固体发酵产纳豆激酶工艺条件的研究 (1)

流行病学调查 1 基本情况: 南京某幼儿园位于南京市中心地区, 全园共 有 22 个班级,学生 612 人, 教职工 62 人, 全园学生均是南京 市城区儿童。2例病例分别为,男, 2005 年 7 月出生; 女, 2005 年 8 月出生。女患儿于 2008 年 7 月 13 日因手、足、臀部皮疹 及口腔疱疹, 发热 38. 5 � 1 天, 前往儿童医院就诊并入院治 疗, 15 日病情加重, 精神萎靡,脑脊液检查: WBC: 150/ ul,显示 中枢神经系统显著感染, 随即转入 ICU 治疗; 男患儿于 2008 年 7 月 14 日因持续发热 39� 1 天, 手、足、臀部皮疹和口腔疱 疹,前往儿童医院就诊并入院治疗, 治疗期间非喷射性呕吐 1 次,出现嗜睡、四肢抖动症状, 14 日脑脊液检查: WBC: 90/ ul, 单核 30% ,多核 70% ,显示中枢神经系统显著感染, 随即转入 ICU 治疗。 2 密切接触史: 女患儿 7 月 11 日接触过手足口病患儿, 7 约 12 日即出现皮疹症状; 男患儿 7 月 12 日接触女患儿后次 日即发病。2名患儿发病前 1 周内未离开南京, 未前往人群聚 集地,无外出就餐, 未饮用不洁水源。 3 临床特征; 2名患儿均有手、足、臀部皮疹和口腔溃疡型 疱疹,同时伴有发热, 合并病毒性脑膜炎, 无呼吸系统和心血 管系统症状。2名患儿经治疗后均痊愈出院。 4 实验室检查: 女患儿血常规: WBC: 19. 4 � 109 / L , N: 61. 7% , 脑脊液细胞形态学检查: WBC: 150/ ul; 男患儿血常 规: WBC: 9. 8 � 109/ L , N: 45% , 脑脊液细胞形态学检查: WBC: 90/ ul, 单核 30% , 多核 70%。咽拭子和肛拭子送南京 市疾病控制中心检测,结果为 EV71 型肠道病毒感染, 急性期 血亦分离出 EV71 型肠道病毒。 5 防治措施 5. 1 医院加强院内手足口病管理, 首诊医生发现手足口 病及时报告,并及时隔离治疗, 预防院内交叉感染, 控制疫情 蔓延[2]。自 2008 年 5 月 2 日起,手足口病纳入丙类传染病管 理,发现手足口病患者时, 实行网络直报的医疗机构应于 24 小时内进行网络直报[3]。而南京儿童医院 6 小时内即进行网 络报告。 5� 2 幼儿园按�江苏省手足口病疫情防控�的要 求所有班级停课 2 周;停课后所有教室进行消毒, 玩具清洗消 毒;儿童午睡用被褥等让家长带回家自行清洗和暴晒;开园前 教室再进行消毒。 5� 3 建议市区幼儿园加强入园儿童晨检工作, 保持教室 空气流通和消毒工作,搞好幼儿园的环境卫生; 发现病例及时 报告。 5� 4 开展健康教育。向前往医院就诊的手足口病患儿家 长发放手足口病宣传资料,缓解家长的恐惧心理; 培训幼儿园 保健老师,增强手足口病防范意识:建议市区幼儿园加强儿童 的教育,培养儿童勤洗手, 搞好个人卫生等良好习惯。 讨 � � 论 1 此次 2 例患儿经过流行病学调查、临床诊断、实验室检 测,证实为手足口病合并病毒性脑膜炎的重症病例, 是南京市 鼓楼区首次发生重症手足口病病例。 2 我国于 1981 年上海首次报道本病, 此后, 北京、河北、 天津、福建、吉林、山东、湖北、青海和广东等 10 几个省份均有 本病报道[4]。但南京市区同一幼儿园同一班级同时发生 2 例 手足口合并病毒性脑膜炎的重症病例较为少见。因此各幼托 机构要重视手足口病, 加强对儿童的晨检工作和幼儿园的消 毒工作:发现病例及时报告, 增强防范意识。广大家长也要关 注孩子,发现婴幼儿有不适或异样,应主动观察和及时前往医 院就诊。 3 此次疫情能够处理及时, 与疾控机构反应快速, 医疗机 构及时报告有很大关系,从而有效地控制疫情的蔓延,保障了 其他儿童的身体健康。实验室检查也为 2008 年 5 月以来手 足口病暴发,重症病例增多提供了证据, 为以后此类疫情处理 提供支持。 4 医院有专门的病区治疗手足口病, 为患儿提供强有力 的医疗保障,但由于病区不仅接收周边地区的手足口病患儿, 还要满足本市手足口病患儿的治疗,病区的床位周转率较高, 因此病区内交叉感染存在一定的可能性。同时重症患儿与轻 症患儿间是否存在交叉感染、轻症患儿接触过重症患儿后病 情是否存在加重的可能性有待具体观察研究。 参考文献 [ 1] � 张红军,秦正奎.一起幼儿园手足口病暴发疫情的流行病学调查 [ J] .江苏预防医学 2007, 6. 18( 2) : 15� [ 2] � 胡旺先, 崔心尧,陈永红. 一起手足口病局部流行的调查报告 [ J] .公共卫生与预防医学 2007, 18. 6: 78� [ 3]、[ 4]卫生部发布�手足口病预防控制指南� ( 2008年版)� (收稿日期: 2009- 11- 03) 大兴安岭林业集团公司科技信息部,绿色食品及北药产品开发项目 固体发酵产纳豆激酶工艺条件的研究 刘 � 丽1 � 殷金莲2 � 胡雪芬3 (大兴安岭职业学院 医学技术系,黑龙江 � 加格达奇 � 165000) 摘 � 要 � 本文以大豆为原料,采用固体发酵法制备纳豆激酶,并对其发酵工艺条件进行了研究。实验结果表明,固体发酵产纳豆激酶的最佳 发酵条件为:发酵时间 48小时,发酵温度 30~ 37 � ,培养基初始 pH 值 7� 0,培养基的含水量 70%。 关键词 � 大豆;发酵;纳豆激酶 Solid- state Fermentation Production Process Conditions of Nattokinase L I U L i YIN J in- lian H U X ue- f eng ( Depar tment of Medical T echnolog y, Dax ing'anling Vocational Colleg e, Jiag edaqi, H eilongjiang P rov ince, 165000) Abstract� In this paper, soybean as raw material pr epar ed by solid- state fermentat ion nattokinase, and its fermentat ion conditions were st udied. Experimental r esults indicated that so lid- state ferment ation pr oduction o f nattokinase best fermentat ion conditions ferment ation time w ere 48h, fermentat ion temperature 30- 37 � , medium initial pH 7. 0, and medium moist ur e con� tent 70% . Key word � Soybean; Fermentation; Natt okinase �34� 中国伤残医学 2010年 18 卷第 3 期 � � Chinese Journal o f T rauma and Disabilit y Medicine, 2010, Vo l� 18, No� 3 � 中图分类号: R 19� � � � 文献标识码: A � � � � 文章编号: 1673� 6567( 2010) 03 � 0034 � 03 � � 纳豆激酶( nattokinase,简称 NK)是日本的传统食品- 纳 豆在发酵过程中产生的, 是一种由纳豆芽孢杆菌产生的具有 纤溶性的丝氨酸蛋白酶。1987 年日本学者须见洋行[ 1] 首次 对纳豆及其提取物作了系统研究, 发现纳豆激酶有明显溶栓 作用,是一种非常有前途的溶血栓、抗血栓的新型药物, 是一 种非常具有开发潜力的食源性溶栓药物。 目前在纳豆激酶( NK )的研究中生产的方法有: 固体培养 发酵,液体深层发酵等[ 2]。我国谢秋玲[ 3]、王正刚[4]等相继开 展了液体发酵条件的研究。固体发酵具有成本低、设备简单、 产酶活力高、易推广的优点[5]。中国传统食品大豆与纳豆类 似,在发酵过程中亦可能产生具纤溶活性的激酶。本研究利 用纳豆芽孢杆菌发酵我国传统食品大豆获得纳豆激酶, 并对 其固体发酵条件进行了研究, 旨在确定获得最高纳豆激酶活 力的最佳发酵工艺条件,为开发纳豆激酶保健食品奠定基础。 材料与方法 1 一般情况: ( 1)菌种: 纳豆杆菌, 实验室保存。( 2)培养 基:斜面培养基: 蛋白胨 0� 5% , 牛肉膏 0� 5% , NaCl0� 5% , 琼 脂 2% , pH 7� 2- 7� 4 种子培养基: 葡萄糖 1% , 蛋白胨 1% NaCl0� 5% , pH 7� 2- 7� 4。( 3)试剂: 大豆, 市售; 凝血酶、纤维 蛋白原、标准尿激酶均购自中国生物制品检定所。其他试剂 为国产分析纯。 2 实验方法 2� 1 纳豆枯草芽孢杆菌菌株的保存与活化。纳豆枯草芽 孢杆菌置于 4� 冰箱里保存, 并且每 1~ 3 个月用新鲜的斜面 培养基活化 1 次。菌株使用前先用新鲜的斜面活化, 37� 培 养 24 小时。 2� 2 种子培养液的制备。从斜面上挑取一环接种入装有 种子培养基的三角瓶中, 于 37 � , 150r / min 摇床振荡培养 24 小时。 2� 3 纳豆激酶制备工艺流程。大豆精选 �清洗 �浸泡 � 蒸煮�冷却�接种�发酵。 操作要点: ( 1)选用颗粒饱满,蛋白质含量高的市售大豆。 ( 2)用大豆 3 倍的水量浸泡一昼夜(室温 l5 � , 24 小时) ,沥水。 ( 3)加入 3%的食盐和蔗糖,高压锅内 121� 下蒸煮 20 分钟, 以豆子很容易被用手捏碎为宜, 冷却至 55 � 以下。( 4)在无 菌条件下,将事先活化好的纳豆枯草芽孢杆菌菌种喷洒于大 豆中搅拌均匀,铺成 3~ 5 cm 的薄层, 恒温培养发酵。( 5)发 酵结束,将纳豆放入 4 � 冰箱中老化 24小时。( 6)将制备好的 新鲜纳豆, 按 1: 15 的体积用 0� 9% 无菌生理盐水于 4 � 浸提 24 小时,浸提 2 次, 合并提取液。( 7)获得的纳豆激酶提取液, 再经过 95%乙醇沉淀,去除粘性物质- - 主要成份是果糖和 多聚谷氨酸,从而得到纳豆激酶的粗酶液。 2� 4 纳豆激酶活力测定: ( 1)纤维蛋白平板的制备。酶纤 溶活力的测定采用纤维蛋白平板法, 依照 Astrup[ 83]等报道 的纤维蛋白平板法,并稍加修改, 以测得纤维蛋白溶解圈面积 来表示 NK 的活性。纤维蛋白平板的具体制作方法为: � 用 蒸馏水配置 1%琼脂糖溶液,加热至沸腾,放置于 55 � 水浴保 温备用。� 将精确称取的牛纤维蛋白原溶解于 0� 02mo l/ L、 pH 7� 4 磷酸盐缓冲液中, 制成浓度为 0� 3% 的可凝结蛋白溶 液,置于 55� 水浴中保温备用。� 将精确称取的牛凝血酶溶 解于 0� 02mol/ L、pH7� 4 磷酸盐缓冲液中, 制成 1BP / mL 的溶 液。�将凝血酶溶液 1mL 和保温于 55� 的牛纤维蛋白原溶 液 8mL ,同时倒进 8mL 保温于 55 � 琼脂糖溶液中, 迅速搅拌 混匀后,立即倒入干净的玻璃平皿中。� 室温静置冷却几分 钟后,平板凝固呈现灰白状, 4� 保存备用。以上所有试剂均 需要临时配制,制备好的平板最好当天使用。( 2)酶活标准曲 线的制作。纳豆激酶活力的测定是以其相对于尿激酶的活力 单位来表示的,故需要建立尿激酶的活力单位与纤维蛋白平 板溶圈大小间的相关性。以不同活力单位的尿激酶溶液为标 准,制作标准曲线。将尿激酶标准品用 pH7� 4 的磷酸盐缓冲 液依次稀释至 200� 0IU / mL、300� 0IU / mL、500� 0IU / mL、 1000IU / mL、1500IU / mL、2000IU / mL 浓度, 分别用微量进样 器各取 10�L 尿激酶溶液点样于制作好的纤维蛋白平板上(依 次编号为 A 至 I)。放入 37 � 恒温培养箱中反应 18 小时, 然 后分别测定纤维蛋白溶解圈的两个垂直直径, 计算其乘积近 似为纤维蛋白溶解圈的面积, 并根据尿激酶的活力单位与纤 维蛋白溶解圈的面积绘制酶活标准曲线。( 3) NK 的活性测 定。用微量进样器取适当浓度的待测 NK 样品 10�L 点样于 纤维蛋白平板上,同时将一定单位的标准尿激酶溶液点样于 纤维蛋白平板上作为对照,放入 37� 恒温培养箱中反应 18 小 时,然后分别测定纤维蛋白溶解圈的两个垂直直径,计算其乘 积近似为纤维蛋白溶解圈的面积。溶解圈面积直接反映了酶 活力的相对大小,将 NK 溶解圈面积与标准的尿激酶 UK 的 溶解圈面积相比较, 得出 NK 相当于尿激酶的活力单位( IU / mL)。NK 活力单位= NK 纤维蛋白溶解圈的面积/ UK 纤 维蛋白溶解圈的面积� 标准 UK 的活力单位。 2� 5 固体发酵条件对纳豆激酶的影响: 发酵时间对产酶 的影响。将纳豆杆菌接种于大豆培养基中, 初始发酵条件为: pH 7� 0、接菌量 4% , 37� 培养箱中分别培养 12、24、36、48、72 小时,测定纳豆激酶活力确定培养时间。发酵温度对产酶的 影响。将该菌接种于大豆培养基中, 按照上面所确定的发酵 时间和初始发酵条件,分别在 25、30、37、4O、42� 培养箱中培 养,测定纳豆激酶活力确定培养温度。发酵初始 pH 对产酶 的影响。将该菌接种于大豆培养基中, 按照上面所确定的温 度和时间,接菌量为 4% , 初始 pH 分别为 5� 0、6� 0、7� 0、8� 0、 9� 0进行培养。测定纳豆激酶活力, 确定培养初始 pH。含水 量对产酶的影响。将该菌接种于大豆培养基中, 按照所确定 的培养时间、温度、pH, 含水质量为 50%、60%、70% 、80% 、 90% 进行培养比较不同含水量对产酶的影响。 结 � � 果 1 标准曲线 图 1 � 尿激酶活力与溶囤面积的关系 从图 1 可以看出, 尿激酶活力与溶圈面积基本上成直线 关系,其直线方程为: Y= 9� 8731x + 14� 996 用此方程可以计 算出纳豆激酶的纤溶活性。 2 发酵时间对产酶的影响 �35�� 中国伤残医学 2010 年 18卷第 3期 � � Chinese Journa l of T rauma and Disability Medicine, 2010, Vol� 18, No� 3 Administrator 高亮 Administrator 高亮 图 2 � 不同发酵时间的产酶量 由图 2 可知,随着发酵时间的增大, 纳豆激酶酶活性逐渐 增大, 48 小时, 酶活性达到最大, 继续发酵, 对酶活性无显著 影响。 3 发酵温度对产酶的影响 图 3 � 不同发酵时间的产酶量 由图 3可知, 不同发酵温度下的酶活力各不相同, 在 30~ 37 � 范围内发酵,酶活力最大。 4 初始 pH 对产酶的影响 图 4 � 培养基初始不同 pH 的产酶量 图 4 为不同培养基初始 pH 对酶活力的影响, 结果显示, 固体发酵产酶的最适 pH 值为 7� 0。 5 培养基含水量对产酶的影响 图 5 � 不同培养基含水量的产酶量 由图 5 可知,培养基的最适含水量为 70%。固体发酵中, 培养基含水量直接关系到氧气的供应和微生物的生长状态, 从而影响产酶量。固体发酵含水量过低, 影响营养基质的溶 解和传递以及颗粒的润胀等条件, 不利于细胞生长。含水量 过高影响透气性, 使基质成团, 影响氧的传递和发酵热的散 失,导致酶活力下降。 结论: 纳豆杆菌接种于大豆中发酵, 其最佳发酵条件为: 发酵时间 48 小时, 发酵温度 30~ 37� , 培养基初始 pH 值 7� 0, 培养基的含水量 70%。 参考文献 [ 1] � 须见洋行, 中岛伸佳,田谷直俊. Th e m e thod of determinat ion of the thrombolyt ic enzyme nat tokinase [ J ] . J Brew Soe Jap� 1993, 88( 6) : 482- 486. [ 2] � 李道棠.固态发酵[ J] .生命科学, 1992, ( 4) : 15- 17. [ 3] � 谢秋玲,郭勇� 纳豆激酶液体发酵条件的优化 [ J] .华南理工大 学学报(自然科学版) , 1999, 27( 5) ; 127- 131. [ 4] � 王正刚,丁贵平, 蔡正森.纳豆激酶的发酵工艺研究[ J ] .氨基酸 和生物资源, 2001, 23( 2) : 17- 21� [ 5] � 段金柱,曹淡君.固体发酵与液体发酵产纤维素酶产率与催化性 能的比较[ J ] .粮食与饲料工业, 2003, 3: 24- 26. (收稿日期: 2009- 10- 20) 氯诺昔康滴丸的制备工艺及质量标准研究 魏 � 凯1 � 李 � 欣2 ( 1 黑龙江天宏药业有限公司, 黑龙江 � 哈尔滨 � 150025; 2 哈尔滨市食品药品检验检测中心) 摘 � 要 � 目的:确立氯诺昔康滴丸的最佳成型工艺和研究建立氯诺昔康滴丸的质量标准。方法: 采用正交试验设计法,对药物与基质的用 量,药料温度和冷却液上部温度进行了优选。采用高效液相色谱法对滴丸中氯诺昔康进行含量测定。结果:根据实验所确定的工艺,制备 3批样 品,符合中国药典关于滴丸的规定。氯诺昔康可以用 HPLC法测定含量,氯诺昔康的线性范围在 4� 01�g/m l~ 16�03�g/ ml( r= 0� 9999) , 平均回 收率为 99� 9% , RSD% < 2� 0% ( n= 6)。结论:优选的制备工艺简便可行,所建立的质量标准能检测和确定制剂中氯诺昔康的含量,且方法简便、 灵敏、快速、准确。 关键词 � 氯诺昔康滴丸;制备工艺;氯诺昔康;高效液相色谱法 The Study on Preparation Procedure and Quality Standard of Lomoxicam Dropping Pills WEI K ai, L I X in ( H eilongjiang T imehome Pharmaceutical Co . L td. , H arbin 150025) Abstract Objective: To establish the optimized prepar ation pro cedure and st udy on quality standards of Lomoxicam Dropping Pills. Methods: Or thogonal experimental design met hod, the matrix of the drug and do sage, medicine feed the upper par t o f coo l� ant temperature and t he temperature w as prefer red. The use of high- per formance liquid chromat og raphy pills in Lomox icam fo r determinat ion. Results: Acco rding to t he labo rato ry to determine the pr ocess to pr epar e the sample batch 3, in line w ith the Chi� nese Pharmacopoeia on t he P ill. L o rnox icam H PLC method can be content , lornox icam in the linear r ange of 4. 01�g/ ml ~ 16. 03�g / ml ( r = 0. 9999) , the aver age recovery r ate of 99. 9% , RSD% < 2. 0% ( n = 6) . Conclusion: Prepar ation of the select ion pr ocess sim ple and feasible, the establishment of quality st andards to detect and identif y ag ent s in lornoxicam content , and the met hod is sim ple, sensit ive, rapid and accurate. Key words� Lomoxicam Dropping P ills; P reparation pr ocedure; Lomox icam; H PLC 中图分类号: R 914 � � � � 文献标识码: A � � � � 文章编号 : 1673 � 6567( 2010) 03� 0036� 03 �36� 中国伤残医学 2010年 18 卷第 3 期 � � Chinese Journal o f T rauma and Disabilit y Medicine, 2010, Vo l� 18, No� 3 �