食品卫生微生物学检验 大肠埃希氏菌O157：H7 NM检验GBT 4789.36-2008

ICS07．100．30 C53 中华人民共和国 囝亘 国家 食品卫生微生物学检验 大肠埃希氏菌0157：H7／NM检验 2008-05-16发布 Microbiologicalexaminationoffoodhygiene— ExaminationofEscherichiacoliO157：H7／NM 2008-11-01实施 宰蔷者纛蕹宠麟鍪发布中国国家标准化管理委员会“1” 刖 罱 GB／T4789．36—2008 本标准分为四法，分别为： ——第一法：常规培养法； ——第二法：免疫磁珠捕获法； ——第三法：全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法； ——第四法：全自动病原菌检测系统筛选法。 本标准的第一法修改采用了美国食品药品管理局(FDA)《细菌分析手册》第4A章(2002年)(Bac— teriologiealAnalyticalManual，Chapter4A，2002)；第二法修改采用了北欧食品分析委员会(NMKL) No．164，1999；第三法修改采用了国际分析家学会(AOACINTERNATIONAL)AOAC-RIPerform anceTestedMethodsVIDASE．Coli0157(ECO)Test，No．010502；第四法修改采用了AOAC—RIPer— formanceTestedMethodsBAXE．Coli0157：H7，No．050501。 本标准的第一法与美国FDA／BAM方法相比主要差异如下： ——增菌培养基以mEC+n肉汤替代了EEB肉汤。 ——增加了CHROMagar0157显色培养基。 本标准的第二法与NMKL，No．164，1999的方法相比主要差异如下： ——增菌培养基以mEC+n肉汤替代了mTSB肉汤。 ——修改增菌培养温度41．5℃土0．5℃为36℃±l℃。 一一增加了CHROMagar0157显色培养基。 本标准的第三法与AOAC-RIPerformanceTestedMethodVIDASE．Coli0157(ECO)Test，No． 010502的方法相比主要差异为增菌培养基以mEC+n肉汤替代了mTSB肉汤。 本标准的第四法与AOAc—RIPerformanceTestedMethodsBAXE．Coli0157：H7，No．050501的 方法相比主要修改为生肉以外的其他食品增菌培养基以mEC+n肉汤替代了EEB肉汤。 本标准的附录A为性附录。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。 本标准参与起草单位：河南省疾病预防控制中心、北京市疾病预防控制中心、浙江省疾病预防控制 中心、吉林省疾病预防控制中心、湖北省疾病预防控制中心、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中 国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：刘秀梅、廖兴广、张秀丽、陈倩、程苏云、刘桂华、谢茂慧、李晓虹、田静。 1范围 食品卫生微生物学检验 大肠埃希氏菌0157：H7／NM检验 GB／T4789．36--2008 本标准规定了食品中大肠埃希氏菌0157：H7和0157：NM的检验方法。 本标准适用于食品和食物中毒样品中大肠埃希氏菌0157：H7和0157：NM的检验。 2设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。 2．1天平：感量0．1g、0．01g。 2．2均质器。 2．3冰箱：2℃～5℃。 2．4恒温培养箱：36℃土1℃。 2．5恒温水浴箱：46℃±0．5℃，loo℃。 2．6生物显微镜：10×～100×。 2．7细菌浓度比浊管：MacFarland0．5号或浊度计。 2．8无菌锥形瓶：500mL，250mL。 2．9无菌平皿：直径90mm。 2．10无菌试管：10mm×75mm。 2．11无菌吸管：1mL(具0．01mL刻度)，10．0mL(具0．1mL刻度)或微量移液器及吸头。 2．12pH计或pH比色管或精密pH试纸。 2．13长波紫外光灯：366nm，功率≤6W。 2．14磁板、磁板架、DynalMXl样品混合器”。 2．15全自动微生物鉴定系统(VITEK)”。 2．16全自动酶联荧光免疫分析仪(miniVIDAS或VIDAS)”。 2．17全自动病原菌检测系统(BAx系统)”。 3培养基和试剂 3．1改良EC肉汤(mEc+n)：见第A．1章。 3．2改良山梨醇麦康凯(CT—SMAC)琼脂：见第A．2章。 3．3亚碲酸钾(AR级)。 3．4头孢克肟(Cefixime)。 3．5三糖铁(TSI)琼脂：见第A．3章。 1)由挪威Dynal公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不示对该产品的认 可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。 2) 由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品 的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。 3) 由美国杜邦公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。 如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。 】 GB／T4789．36—2008 3．6 4一甲基伞形酮一p—D一葡萄糖醛酸苷(MuG)。 3．7月桂基磺酸盐胰蛋白胨肉汤一MUG(MUG—LsT)：见第A．4章。 3．8氧化酶试剂：见第A．5章。 3．9革兰氏染色液：见第A．6章。 3．10大肠埃希氏菌0157和H7诊断血清或0157乳胶凝集试剂。 3．11 API20E生化鉴定试剂盒或VITEK—GNI+鉴定卡”。 3．12半固体琼脂：见第A．7章。 3．13改良科玛嘉(CHROMagar)0157弧菌显色琼脂4’或其他同等质量的0157显色琼脂：见第A．8章。 3．14改良麦康凯(cT_MAc)肉汤：见第A．9章。 3．15抗一E．coli0157免疫磁珠(DynalASA，Oslo，Norway)”或其他同等质量的抗一E．coli0157免疫 磁珠。 3．16PBS-Tween20洗液：见第A．10章。 4检验程序 检验程序见图1。 第一法常规培养法 检样 25g(mL)+225n止改良EC内汤(mEC+Ⅱ)．均质225mL 36℃±1℃I18h～24h CT-SⅣLaC平扳和改良CHROMagar0157显色琼脂平板 36℃±l℃ 18h～24h 挑取可疑菌落5个～1。十．氧化酶阴性，革兰氏阴性杆菌接种TsI MUG．LST 36℃±1℃ 18h～24h 阳性 f f 阴性 f l J 非0157细菌 血清学试验 生化试验 I J 报 告 图1大肠埃希氏菌0157：H7和0157：NM常规法检验程序 2 4)由法国科玛嘉公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认 可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。 5操作步骤 GB／T4789．36—2008 5．1增菌 样品采集后应尽快检验。若不能及时检验，可在2。C～4℃保存18h。以无菌操作取检样25g (mL)加入到含有225mLmEC+n肉汤的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质lmin～2min；或放人 盛有225mLmEC+n肉汤的均质杯中，8000r／min～10000r／min均质1min～2rain，于36℃土1℃ 培养18h～24h。同时做阳性及阴性对照。 5．2分离 取增菌后的mEC+n肉汤，划线或取0．1mL涂布接种于CT-SMAC平板和改良CHROMagar 0157弧菌显色琼脂平板上，于36*(2士IT培养18h～24h，观察菌落形态。必要时将混合菌落分纯。 在CT—SMAC平板上，典型菌落为不发酵山梨醇的圆形、光滑、较小的无色菌落，中心呈现较暗的灰褐 色；发酵山梨醇的菌落为红色；在改良CHROMagar0157弧菌显色琼脂平板上为圆形、较小的菌落，中 心呈淡紫色一紫红色，边缘无色或浅灰色。 5．3初步生化试验 在CT—SMAC和改良CHROMagar0157弧菌显色琼脂平板上挑取5个～10个典型或可疑菌落， 分别接种TSI琼脂，同时接种MUG—LST肉汤，于36℃-kI。C培养18h～24h。必要时进行氧化酶试验 和革兰氏染色。在TSI琼脂中，典型菌株为斜面与底层均呈阳性反应呈黄色，产气或不产气，不产生硫 化氢(H：S)。置MUG—LST肉汤管于长波紫外灯下观察，无荧光产生者为阳性结果，有荧光产生者为 阴性结果；对分解乳糖且无荧光的菌株，在营养琼脂平板上分纯，于36。C士l℃培养18h～24h，并进行 下列鉴定。 5．4鉴定 5．4．1血清学试验 在营养琼脂平板上挑取分纯的菌落，用0157：H7标准血清或0157乳胶凝集试剂作玻片凝集试 验。对于H7因子血清不凝集者，应穿刺接种半固体琼脂，检查动力，经连续传代3次，动力试验阴性， H7因子血清凝集阴性者，确定为无动力株。 5．4．2生化试验 用APl20E生化鉴定试剂盒或VITEK—GNI+检测卡，按照生产商提供的使用说明进行。大肠埃希 氏菌0157：H7／NM生化反应特征见表1。 表1 大肠埃希氏菌0157：It7／NM生化反应特征 生化试验 特征反应 三糖铁琼脂 底层及斜面呈黄色，硫化氢(Hzs)阴性 山梨醇 阴性或迟缓发酵 靛基质 阳性 MR—VP MR阳性，VP阴性 氧化酶 阴性 西蒙氏柠檬酸盐 阴性 赖氨酸脱羧酶 阳性(紫色) 鸟氨酸脱羧酶 阳性(紫色) 纤维二糖发酵 阴性 棉子糖发酵 阳性 MUG试验 阴性 动力试验 有动力或无动力 GB／T4789．36--2008 5．5结果报告 综合生化和血清学的试验结果，报告25g(mL)样品中检出或未检出大肠埃希氏菌0157：H7／NM。 在样品中检出0157：H7或0157：NM时，如需要进一步检测Vero细胞毒素基因的存在，可通过接种 Vero细胞或Hela细胞，观察细胞病变进行判定，也可使用基因探针检测和聚合酶链反应(PCR)方法或 送参考实验室进行志贺氏毒素基因(stxl、stx2)、eae、hly基因等的检测。 第二法 免疫磁珠捕获法 6原理 免疫磁珠捕获技术是通过对目的细菌进行选择性增菌，然后利用免疫磁珠进行选择性捕获的方法。 捕获的目的细菌被结合到由抗体包被的磁性颗粒上，收集后再将磁性颗粒涂布到选择性琼脂平板上进 行分离。在CT-SMAC平板上生长的可疑的大肠埃希氏菌0157，因为不分解山梨醇，或在E．coli0157 显色琼脂平板上产生特定的酶促反应呈现颜色变化，而与其他细菌相区别。 免疫磁珠的应用，特别是在样品含有大量杂菌时，对检样中含有少量的大肠埃希氏菌0157：H7／ NM的检出提供了更大的可能性。 7检验程序 检验程序见图2。 检样 25g(mL)+225mL改良EC肉汤(mEC+n)，均质225rnl 36℃±l℃ 免疫磁璩捕获 涂布CT-SNLAC平板和改良CHROMagar0157弧菌显色琼脂平板 36℃±1℃ 拂取可疑菌落5个～1。个，氧化酶阴性，革兰氏阴性杆菌接种TsI MUG．LST 36℃±1℃ 阳性 阴性 | J l 非0157细菌 血清学试验 生化试验 I l 报 告 图2大肠埃希氏菌0157免疫磁珠捕获法检验程序 8操作步骤 GB／T4789．36—2008 8．1增菌 同5．1。 8．2免疫磁珠捕获与分离 应按照生产商提供的使用说明进行免疫磁珠捕获与分离。当生产商的使用说明与下面的描述可能 有偏差时，按生产商提供的使用说明进行。 8．2．1将Eppendorff管按样品和质控菌株进行编号，每个样品使用1支Eppendorff管，然后插入到磁 板架上。在漩涡混合器上轻轻振荡E．coli0157免疫磁珠溶液后，用开盖器打开每支Eppendorff管的 盖子，每管加入20pLE．coli0157免疫磁珠悬液。 8．2．2取mEc+n肉汤增菌培养物1mL，加入到EppendorfI管中，盖上盖子，然后轻微振荡10s。每 个样品更换1支加样吸头，质控菌株必须与样品分开进行，避免交叉污染。 8．2．3结合：在18℃～30"C环境中，将上述Eppendorff管连同磁板架放在DynalMXl样品混合器上 转动或用手轻微转10min，使E．coli0157与免疫磁珠充分接触。 8．2．4捕获：将磁板插入到磁板架中浓缩磁珠。在3min内不断地倾斜磁板架，确保悬液中与盖子上 的免疫磁珠全部被收集起来，此时，在Eppendorff管壁中间明显可见圆形或椭圆形棕色聚集物。 8．2．5吸取上清液：取1支无菌加长吸管，从免疫磁珠聚集物对侧深入液面，轻轻吸走上清液。当吸到 液面通过免疫磁珠聚集物时，应放慢速度，以确保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠，则 应将其放回到Eppendorff管中，并重复8．2．4步骤。每个样品换用1支无菌加长吸管。 免疫磁珠的滑落：某些样品特别是那些富含脂肪的样品，其磁珠聚集物易于滑落到管底。在吸取上 清液时，很难做到不丢失磁珠，在这种情况下，可保留50pL～100pL上清液于Eppendorff管中。如果 在后续的洗涤过程中也这样做的话，脂肪的影响将减小，也可达到充分捕获的目的。 8．2．6洗涤：从磁板架上移走磁板，在每支Eppendorff管中加入lmLPBS-Tween20洗液，转动磁板 架三次以上，洗涤免疫磁珠混合物。重复上述步骤8．2．4--8．2．6。 8．2．7重复上述步骤8．2．4～8．2．5。 8．2．8免疫磁珠悬浮：移走磁板，将免疫磁珠重新悬浮在100pLPBS-Tween20洗液中。 8．2．9涂布平板：用漩涡混合器将免疫磁珠混匀，用加样器各取50pL免疫磁珠悬液分别转移至CT- SMAC平板和改良CHROMagar0157弧菌显色琼脂平板一侧，然后用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平 板的一半，再用接种环划线接种平板的另一半。待琼脂表面水分完全吸收后，翻转平板，于36。C±1"C 培养18h～24h。 注：若CT—SMAC平板和改良CHROMagar0157弧菌显色琼脂平板表面水分过多时，应在37℃下干燥10min～ 20rain，涂布时避免将免疫磁珠涂布到平板的边缘。 8．3菌落识别 E．coli0157：H7／NM在CT-SMAC平板和改良CHROMagar0157弧菌显色琼脂平板上的菌落 特征见5．2。 初步生化试验：同5．3。 8．4鉴定 同5．4。 8．5结果报告 同5．5。 5 GB／T4789．36—2008 9原理 第三法 全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法 miniVIDAs或VIDAS大肠埃希氏菌0157(ECO)分析，是在自动VIDAS仪器上进行的双抗体夹 心酶联荧光免疫分析(ELFA)方法。固相容器(SPR)用抗大肠埃希氏菌0157抗体包被，各种试剂均封 闭在试剂条内。煮沸过的增菌肉汤加入试条孔后，在特定时间内样本中的0157抗原与包被在SPR内 部的0157抗体结合，未结合的其他成分通过洗涤步骤清除。标记有碱性磷酸酶的抗体与固定在SPR 壁上的0157抗原结合，最后洗去未结合的抗体标记物。SPR中所用荧光底物为磷酸4一甲基伞型物。 结合在SPR壁上的酶将催化底物转变成具有荧光的产物：4一甲基伞形酮。VIDAS光扫描器在波长 450nm处检测该荧光强度。试验完成后由VIDAS自动分析结果，得出检测值，并打印出每份样本的检 测结果。 10仪器 miniVIDAS或VIDAS。 11试剂 1 1．1 E．coli0157试剂条(VIDASECO)。 11．2校正液：纯化灭活的E．coli0157抗原标准溶液。 11．3阳性对照。 11．4阴性对照。 11．5MLE卡。 12操作步骤 12．1前增菌 以无菌操作取检样25g(mL))N人到含有225mLmEC+n肉汤的均质袋中，在拍击式均质器上连 续均质lmin～2min；或放人盛有225mLmEC+n肉汤的均质杯中，8000r／min～10000r／rain均质 l min～2min。于36℃±l℃培养6h～7h。同时做用性及阴性对照。 12．2增菌与处理 取1mL前增菌肉汤接种于9mL改良麦康凯肉汤(CT—MAC)，于36E土1℃培养17h--19h。然 后取1mL增菌的CT-MAC肉汤加入试管中，在100℃水浴中加热15min。剩余增菌肉汤存于2℃～ 8。C，以备对阳性检测结果确认。 12．3上机操作 12．3．1输入MLE卡信息 每个试剂盒在使用之前，首先要用试剂盒中的MLE卡向仪器输入试剂规格(或曲线数据)。每盒 试剂只需输入一次。 12．3．2校正 在输入MLE卡信息后，使用试剂盒内的校正液进行校正，校正应做双份测试。以后每14天进行 一次校正。 12．3．3检测 取出试剂条，待恢复至室温后进行样本编号。 建立工作列表(worklist)，输入样本编号。 分别吸取500pL对照和样本(冷却至室温)加入到试剂条样本iL中央。依屏幕提示，将试剂条放人 6 GB／T4789．36—2008 仪器相应的位置。 所有分析过程均由仪器自动完成，检测约需45min。 12．4结果报告 检测值是由每份样本的相对荧光值(RVF)与标准溶液RVF相比得出，见式(1)。 检测值一瀑器 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯(1) 若检测值