免疫组织化学染色-董建强G

免疫组织化学染色 .第十章 免疫组织化学染色 第1节 规范化的组织标本固定 近年来，免疫组织化学、组织细胞原位分子杂交等分子病理学技术从病理学科学研究的逐步发展成为临床病理诊断不可或缺的技术手段。病理诊断和病理技术学者都对规范化、化的组织标本固定给予高度的关注。通过大量长时间的探索与实践基本形成了对现代组织固定的基本要求：良好地保存细胞组织的形态结构、尽可能地减少对细胞和组织抗原性及核酸分子的破坏。 在临床病理实验室的日常工作中，造成免疫组织化学染色和原位分子杂交以及荧光原位分子杂交结果不良或失败的相当大部分原因是组织细胞没有得到及时适时适度的良好固定。对于临床病理标本而言，由于无法事先决定某一标本除常规切片HE染色外是否需要进行免疫组织化学染色等工作因此，对全部送检病理标本进行标准化的固定是极为必要的。标准化固定基本包含以下三点。 1. 及时固定： 所谓及时固定是指标本离体应立即浸泡 至相当于标本体积4到6倍量的标准固定液中。在实际工作中，活检标本包括胃肠镜活检标本、肿物及肝肾穿刺标本大多能够得到及时的固定。在大多数情况下，各类大中型手术标本均未达到要求。由于专业的不同临床医师往往不能理解或忽略现代病理诊断对标本固定的要求。因此，病理医师应与临床医师进行必要的沟通。此外医院在医疗检验质量控制体系中应建立标本的固定制度从体制上对标本的固定给予保证。 2．使用标准的固定液 虽然采用不同的固定液可以对不同类型的抗原物质进行最大程度的保户，但就可操作性而言在临床病理工作中，10％标准缓冲福尔马林－10/% Neutual buffered formalin NBF－是兼顾保存组织形态和抗原性通行的被广泛接收的选择。应当指出的是，目前临床病理诊断常用的绝大多数抗体都可识别福尔马林固定的表位－Formalin fixed epitope FFE。 3．适度适时的固定 适度适时的固定是指以组织标本达到可以良好的保存形态结构的固定时间, 过度的固定会导致组织抗原性的过份丢失。一般而言，大中型手术标本只要做到及时切开进行固定在室温12小时即可，为了适应免疫组织化学染色标准化的需要通常不应将固定时间超过24小时。 固定1天c-erbB-2染色阳性 同一例标本固定7天后c-erbB-2染色呈阴性 对于取材时未经固定或位于标本内部尚未良好固定的组织应进行补充固定。为了适应免疫组织化学染色和及时发出病理报告的需要，对于临床病理而言建议在取材后的组织脱水程序中对标本进行补充固定。即在组织脱水机上使用NBF1、NBF2两次每次固定60分钟。 对于取材后经NBF固定3－8小时的标本如不能及时进入组织脱水程序建议将标本置入70％乙醇中进行保存直至进入组织脱水程序为止。 第2节 组织脱水透明浸蜡的规范化 由于大量的免疫组织化学染色被应用于临床病理诊断和鉴别诊断，在近十余年的应用实践中病理医师和技师观察到大量的免疫组织化学实验结果（即使使用同一克隆的抗体）在同一实验室或不同实验室之间存在着较大差异。产生此种差异的原因大多数源于在同一实验室或不同实验室之间，组织固定脱水透明浸蜡的处理程序的不规范。因此，组织处理程序的规范化是克服免疫组织化学实验结果在同一实验室或不同实验室之间存在较大差异的有效手段。 组织处理程序的规范化是指对参与组织处理的试剂以处理的标本数量为标准进行规律性的更换。具体的方法请参考有关章节。 第三节 免疫组织化学染色的基本技术 1. 组织切片的染色前处理（见第四节） 2. 三步法免疫组化染色技术流程： 1） 切片脱蜡至水 2） PBS 洗3分钟两次 3） 抑制内源性过氧化物酶 4） 进行必要的抗原修复 5） PBS 洗3分钟两次 6） 封闭内源性生物素-使用30%蛋清水溶液或商品化专用封闭试剂处理15分钟 7） PBS 洗3分钟两次 8） 使用二抗同种动物血清或专用试剂封闭天然抗体及不纯抗体 9） 弃封闭试剂直接滴加第一抗体室温2小时或40C过夜 10).PBS 洗3分钟两次 11).滴加第生物素化二抗体室温20分钟 SHAPE \* MERGEFORMAT 11) . PBS 洗3分钟两次 12) . 滴加三抗酶复合物 13) . PBS 洗3分钟两次 14) . DAB显色3-5分钟,镜下控制 15) .水洗终止显色 16) .复染细胞核20-60秒 17) .水洗 18) 分化水洗、返兰水洗、脱水透明、封片。 3. 两步法免疫组化染色技术流程： 1） 切片脱蜡至水 2） PBS 洗3分钟两次 3） 抑制内源性过氧化物酶 4） 进行必要的抗原修复 5） PBS 洗3分钟两次 6） 滴加第一抗体室温2小时或40C过夜 7） PBS 洗3分钟两次 8） 滴加第二抗体酶复合物室温20分钟 9） PBS 洗3分钟两次 10） DAB显色 11） 水洗终止显色 12） 复染细胞核 13） 分化水洗、返兰水洗、脱水透明、封片。 第四节 组织切片进行免疫组化染色前的处理 一．用于免疫组织化学染色的载玻片的处理 由于抗原热修复技术已经成为目前免疫组织化学染色极为常用的组织抗原暴露方法，因此为了防止切片在高温高压下脱片对用于免疫组织化学染色的载玻片进行防脱片处理十分重要。 1. APES（ 3－Aminopropyl-triethoxy silane） APES （3－氨丙基－3乙氧基硅烷）是一种常用的载玻片组织粘附剂，其作用机理是通过对洁净玻片表面进行化学修饰改变其表面的物理化学特性使载玻片增加对组织的吸附力。具体的操作方法是，载玻片经酸洗－水洗－95％乙醇洗－无水乙醇洗后烘干，在通风橱内将载玻片插入玻片架置入APES－丙酮工作液中（APES1毫升／纯丙酮50毫升）处理20秒钟、将玻片移入纯丙酮I和纯丙酮II中各漂洗5-10秒钟、用大功率吹风机吹干后装盒密封备用。 2．多聚赖氨酸（Poly-L-lysine） 多聚赖氨酸的分子结构中具有数个阳离子集团，这些阳离子集团可以与组织上的阴离子结合而产生吸附粘合作用有效地防止组织切片在免疫组化染色过程中的脱落。 具体的操作方法是，载玻片经酸洗－水洗－95％乙醇洗－无水乙醇洗后烘干，将载玻片浸入0.01%的多聚赖氨酸溶液中（试剂公司销售的多聚赖氨酸一般浓度为0.1%将其用重蒸馏水稀释10倍即可）浸泡5分钟， 将载玻片移入600C烤箱内烘烤1小时或室温干燥后装盒备用。 多聚赖氨酸防脱载玻片的另一个简便易行的制备方法是，在洁净处理后的载玻片上滴加一滴约30微升的1：5稀释的多聚赖氨酸（试剂公司销售的多聚赖氨酸一般浓度为0.1%将其用重蒸馏水稀释5倍即可）然后将另一张载玻片象封片一样与其重合，待干燥后即可使用。需要注意的是此法制做的防脱载波片仅有一面涂有多聚赖氨酸，在捞片时切记确认用涂布的一面捞取组织切片。 二.烤片 烤片的目的是使组织切片平展的与载玻片充分粘合防止脱片，一般可以在600C烤箱内烘烤4-12小时或在700C烤箱内烘烤1小时。对于抗原性较弱的组织切片可以在450C烤箱内处理过夜然后再以600C烘烤60分钟即可。 三.内源性酶的抑制 在免疫组织化学染色中，由于辣根过氧化物酶－horseradish perosidase HRP与DAB－3.3’对二氨基联苯反应形成的棕褐色标记信号具有稳定性好、不溶于有机溶剂、可使用树胶封片、可长期保存而不褪色、与常用细胞核染料苏木精对比明显的特点，因此该显色系统是目前临床病理诊断工作中免疫组织化学染色技术最常用的显色试剂。 但是在肝组织、肾组织、肌肉组织及红细胞粒细胞系统也存在较多的过氧化物酶－内源性过氧化物酶。组织内源性过氧化物酶的存在将造成显色物质DAB与其结合造成背景染色和非特异性染色。 为了避免或降低组织细胞内源性过氧化物酶对免疫组织化学染色造成的影响，一般使用0.3-3％的过氧化氢甲醇处理5－10分钟，抑制组织中的内源性过氧化物酶。此步操作一般以组织切片脱蜡浸水后进行为好。 HRP－AEC显色未抑制组织 内源性过氧化物酶造成的背景染色 近年来随着免疫组织化学检测系统敏感性的提高，大多数经10％中性副尔马林固定的组织中轻微的内源性过氧化物酶活性不会造成对免疫组织化学染色特异性信号的评估造成干扰。但是在对细胞涂片和冰冻切片进行免疫组织化学染色时，抑制内源性过氧化物酶是必要的。 四.酶消化 酶消化是通过采用不同种类、不同浓度的蛋白酶处理组织切片，以便暴露组织细胞上抗体结合位点（抗原决定族）的技术方法。1. 胰蛋白酶 胰蛋白酶使用的浓度在0.05－0.1％范围内。配制方法：在100毫升PH7.8的无水氯化钙溶液中加入0.1克胰蛋白酶。作用时间为37度15－30分钟。 2. 胃蛋白酶 胃蛋白酶使用的浓度为0.4％。配制方法：在100毫升0.1mol/L 盐酸中加入0.4克胃蛋白酶。作用时间一般为10－30分钟。 未经酶消化的切片仅呈微弱阳性 切片经消化后呈强阳性染色 五.抗原热修复 1.抗原热修复的目的 由于病理组织学常规使用的甲醛固定剂可以造成蛋白质的交联，即在氨基酸分子间形成亚甲基桥从而造成部分或大部分抗原结合位点（抗原决定族）的封闭。通过抗原热修复可以有效地使抗原结合位点重新暴露。 2．抗原热修复的方法 1）水浴法： 水浴抗原修复方法是在恒温水浴设备中进行抗原热修复的技术。具体方法是： · 将盛有抗原修液的烧杯置入水浴设备中加热至950C--990C。 · 将脱蜡浸水蒸馏水洗过的切片置入抗原修复液中加热处理18分钟。 · 将烧杯连同抗原修复液和被修复的组织切片一起置入冷水中进行隔水降温至室温。 · PBS洗3分中进行后续免疫组织化学染色。 水浴抗原修复方法的优点是技术方法稳定作用温和不易脱片，但是一般认为这一方法的抗原修复效果低于高压锅方法，建议采用该方法进行抗原修复时最好使用高PH值的抗原修复液。 2）高压法: 高压抗原修复方法是利用高压锅进行抗原热修复的技术。具体方法是： · 将盛有抗原修复液的高压锅在电磁炉上加热至沸腾。 · 将脱蜡浸水蒸馏水洗过的切片置 入抗原修复液中加盖进行热处理。当高压锅气阀喷气后计时2.5到3分钟。 · 将高压锅置入冷水降温至室温取出切片。 · PBS洗3分中进行后续免疫组织化学染色。 高压抗原修复方法的优点是暴露抗原决定簇的效果较好，但比较易于造成组织切片的脱落。在免疫组织化学染色实践中发现使用高压锅方法进行抗原热修复有修复过头造成背景染色的现象，建议使用该方法进行抗原修复时如非必要应避免使用高PH值的抗原修复液。 3）微波法： 微波抗原修复法是较早采用的抗原修复技术方法是： · 将脱蜡浸水后的组织切片置入盛有抗原修复液的容器中。 · 将容器置入微波炉内高档加热至修复液沸腾。 · 将微波炉调至低档维持加热10分钟。 · 将容器连同修复液和切片移出微波炉降至室温。 · PBS洗3分中进行后续免疫组织化学染色。 微波修复方法虽然能够达到抗原修复的目的，但是由于微波炉的型号不同功率不同修复的稳定性较差，因此在使用中应根据所使用微波炉的具体情况摸索使用经验掌握规律。微波抗原修复的另一个问题是在同时修复的组织切片中以及在同一切片的不同部位可能出现修复效果不均匀的现象。 水浴修复10分钟弱阳性 高压修复后呈中度阳性 六.抗原修复液 由于不同类型的抗原决定簇在不同PH值的抗原修复液中修复的效果不同，因此在免疫组织化学染色中应根据实践经验选用不同的抗原修复液进行抗原修复。目前常用的抗原修复液主要有： 1. PH 6.0 柠檬酸抗原修复液； 2. PH 8.0 EDTA抗原修复液； 3. PH 9.0 Tris-EDTA原修复液； 针对某种抗体的免疫组化染色，在使用抗原修复液的选择上目前通行的观点是，采用高压修复方法时最好首选PH 6.0 柠檬酸抗原修复液进行抗原修复。在修复效果不理想的情况下再选用PH 9.0 Tris-EDTA抗原修复液。在采用水浴修复方法时则首选PH 9.0 Tris-EDTA原修复液，如果修复的效果不理想或染色背景偏高时再选用PH 6.0 柠檬酸抗原修复液进行试验。 第五节 第一抗体的类型及特点 一. 单克隆抗体 Monoclonal antibodies-单克隆抗体简称单抗，可分为鼠源性单抗和兔源性单抗两种，单抗的特点是具有很高的抗原识别特异性，在免疫组化染色中使用单抗还具有非特异性染色背景低的优点。单抗的不足是由于识别抗原决定簇的特异性极高因此造成它的染色信号强度略低。 二．混合型单克隆抗体 Mixed Monoclonals antibodies-混合单抗，将针对同一蛋白质制造的，识别同一蛋白质不同抗原决定簇的单抗混合即为“混合单抗’。混合单抗在保留了单抗高特异性低背景的优点的同时提高染色的染色信号强度，目前商品化供应的单抗实际上就是混合单抗 。 三． 多克隆抗体 Polyclonals antibody-多克隆抗体简称多抗，多抗在制备上大多来源于兔和山羊，它的特点是具有较为均衡的信号特异性并且染色产生的特异性信号强度较高，但是多抗的不足是染色所产生的非特异性背景信号也比较高。 多抗的生产工艺决定了它识别蛋白质分子多识别位点的生物学特点，在临床病理肿瘤鉴别诊断实践中具有不可替代的应用价值。例如：使用S-100单抗对黑色素瘤进行免疫组化染色时,某些黑色素瘤染色为阴性，当换用S-100多抗染色时这些表达阴性的病例呈阳性结果。 第六节 第一抗体的最佳稀释度 一．目前在临床病理诊断和鉴别诊断工作中使用的第一抗体多采用即用型抗体，但是在实际工作中仍不可避免地遇到使用浓缩抗体的情况。鉴于专用抗体稀释液具有保持抗体稳定性和降低背景染色的作用，因此在对浓缩型第一抗体进行稀释时建议使用专用的抗体稀释液。 二．在对浓缩型第一抗体进行必要的最佳工作浓度测试时应遵循以下原则： 1.选择至少两例应该呈阳性表达的组织进行测试； 2.对进行测试的组织切片采用相同条件进行一抗孵育前的处理； 3.保持一抗后继试剂的一致性和作用条件的一致性； 4.通过阅读抗体说明书了解该抗体生产厂家建议的工作浓度范围； 5.采用起始浓度、中间浓度、最高浓度进行至少3个浓度梯度进行测试。例如：某一抗体的建议工作浓度范围是1：100—1：500则应选择1：100、1：250、1：500三个浓度梯度进行测试。如果第一次测试的效果不理想，可以根据第一次测试的结果在染色不足和背景染色过高的两个浓度之间再次选择中位浓度进行第二次测试。 第七节 免疫组化染色系统 一．三步法 生物素系统 所谓三步法狭义上讲，是特指采用生物素标记的二抗与第一抗体联接的免疫组织化学染色技术方法。由于采用第一抗体、生物素化第二抗体和抗生物素蛋白/酶复合物（三抗）三个主要生物化学反应完成染色过程，故称为三步法。 三步法也称为Streptavidin-Peroxidase法—SP法或称为Labeled Secondary Antibodies法-LSAB法。三步法的技术核心是，利用抗生物素蛋白与第二抗体上标记的生物素分子间的亲和化学反应完成免疫组织化学染色。 三步法-生物素系统免疫组化染色试剂盒的典型代表有SP系列检测试剂盒和LSAB系列检测试剂盒。 1. SP系列即用型检测试剂盒：SP系列即用型检测试剂盒，分为通用型、抗兔型、抗小鼠型和抗山羊型四种包装类型。通用型可用于检测大鼠、小鼠、兔和豚鼠来源的一抗。抗兔型、抗小鼠型和抗山羊型则仅用于检测相应动物来源的第一抗体。 2. LSAB系列检测试剂盒，分为LSAB2-第二代兔/小鼠通用型试剂盒和LSAB+兔/小鼠/山羊通用型试剂盒。就检测的敏感性而言，LSAB+兔/小鼠/山羊通用型试剂盒优于LSAB2-第二代兔/小鼠通用型试剂盒。 二．两步法 非生物素系统 以生物素标记第二抗体为核心的三步法免疫组织化学染色技术存在着染色过程复杂、技术原理上无法回避组织内源性生物素的干扰等不足。 1995年多聚螯合物/酶两步法诞生。两步法的技术核心是，将多个二抗分子和多个酶分子结合在一个大分子聚合物上形成一个螯合物结构与一抗分子结合完成免疫组化染色。两步法的代表试剂EnVision 法是在葡聚糖分子骨架上结合第二抗体和酶分子；PowerVision法则是在多聚糖分子骨架上结合第二抗体和酶分子。 两步法由于反应体系中不含有生物素分子，因此得名《非生物素法》也因此从技术上克服了组织内源性生物素造成的非特异性背景染色。 两步法技术的另两个优点是，其一：由于第二抗体和酶分子共同连接在聚合物上，因此省却了第三抗体的染色从而使染色过程简化。其二：由于敏感性大幅度的提高使第一抗体的稀释度大幅度提高、抗体孵育时间缩短、因此使源于非特异性抗体反应造成的背景染色大为降低。在三步法试剂的标准包装中都含有封闭血清用于抑制源于非特异性抗体反应造成的背景染色。目前两步法试剂已不提供封闭血清，事实上采用两步法进行免疫组织化学染色一般已不需进行血清封闭。 两步法-非生物素系统免疫组化染色试剂盒的典型代表有EnVision 系列检测试剂盒和PowerVision系列检测试剂盒。 1.EnVision 系列检测试剂盒：EnVision 系列检测试剂盒分为EnVision和EnVision+两个品种，他们都属于即用型试剂。其中EnVision仅提供兔/小鼠通用型，本型即可用于兔源一抗的检测也可用于小鼠来源一抗的检测。EnVision+试剂盒除提供兔/小鼠通用型外尚可提供兔或小鼠单标型，所谓单标型即兔单标型仅可用于标记检测兔源性第一抗体，而小鼠单标型仅可用于标记检测小鼠源性第一抗体。 2. PowerVision系列检测试剂盒: PowerVision系列检测试剂盒也是即用型试剂，该系列提供以下五种可选用的剂型包括兔/小鼠通用型，和兔、小鼠、山羊、大鼠单标型。PowerVision系列由于提供了山羊和大鼠单标型试剂，使得我们在使用山羊或大鼠来源的第一抗体进行免疫组织化学染色时，也能使用两步法-非生物素系统方法进行简便、快速、敏感、低背景的免疫组化染色技术。 两步法-非生物素系统在技术原理上较三步法-生物素系统更为先进，目前两步法已逐步取代三步法成为临床病理诊断和鉴别诊断以及科研实验工作中使用的主流技术方法。 第8节 使用三步法-生物素系统试剂进行免疫组化染色应注意的问题 目前三步法-生物素系统试剂由于相对价廉质优因此尚有应用。在使用三步法-生物素系统试剂进行免疫组化染色时应注意克服内源性生物素的干扰。 封闭组织内源性生物素可以使用蒸馏水稀释的30%浓度的蛋清溶液处理15分钟，或使用专用的商品化封闭试剂。 未经封闭的组织内源性生物素背景染色 同一组织封闭后内源性生物素被封闭 在采用生物素进行免疫组织化学染色时由于某些组织内源性生物素含量较高，或由于抗原修复造成内源性生物素被激活，或由于封闭的不足和失败常造成很强的背景染色以致与目的染色信号不易鉴别应特别加以注意。 肝肿瘤SP法肿瘤与瘤旁组织均呈强阳性 在上图中显示一例肝肿瘤组织采用三步法SP试剂进行免疫组织化学染色，下半部份的肿瘤组织和上半部份的瘤旁正常肝组织均呈现较强的阳性染色。 两步法EnVision+染色仅瘤组织阳性 上图显示同一例组织采用两步法EnVision+染色后仅肿瘤组织呈现阳性染色，瘤旁相对正常肝组织与瘤组织对比分明呈阴性。 除肝组织外，小肠组织、乳腺组织、甲状腺组织和肾脏组织及其肿瘤也是内源性生物素含量较为丰富的组织。因此在应用生物素法进行此类组织的免疫组化染色时对 内源性生物素可能造成的假阳性染色应特别加以注意。 SP法未加一抗曲管上皮假阳性染色 SP法阳性信号与曲管上皮假阳性染色 两步法EnVision+染色背景染色被消除 第9节 免疫组化的显色及显色控制 免疫组织化学的呈色是依靠酶和底物色原进行化学反应完成的。最常使用的DAB（3`3对二氨基联苯）底物显色溶液的配制是将6mgDAB溶解于10ml 0.05M / PH7.6的Tris缓冲液中，然后加入0.1ml 0.3%过氧化氢混合均匀。将配制好的DAB显色溶液滴加到组织切片尚在室温下孵育3-8分钟即可完成显色过程。 在商品化的免疫组化二抗试剂盒中一般都含有显色试剂提供或单独提供显色试剂盒。 在显色过程中，如果加入DAB显色溶液后的1分钟内组织切片迅速的呈现棕黄色随着时间的延长出现明显的背景染色提示第一抗体的工作浓度偏高。反之当显色进行5或6分钟后组织切片显色依然较淡，说明第一抗体的工作浓度偏低或抗原修复不足。正确的显色应首先观察同一抗体染色的阳性对照片，以阳性对照片的显色为依据判断显色的程度。 ER染色正常的显色强阳性 同一病例切片在免疫组化染色中各步骤的染色条件相同相同的情况下，由于对显色程度的把握能力不足，显色时间稍短导致显色不足，造成在对ER表达程度的判断级别降低。 同一例切片显色不足仅呈中度阳性表达 第10节 免疫组化的复染 免疫组化的复染即细胞核染色。在HE染色中细胞核染色是主色，而在免疫组化染色中细胞核染色则属附色。核染色过深的效果是喧宾夺主使组化染色的信号不突出，反之则不能达到清晰的显示组织结构，对比衬托组化阳性信号的作用。 复染过深使得阳性信号反而不突出 细胞核染色略浅对比不明显 以上两张图片显示细胞核染色过深或不足造成最终染色结果的缺陷。 上图显示细胞核染色适度与组化染色形成鲜明的对比衬托作用，使组织结构与阳性信号形成良好的相互衬托效果。 为了达到良好的细胞核染色的目的，细胞核染色的染色液应保持新鲜并定时更换。此外对细胞核染色后的分化和返兰应给予重视。 细胞核染色正常但分化不足 细胞核染色分化良好 第十一节 影响免疫组织化学染色质量的因素及免疫组织化学染色的质量控制和规范化 一. 影响免疫组织化学染色质量的因素 免疫组织化学染色技术是一个技术流程繁复，影响技术质量因素众多但又极为重要的实用病理学诊断技术。在整个技术操作流程中，几乎每一步操作的失误都或对技术细节的疏忽都会对最终的结果产生影响。 以下以c-erbB-2免疫组织化学染色为例分析影响组化染色质量的诸因素。 1. 免疫组化的质量控制从手术室的标本固定开始。及时地对手术标本进行固定是免疫组化质量控制的第一步。鉴于固定液对组织的穿透速度较慢，对于大型手术标本提倡由专业人员记录标本形态后切开固定。对于食管、胃肠等空腔器官的标本应剖开后固定。未能及时固定的组织内，由于细胞内酶的作用和随后开始的细菌分解，会造成细胞的变性和自溶导致结构的破坏和抗原物质的弥散。在组化染色时表象为抗原定位的变化和背景染色的增高。 2. 适度的固定和及时的取材。由于醛类固定液属于交联性固定剂会造成蛋白质氨基酸分子间的化学系交联，因此过度的固定会造成抗原决定簇的封闭和抗原的丢失。对于需要对免疫组织化学染色结果进行定量评价的基因表达蛋白和受体蛋白而言，由于过度的固定所造成的抗原决定簇的封闭和抗原的丢失是致命性的。 固定1天c-erbB-2染色 +++ 同一标本固定7天c-erbB-2染色 ++ 以上两图显示过度固定造成对染色强度级别判断造成的影响。因此组织标本取材应在24小时内完成，避免固定取材的随意性是保证免疫组化染色质量的重要的第一步。 3. 脱蜡步骤应尽量充分，由于温度低或脱蜡剂陈旧造成的脱蜡不足，会影响抗体与组织细胞的充分结合造成片块状染色不均。 4. 抗原修复环节的影响： 图A显示微波抗原修复 图B显示水浴抗原修复 图C显示高压抗原修复 抗原修复环节是影响组化质量的极为重要的环节。在抗原修复环节，不同的修复方法、不同的修复条件、不同的抗原修复液都会对最终的结果产生影响。、以上A、B、C三张图片显示，同一组织连续切片进行不同的抗原修复处理，结果完全不同并且足以影响对染色强度级别的判断。因此必须对抗原修复的方法加以优化选择和规范才能避免由此造成的对染色结果的错误判断。 5. 第一抗体的影响：不同类型、不同克隆来源的第一抗体，对同一病例同一标本切片，在其他技术条件相同的情况下染色结果会产生较大的差异。 多克隆抗体的表达强度 单克隆抗体A的表达强度 单克隆抗体B的表达强度 为了克服由于第一抗体不同造成的影响，应熟悉和掌握检测同一抗原的不同抗体的特点加以选择和正确地使用。 6. 检测试剂盒造成的影响：不同的组化检测试剂盒由于采用的技术方法存在差异，因此敏感性不同并导致组化染色的结果不同。 以上两图显示同一病例同一组织块的切片，染色条件相同，由于使用了两个不同的检测试剂盒大致最终的染色结果完全不同。为了避免由此造成的失误选用质量优化稳定的试剂盒是稳定治疗的有效方法。 7. DAB 显色试剂的影响：自行配制的 显色剂和商品化的显色剂以及不同厂商制造的DAB 显色剂之间存在着显色能力的差距。 以上两张图片显示，来自同一组织块的连续切片在其他组化染色条件相同的情况下由于显色剂DAB 的不同足以造成对染色强度级别判断的不同。熟悉不同DAB 试剂的特性、选择质量稳定的试剂、严格的按照相同的显色条件进行日常免疫组化实验是控制显色质量稳定的有效方法。 二．免疫组织化学染色的质量控制和规范化 免疫组织化学实验技术在临床病理诊断和鉴别诊断工作中发挥着极为重要的作用。在肿瘤个性化治疗的今天，同一实验室免疫组化实验技术的稳定性和可重复性、不同实验室间实验结果的一致性和可重复性问题亟待解决。对于实验技术流程、实验条件和实验试剂也应加以规范。 在本节的第一部分以c-erbB-2免疫组织化学染色为例分析了影响组化染色质量的诸因素。在实际工作中，为了将来自各方面的影响减少到最低程度，应注意以下几个主要问题。 1．建立严格的标本固定取材制度，首先要保证病理标本的及时固定，对于大标本还应切开固定。及时的固定是保证免疫组织化学染色实验质量的基石。此外尚应注意适度的固定和及时的取材，不要随意的延长或缩短固定的时间。 2．在组织脱水程序中建议设置两个后固定步骤。由于临床病理对病理报告及时性的要求，许多病理标本取材时固定不良，适当的取材后固定可以弥补由于固定不良造成的组织形态缺陷和抗原定位不良现象。 3．建立以处理组织标本块数为标准的组织脱水试剂规范化更换制度。保证组织脱水质量是保证组织切片质量的前提，这一点对免疫组织化学染色技术而言更为重要。 4．把好一抗关选择优良的抗体试剂，对检测同一抗原的第一抗体最好通过对比实验选择表达稳定良好的抗体并坚持使用，在更换某个抗体时病理技师和医师应及时沟通，以便保证对染色结果的判断一致性。 5．在测试实验的基础上建立每一种抗体的抗原修复规范，实验室内应对每一个抗体进行最佳修复条件测试，据此形成抗原修复系列技术规范方法在实验室内每个技术人员共同按规范化的抗原修复操作是保证实验可重复性的关键。 上图显示采用不同的抗原修复液和不同的修复方式的组合对同一组织的连续切片进行修复可以达到不同的染色效果。因此从事免疫组织化学实验的技术人员应该不仅仅满足于抗体的表达，而应该通过多组合的抗原修复实验探索出每个抗体的最佳表达效果。 6．选择一个实用且高质量的免疫组织化学检测试剂盒。构成免疫组织化学检测系统的试剂盒有多种不同的组合，最简单的仅由二抗组成。通常检测试剂盒由内源酶抑制剂、二抗系统、DAB 显色套液组成。为了适应免疫组化染色的自动化和标准化，某些专业试剂公司提供了非常全面的免疫组织化学检测套装试剂盒。这种试剂盒组成包括内源酶抑制剂、冲洗液、非特异蛋白封闭试剂、二抗系统、DAB 显色套液和细胞核复染液。在实际工作中应根据具体情况在实践对比的基础上选择适合的检测试剂盒。为了保证显色的质量和稳定性最重要的是坚持使用一种试剂盒并规范化的使用，避免使用的随意性。 7．关注DAB显色的稳定性，如果选择使用的检测试剂盒不含DAB 显色试剂，应选择一个高质量的显色试剂盒，熟悉它的性能并规范的配制避免随意配制和使用。 8．注重技术细节在免疫组化染色的全过程中严格地按技术流程规范化的操作避免随意性。非主要环节的某一个小的细节操作的疏忽和随意性操作可能对整个染色结果不会造成明显影响，但是几个小的随意性操作的叠加结果完全可以造成整个染色的失败。 对于目前大多数手工染色的免疫组化实验室而言，在滴加每一个主要染色试剂前切记要尽量甩掉玻片上的冲洗液，然后用洁净的纸巾沿组织边缘2 mm的距离擦干玻片。擦干组织边缘水渍的目的是防止滴加抗体后，抗体沿水渍流失造成组织染色不均。注意滴加抗体时一定要使抗体覆盖上图所示的斜线部分防止抗体在组织边缘集聚形成边缘效应。用于组化染色的载玻片由于进行了良好的防脱片处理，常造成滴加抗体时液体由于表面张力的作用自然向组织切片的边缘集聚或形成孤立的液滴影响染色的结果。如果这种现象较为严重可用高质量的脱脂奶粉稀释液处理切片30分钟即可克服防脱涂层造成的这种现象。 技术细节的疏忽和随意性可以给最终的结果造成各种不良的影响。 图示正确操作应达到的效果 图示抗体沿水渍流失影响组织着色 操作细节疏忽造成染色不均部分细胞未着色 细胞核染色偏深且分化不足 同一组织细胞核染色适当且分化良好 在免疫组织化学染色过程中，细节疏忽所造成的影响不仅存在于重要的技术环节。下图显示的是在组织切片最后的脱水透明封片环节，由于脱水乙醇中含有从HE染色切片中洗脱的伊红染料造成整张切片覆盖一层红色，影响对组化染色信号的识别。 高质量、稳定、可重复性是免疫组织化学实验的生命。不规范、不稳定、不可重复的染色结果是不可信的，它不仅不能给予病理诊断和鉴别诊断提供正确的参考信息反而可能造成误导。 影响免疫组织化学实验技术质量和稳定性的因素来自涉及整个实验的各个方面。因此每个组化实验室都应该制定一套从标本固定开始到脱水透明封片为止，全面的规范化操作方案。具体到每一个抗体的规范化操作方案应通过认真的对比实验获得。在同一实验室内工作的每一个技术人员共同按照规范化方案完成每一种抗体的免疫组织化学染色是实验室内质量控制的有效方法。 第十二节 免疫组织化学染色的自动化 近年来在临床病理诊断和鉴别诊断中应用的抗体呈逐步增长的趋势。随着对肿瘤相关蛋白—肿瘤细胞生长、分化、调控、信号传导通路相关蛋白—研究的深入，相信应用于病理学诊断和鉴别诊断的抗体会进一步增长。因此免疫组织化学检测的数量和种类也将随之增长。另一方面，以肿瘤靶向治疗为核心的肿瘤个性化治疗正悄然兴起，这一肿瘤治疗的新途径给免疫组织化学实验技术提出了更高的质量要求—检测技术的标准化和实验结果评价的标准化。 实验数量的逐步增长和对实验质量要求的高标准是免疫组织化学染色实验技术自动化的原始动力。相对高昂的自动化染色设备和试剂消耗是目前影响免疫组化实验技术自动化普遍应用的主要因素。 自动化的优势是可以使用标准化的系列试剂、最大限度地减少人工操作造成的技术误差、以标准化的技术流程完成大量的标本检测、实验结果重复性良好。免疫组织化学检测的自动化代表着未来的发展方向。 目前使用的自动免疫组化染色机主要分为两个类型。 一. 前处理/染色分体型 此类机型的特点是，将待染色的玻片放入与自动染色机通用的载片架上,首先在一个独立的脱蜡/抗原修复仪器中完成组织切片的前处理,然后将载片架连同玻片移人自动染色机完成染色过程。 二. 前处理/染色一体型 此类机型的特点是，只需将待染色的玻片放入自动染色机中即可完成组织切片的前处理和染色过程。 致谢： 本章编写中采用的部分图片源于袁融、 邓永江等技术专家的交流和惠赠谨致谢忱。 红细胞显色 阳性细胞 生物素化二抗 一抗 一抗 一抗 生物素化二抗 三抗酶复合物eptavidin- Conjugate 抗生物素蛋白—酶复合物 酶分子 生物素化二抗 细胞核染色适度 DAB与内源性酶结合造成背景 三抗酶复合物eptavidin- Conjugate 一抗 PAGE 15