
#
阴性血清(灭活后*
$B:
稀释*用
&:
#
7
#
(%%%!
!
血清效价测定
按表
)
的程序实施#
表
"
!
血清效价测定&总体积
#!'
!
$
'
要
!!
素 血清试验孔
血清抗
补体对照
$BC : $' &' .' /' $*' 0&' :
抗原对照 补体对照
抑制
溶血
溶血
对照
&,@
:'
$,@
:'
红细胞
对照
血清!
#
7 &: &: &: &: &: &: &: &:
" " " " "
&
单位抗原!
#
7 &: &: &: &: &: &: &:
"
&: &:
" " "
稀释液!
#
7
" " " " " " "
&: &: &: :' *&%: ):
0)1
水浴
&'6DE
:,@
:'
补体!
#
7 &: &: &: &: &: &: &: &: &:
"
&: $&%:
"
温育
0)1
水浴
&'6DE
致敏红细胞!
#
7 :' :' :' :' :' :' :' :' :' :' :' :' :'
温育
0)1
水浴
&'6DE
(%%%%
!
结果判定
(%%%%%#
!
试验成立条件
按表
)
操作结束后*取出微量反应板*轻微振动混匀后*
:.'E6
读取
FG
值*比照标准比色孔&附
录
,
'判读*各对照的结果如下时*可判定被检血清孔+否则*补体的效价应重新测定*并重做
*%0
的正式
试验#
&
个单位补体对照(
$''3
溶血#
$
个单位补体对照(
:'3
溶血#
'
个单位补体对照(不溶血#
抗原对照(抑制溶血对照
$''3
溶血+溶血对照不溶血#
红细胞对照(不溶血#
阴性血清对照*完全溶血#
阳性血清对照*完全不溶血#
血清抗补体对照(抗补体对照孔应为
$''3
溶血#如果抗补体对照孔与试验孔的抑制溶血程度相
同说明该血清为抗补体*血清抗补体可重新采样或用其他方法检测#
(%%%%%!
!
结果判定
被检血清
$B:
稀释*抑制溶血
"
:'3
判为阳性+抑制溶血在
&:3
"
:'3
之间判为可疑+溶血程度
在
):3
"
$''3
溶血判为阴性#
可疑样品应重检一次*按上述标准进行判定*若仍为可疑则判为阳性#
*
!"
!
#!"#$
"
!$#$
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达到
:'3
抑制溶血或以上时血清的最高稀释度为该血清的效价#
"
!
聚合酶链式反应&
%&'
方法'
"%#
!
仪器设备
+,-
仪)高速台式冷冻离心机)台式离心机)混匀器)冰箱)微量可调移液器&
$'
#
7
)
$''
#
7
)
$'''
#
7
'及配套吸头)离心管#
"%!
!
试剂与材料
裂解液)苯酚)三氯甲烷)异丙醇&
9&'1
预冷')无水乙醇)
):3
乙醇)蒸馏水)
2H#+
)
GH4
聚合酶)
氯化镁)蛋白酶
I
)琼脂糖)电泳缓冲液等&试剂配制见附录
4
'#
引物(
+$
(
:
,
J4#,4#####44#,,,##,44!J0
,
+&
(
:
,
J#4,#4#!4!#44##4#44#4#4#!,44J0
,
引物在使用时用双蒸水稀释为
$'
#
6KL
!
7
#
"%%
!
样品的制备
"%%%#
!
培养物的处理
取
067
培养物
.1$&'''M
!
6DE
离心
&'6DE
#将沉淀用
+">
洗涤一次*加入
$67
灭菌蒸馏水
重悬沉淀*置于
$''1
裂解
$'6DE
*作为
保存于
9&'1
备用#
"%%%!
!
组织样品
(")
的提取
将组织样品放入培养液中无菌研磨*取
$67
上清液用
+">
清洗*
$&'''M
!
6DE
离心
$'6DE
#沉淀
用裂解液悬浮*加入
>G>
至终浓度为
$3
*蛋白酶
I
至终浓度为
&''6
8
!
67
#将该混合反应液置于
:'1
孵育
$A
*然后加入等量的苯酚
B
三氯甲烷
B
异戊醇&
&:B&.B$
'*颠倒
&
次
"
0
次*混匀*
.1
下
$&'''M
!
6DE
离心
$'6DE
#转移上清液于另一离心管中*加入
&%:
倍体积的预冷无水乙醇*
9&'1
沉
淀
0'6DE
*
$&'''M
!
6DE
离心
$'6DE
*弃去所有液相#用
$67)'3
乙醇漂洗*
$&'''M
!
6DE
离心
&6DE
*
重复
&
次
"
0
次#真空或室温干燥*
GH4
沉淀物用
&:
#
7
无菌双蒸水溶解作为模板*保存在
9&'1
备用#
"%&
!
%&'
反应
"%&%#
!
反应体系
$'N!"
#
缓冲液(
:
#
7
#
2H#+
&
$'66KL
!
7
'(
'%:
#
7
#
引物
+$
和
+&
(各
$
#
7
#
!"
#
GH4
聚合酶(
'%:
#
7
&
$OEDP
'#
Q
8
,L
&
&
$%:66KL
!
7
'(
0
#
7
#
被检样品(
:
#
7
#
灭菌双蒸水(
0.
#
7
#
样品检测时*同时要设阳性对照和空白对照#
"%&%!
!
反应程序
第一阶段(
(.1
!
&6DE
+
)
!"
!
#!"#$
"
!$#$
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第二阶段(
(.1
!
0'R
*
.)1
!
$:R
*
)&1
!
$:R
*
0:
个循环+
第三阶段(
)&1
!
:6DE
#
"%'
!
电泳
制备
$3
琼脂糖凝胶板*加样
*
#
7
"
/
#
7
*电压
/'=
"
$''=
*电流
.'64
"
:'64
*电泳
0'6DE
"
.'6DE
#判定#
"%(
!
凝胶成像仪观察
扩增产物电泳结束后*用凝胶成像仪观察检测结果)拍照*记录试验结果#
"%"
!
结果判定
在同一块凝胶板上电泳后*当阳性对照泳道出现一条
0$*S
?
清晰条带*空白对照泳道不出现任何
条带*
GH4
分子质量标准成立时(
"""被检样品泳道出现一条
0$*S
?
的条带*判为阳性&
;
'+
"""被检样品泳道没有出现大小为
0$*S
?
的条带*判为阴性&一'#
必要时对扩增产物进行序列测定#
+,-
扩增序列参见附录
G
#
/
!"
!
#!"#$
"
!$#$
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附
!
录
!
)
&规范性附录'
试剂的配制
)%#
!
#$*
马血清马丁肉汤&
+
,"%)
"
)%$
'
将制备的马丁肉汤分装于灭菌试管内*每管
.%:67
*添加无菌马血清
'%:67
#
)%!
!
#$*
马血清马丁琼脂
马丁肉汤中加入琼脂*使含量达
$%03
"
$%:3
*
$&$1
高压灭菌
$:6DE
即成马丁琼脂#在灭菌的
*T6
"
/T6
直径培养皿内加无菌马血清
$67
*再添加煮沸融化降温至
::1
"
*'1
的马丁琼脂
(67
*
轻轻摇动混合均匀*静置凝固后即成马丁琼脂培养基#
)%%
!
磷酸盐缓冲液&
+
,"%!
*
$%#-./
!
$
'
甲液(磷酸氢二钠&
$&@
&
F
'
!
0:%/&
8
*氯化钠
!
/%:
8
*加蒸馏水至
$'''67
#
乙液(磷酸二氢钠&
&@
&
F
'
!
$:%*'
8
*氯化钠
!
/%:
8
*加蒸馏水至
$'''67
#
甲液
)&67
*乙液
&/67
*混匀#
$&$1
高压蒸汽灭菌
$:6DE
*置室温或
.1
保存#
)%&
!
阿氏液的配制
葡萄糖
!!!!!!!!
&%':
8
柠檬酸钠&
&@
&
F
'
'%/'
8
氯化钠
'%.&
8
蒸馏水 加至
$''67
溶解后*以
$'3
柠檬酸调节
?
@
至
*%$
*分装*
$$)1
高压蒸汽灭菌
$:6DE
*
.1
保存#
)%'
!
$%)'*
生理盐水
氯化钠
'%/:
8
蒸馏水 加至
$''67
溶解后*
$&$1
高压蒸汽灭菌
$:6DE
*置室温或
.1
保存#
)%(
!
巴比妥缓冲液&
01!
'储存液&
'N
'的制备
)%(%#
!
成分
:
*
:
二乙基巴比妥酸
:%):
8
:
*
:
二乙基巴比妥钠
0%):
8
氯化钠
/:%''
8
(
!"
!
#!"#$
"
!$#$
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六水合氯化镁
$%*/
8
氯化钙
'%&/
8
蒸馏水加至
&'''67
)%(%!
!
方法
首先用
$'''67
蒸馏水将各种盐溶解*再用
:''67
热蒸馏水溶解巴比妥酸*待巴比妥酸冷却后
加入
$'''67
盐溶液中*最后用蒸馏水补至
&'''67
*混匀*分装后
$&$1
高压灭菌
&'6DE
*储存于
.1
备用#
)%(%%
!
用法
用前将所配
:N=">
储存液用蒸馏水作
$B:
稀释成
$N=">
使用液*调
?
@
值至
)%.
#
)%"
!
裂解缓冲液
$'66KL
!
7#MDR
J
@,L
&
?
@)%.
'
$'66KL
!
7HU,L
$'66KL
!
7VG#4
)%)
!
'$*#)2
电泳缓冲储存液
#MDR
碱
&.&
8
VG#4 0)%&
8
冰乙酸
:)%$67
加双蒸水至
$'''67
*应用前用双蒸水将
:'N#4V
电泳缓冲液
:'
倍稀释#
'$
!"
!
#!"#$
"
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附
!
录
!
1
&规范性附录'
被检血清)绵羊红细胞的采取与处理
1%#
!
被检血清
在被检牲畜颈前三分之一处静脉沟部位剪毛消毒采血#采出的血液*冬季应放置室内防止血清冻
结*夏季应放置阴凉之处并迅速送往实验室#如在
)&A
内不能送到*应先将血清倒入另一灭菌试管内*
按比例每
$67
血清加入
$
滴
"
&
滴
:3
石炭酸生理盐水溶液*以防腐败#运送时使试管保持直立状
态*避免振动#血清在
:*1
水浴灭活
0'6DE
#
1%!
!
#*
致敏绵羊红细胞的制备&血凝试验'
采集绵羊血*放入等量阿氏液中摇匀*置
.1
冰箱中保存备用#临用前用
+">
洗涤
0
次*每次以
&'''M
!
6DE
离心
:6DE
*将血浆)白细胞充分洗去至上清液清亮*弃上清液*留存沉淀的红细胞#
$3
致敏绵羊红细胞(将红细胞用
+">
液配成
.3
的悬液*在冰浴的条件下加入
&%:3
的戊二醛*边
加边摇*使最终浓度为
'%.3
&即
$''67.3
的红细胞悬液内加入
$*67&%:3
的戊二醛'*在
.1
固定
$A
*摇匀后用生理盐水洗涤
.
次
"
:
次*最后用生理盐水配成
$'3
的红细胞悬液#取稀释的标准抗原
与等体积的己醛化的
&3
绵羊红细胞混合*
0)1
水浴
&A
*每隔
$:6DE
振摇一次*取出后洗涤弃上清*稀
释成
$3
备用#
1%%
!
绵羊红细胞&补体结合试验'
绵羊颈静脉采血*置于装有玻璃珠的灭菌瓶内*振荡
$:6DE
"
&'6DE
*脱去纤维蛋白*防止血液凝
固#将脱纤血移至离心管中*加入
&
倍
"
0
倍量的稀释液*混匀*以
$:''M
!
6DE
"
&'''M
!
6DE
离心
$:6DE
*吸出上清液加入稀释液轻轻混合后做第二次离心*方法同前*离心
0
次*以清洗红细胞#直到上
清液透明为止*然后吸去上清液#使用前用
$N=">
使用液将洗涤后的细胞做成
&%:3
细胞液&即
$B
.'
稀释'#稀释后的红细胞最多保存
$2
*但离心后的红细胞在冰箱中可保存
02
"
.2
#
$$
!"
!
#!"#$
"
!$#$
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附
!
录
!
&
&规范性附录'
标准比色孔的制备
&%#
!
!%'*
溶解红细胞液&血红素'的配制
取红细胞泥
&%:67
加于
))%:67
蒸馏水内*使红细胞完全溶解后*再加
:N=">
储存液
&'67
混
匀*制成
&%:3
溶解红细胞&血红素'*供配制标准比色孔用#
&%!
!
!%'*
红细胞悬液配制
取红细胞泥
&%:67
加于
$N=">
使用液
()%:67
混匀*即成
&%:3
红细胞悬液*供配制标准比色
孔用#
&%%
!
标准比色孔的制备
标准比色孔的制备按表
,%$
进行#
表
&%#
!
标准比色孔制备
要
!!
素
反应孔溶血百分比
3
' $' &' &: 0' .' :' *' )' ): /' (' $''
&%:3
溶解红细胞液!
#
7 ' $' &' &: 0' .' :' *' )' ): /' (' $''
&%:3
红细胞悬液!
#
7 $'' (' /' ): )' *' :' .' 0' &: &' $' '
稀释液&
$N=">
'!
#
7 .'' .'' .'' .'' .'' .'' .'' .'' .'' .'' .'' .'' .''
&%&
!
标准比色孔的配制
取
'3
"
$''3
溶血度溶液各
$&:
#
7
*分注相应的微量孔内*
:.'E6
读取
FG
值#
&$
!"
!
#!"#$
"
!$#$
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附
!
录
!
(
&资料性附录'
%&'
扩增片段序列
!!
UPTUPPPPPUUPTTT
UU
8
PU
8
P
88
UUPPP
8
TU
88
P
8
TU
8
PUPPPTTUPPUPPUUPP
8
8
P
8
PP
8
PPPPUUUUTUUTUU
8
UP
8
PUPPU
8
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88
UPTUUPPUTU
8
TUPPPPTUPPP
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PPU
8
PPUUTPPUUPPUTPTTUUTUU
8
P
88
P
8
PP
8
PPUP
888
U
8
PPUPP
8
TUU
PPUTUU
8
UUPT
8
UPPUP
88
UUUUPPP
8
PUUUU
88
PUPPU
8
PTTUPPP
8
PU
8
TU
8
PUPPUP
TU
8
PUU
8
PPTUPPUUTTPPUPPUPP
8
UPU
88
P
88
U
8
TUUPP
88
P
88
UUTUUPP
8
TUPUPU
PPUPUUPPUTPTUPU
8
PU
0$
!"
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#!"#$
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书书书
0102—
0172
犜/
犖犛
中华人民共和国出入境检验检疫
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山羊传染性胸膜肺炎检疫技术规范
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邮政编码:100045
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电话:68523946 68517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷
开本 880×1230 1/16 印张 1.25 字数 25 千字
2011年3月第一版 2011年3月第一次印刷
印数1—1600
书号:155066·221648 定价 21.00 元
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