【doc】 甲状腺肿瘤组织中p14^ARF基因纯合性缺失及其产物
达状况的研究
[标签:标题]
甲状腺肿瘤组织中
产物表达状况的研
P14ARF
究
田桂红,等甲状腺肿瘤组!!墨垦丝盒基盍垄堑窒
基因纯合性缺失及其
田桂红,马金龙,王家耀,冯建华,赵跃然,周玲
1.山东省医学科学院药物研究所,山东济南250062
2.山东省立医院(病理科:马金龙,王家耀;中心实验室:赵跃然),山东济南250021
《基础?临床研究l
Researchofhomozygousdeletionofgenepl4胴andexpressionofitsproductinthyroidtumors
TIANGui—hong,MAJin—long!,WANGJia—yao!FENG-『ian—hua,ZHAOYue—ran!,ZHOULing
1.InstituteofMateriaMedica.ShandongAcademyofMedicalScience,Jinan
250062,P.R.China
2.ShandongProvincialHospital,Jinan250021.P.R.China
【摘要】目的:检测甲状腺肿瘤组织中
p14基因变异及其产物的表达,探讨此基
因与甲状腺肿瘤发生发展的关系.方法:应
用双重PCR和免疫组化SP法分别检测20
例甲状腺腺瘤和28例甲状腺癌组织中
p14基因纯合性缺失及其蛋白表达状况.
28例甲状腺癌包括11例甲状腺滤泡癌.11
例乳头状癌,4例髓样癌以及1例未分化癌.
结果:1)pl4基因在甲状腺腺瘤及癌中的
纯合性缺失率分别为5.0(1/20)和
42.9(12/28),两者差异有统计学意义.
P一0.0036.2)p14蛋白在甲状腺腺瘤
及甲状腺癌中的阳性率分别为90.0(18
20)和35.7(10/28),两者差异有统计学意
义.P一0.0002.结论:甲状腺肿瘤中
p14,基因的纯合性缺失是其蛋白表达失
活的重要机制之一,与甲状腺肿瘤的发生发
展密切相关.p14RF可能是甲状腺肿瘤的
分子标志物之一,可作为鉴别甲状腺腺瘤与
滤泡癌的辅助指标.
肿瘤防治杂志.2005.12(17):1292—1294
LABSTRACT]OBJECTIVE:Tostudytherelationshipbetween
geneplandthyroidtumorsbymeasuringalterationofgene
p14,andexpressionofitsproductMETHODSTwentythyroid
adenomasand28thyroidcarcinomas(11folicularcarcinomas.12
papillarycarcinomas,4medullarycarcinomasand1undifferentiat—
edcarcinoma)wereassayedforalterationofpl4andexpression
.fitsproduct,includinghomozygousdeletion.bydifferential
PCR,andproteinexpressionbyimmunohistochemistry.RE-
SULTS:1)Homozygousdeletionratesofpl4inthyroidadeno—
masandcarcinomaswere5.0(1/20),42.9(1228)respec—
tively,andtherewasasignificantdifferencebetweenadenomasand
carcinomas-P一0.0036.2)Positiveratesofproteinpl4,inthy—
roidadenomasandcarcinomaswere90.0,35.7respectively,
andtherealsowasasignificantdifferencebetweenadenomasand
carcinomas.P一0.0002.CONCLUSIONS:Inthyroidtumors.ho—
mozygousdeletionofp14,isoneofimportantmechanismsoflo.ssof
proteinandisrelatedtothehappeninganddevelopmentofthyroid
tumors.p14,maybeoneofmolecularmarkersofthyroidtumorsand
canbeusedasanassistantindextodistinguishthyroidfolicularcarci—
nomafromadenoma.
(JCancerPrevTrea,.2005.12(17):1292—1294
【关键词】甲状腺肿瘤,病理学;基因,抑制,肿瘤;基因表达;免疫组织
化学
[KEYWORDS]thyroidneoplasms/pathology:genes,suppressor,tumor;ge
neexpression;immunohist.chemistry
p14AR(alternativereadingframe)基因是近年来
发现的一个新的抑癌基因.位于人染色体9p21,由3
个外显子(E1J3,E2及E3)和2个内含子组成.研究表
明,p14AR基因变异从而导致其产物表达减少与人类
多种肿瘤的发生密切相关.,但其在甲状腺肿瘤中
【通讯作者简介】田桂红,女,山东巨野人,硕士,主要从事肿
瘤学的研究工作.
Tel:86—531—82612443E—mail:tghfly@tom.corn
的作用文献少有报道.我们通过检测甲状腺肿瘤组织
中p14AR基因外显子E1J3的纯合性缺失及p14蛋白
的表达,探讨其与甲状腺肿瘤发生的关系及意义.
1材料与方法
1.1标本来源
取1997年2月16日,2004年4月20日山东省
立医院病理科存档石蜡块标本共48例.48例患者
中,男14例,女34例.年龄2O,73岁,平均年龄43
肿瘤防治杂志2oo生笙鲞笙!塑旦旦墨!墨曼!墨兰:::!坠垫生
岁.中位年龄40岁.所有标本病理分型由3位病理学
专家根据《阿克曼外科病理学》甲状腺肿瘤的病理学分
型
确定,腺瘤20例,滤泡癌11例.乳头状癌12
例,髓样癌4例,未分化癌1例.
1,2主要试剂
兔抗人p14AR多克隆抗体(即用型)购于福州迈新
生物技术开发公司,通用型SP检测试剂盒以及DAB
显色剂均购于北京中山生物技术有限公司.
1.3方法
1.3.1DNA提取将石蜡组织切成10m的切片
并载于载玻片上,根据HE切片确定肿瘤所在部位,将
肿瘤组织收集于EP管中,肿瘤成分占组织的96以
上,用Gentra公司的PUREGENEDNAPurification
kit按照试剂说明进行DNA抽提.
1.3.2PCR反应为检测纯合性缺失(homozygousdele
tion,HD),使用双重PCR,根据p14RF的外显子E18的不
同片段设计2对引物,并以13-actin作为内参照.1)引物
设计及合成:由上海博亚公司合成,Elt3q(167bp)上游为
5’-Cd2AGTTAA~AGGAGT一3,下游为5’-GAAC—
CACGAAAACCCTCACT一3;E1~3-2(149bp)为5’-GAGT
GAGGGTTTTCGTGGTT一3和5一G(TTTCCTACCTG—
GTCTTC一3;13-actin(193bp)为5一GCTCCACGAAAC
TACCTTC一3和5一TCA(TCAGGCAGGAAAGA3.
2)PCR反应体系:20”L的体系包括2/aLDNA模板,1×
PCRbuffer(10mmol/LTrispH8.3.50mmol/LKC1).
1.5mmol/LMgC12,dNTPs(各250/lmol/L).引物各
0.15,0.3~mol/L及Taq酶1U.扩增参数为:94IC变性
45S,60?退火45S,72C延伸60S,循环30个周期后.取
扩增DNA样品1OL在1.5,2.0H琼脂糖凝胶电泳
0.5,1.0h,用AlphaImager2200采集图象并分析结果.
p14A~pb显子EI~-I或ELI3-2产物的量小于~actin的
2O时,就认为是该基因的纯合性缺失:.
1.3.3免疫组化染色将48例存档蜡块5m厚连
续切片,每例标本切4张.以正常乳腺作阳性对照.以
0.01mol/L的PBS(pH7.4)代替一抗作阴性对照.
p14AR抗原高温高压修复.免疫组化具体
按SP
试剂盒说明书进行操作.
1.4结果判断标准
p14AR阳性染色定位于细胞核或胞质.抗体染色
结果判定:每例标本随机计数10个高倍视野,计数每
个高倍视野中阳性细胞所占的百分比并计分:阴性为
0分;阳性细胞所占百分比1,10为1分;10,
5O为2分;50,75为3分;?75为4分.染色
强度计分为:无色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2
分,棕褐色为3分(染色深浅需与背景着色相对比).
阳性细胞百分比与染色强度的乘积>3分判定为免疫
反府(+)
1.5统计学处理
实验数据均采用SPSS10.0统计软件分析处理,
采用x检验及Fisher精确概率法,检验水准a
0.05.
2结果
21pl4胴纯合性缺失检测
甲状腺腺瘤,滤泡癌,乳头状癌,髓样癌和未分化
癌中蛋白阳性表达分别为18,3,4,2和1例,p14AR基
因的纯合性缺失分别为1,5,5,2和0例.甲状腺腺瘤
中p14的缺失率为5.0(1/20).而其在甲状腺癌
中的缺失率为42.9(12/28).两者差异有统计学意
义.Y一8.4667.P:0.0036.pl4AR在滤泡癌,乳头
状癌及髓样癌中的缺失率分别为45.5(5/11),
41.7(5/12)和50.0(2/4).1例未分化癌中未发
现p14的缺失(图1.Fig.1).pl4AR的缺失率在甲
状腺滤泡癌与腺瘤间(P:0.0132)及乳头状癌与腺
瘤间(P一0.0185)差异均有统计学意义.但在髓样癌
与腺瘤间差异无统计学意义,P一0.0613.
1:甲状腺腺瘤;13,20:乳头状癌;25,46:滤泡癌13号和46号患者显示
pl4\RFE18—2缺失.
图1甲状腺肿瘤中pl4的纯合性缺失
1{Thyroidadenoma;13,20:Thyroidpapillarycarcinomas;25,46:
Thyroidfolicularcarcinomascase13and46showingpl4.,E192ho
mozygousdeletion.
Fig1Homozygousdeletionofpl4inthyroidneoplasms
2.2pl4胴蛋白的免疫组化染色
p14AR阳性染色定位于细胞核或胞质.在检测的
20例甲状腺腺瘤中p14AR蛋白阳性率为90.0(18/
20).28例甲状腺癌中该蛋白阳性率为35.7(10/
28),两者间差异有统计学意义,!一14.1453,P一
0.0002.其中该蛋白在滤泡癌,乳头状癌及髓样癌中
的阳性率分别为27.3(3/11),33.3(4/12)和
50.o(2/4).pl4AR蛋白在滤泡癌与腺瘤间(P一
0.0007)及乳头状癌与腺瘤间(P=0.0015)差异均有
统计学意义.在髓样癌与腺瘤间(P一0.1149)差异无
统计学意义(图2,Fig.2).
田桂红,等甲状腺肿瘤组织中pl1摹固盒壁基塑耋塑丛窒
阳性细胞在细胞胞质或胞核呈稼黄色
图2pl4蛋白在甲状腺腺瘤中的阳性表达(SPX1oo)
Positivecellsshowbrownyellowinnucleiandcytoplasm.
Fig2Resultofpl4expression
inthyroidadenoma(SPX100)
3讨论
31P14基因结构及其产物功能
INK4a/ARF(alternativereadingframe)基因是直接
调控细胞周期并抑制细胞分裂的新型抑癌基因,位于人
染色体9p21,由3个外显子和2个内含子组成.最初发
现3个外显子共同编码CDK4抑制蛋白即p16,1995
年又发现[NK4a存在可变读框基因ARF(人来源称为
p14珊,鼠来源称为p19),它与p16共用外显子2
和外显子3.两种mRNA的差别仅在于其编码区第1
外显子不同,p16为E1,p14为ElI3,而E2和E3
则完全相同.由于p14和p16有2套各自独立
的启动子,可读不同的编码框,因此.它们编码的蛋白没
有氨基酸序列的同源性.
p14能将细胞周q断在G.期和G!/M转换
期或诱导细胞凋亡.MDM2具有泛素连接酶的作用,
能够结合在p53四聚体转录活性区域.将p53从细胞
核转运到细胞质中,从而使p53降解.在细胞高增殖
信号的刺激下,p14与MDM2发生一系列构象变化后
直接结合,p14在核质中捕获MDM2,抑制泛素化
作用以及蛋白酶对p53的降解,阻止MDM2对p53核
向质的转运,使p53在细胞核中积累,从而发挥抑瘤作
用.最近发现,ARF还可通过p53非依赖途径调
节肿瘤血管生成而发挥抑癌作用一.
3.2甲状腺肿瘤中P14基因纯合性缺失与表达失
活的关系
我们的研究资料显示,28例甲状腺癌中p14基
因E1的纯合性缺失率为42.9(12,28),而2O例腺
瘤仅1例发生了ElI3的纯合性缺失.在所有纯合性缺
失患者中,p14蛋白均无表达,提示纯合性缺失是其
表达失活的机制之一,并与人类甲状腺肿瘤的发生发
展关系密切.另外,尚有6例甲状腺癌及1例腺瘤
p14蛋白未表达,但未检测到E18的缺失,提示
p14洲基因尚有其他变异导致蛋白不表达.
基因的缺失,突变及甲基化等基因外修饰的改变
均可导致蛋白产物的表达失活.已有研究证实,在结
肠癌,口腔癌和胃癌等多种人类肿瘤中,p14基因的
纯合性缺失及5’CpG岛异常甲基化均是其表达失活
的重要机制,--3_,但在甲状腺肿瘤中p14’CpG岛
是否有异常甲基化现象尚须进一步研究证实.
3.3病理学意义
目前有些甲状腺肿瘤分型很难从细胞形态上进行
鉴别,尤其是甲状腺腺瘤和滤泡癌的鉴别.主要依据肿
瘤细胞是否浸润被膜和血管,这给甲状腺肿瘤的临床
病理诊断带来了一定的困难.我们的研究结果显示,
p14ElI3的纯合性缺失率及蛋白产物的表达在滤泡
癌与腺瘤间,乳头状癌与腺瘤问差异均有统计学意义,
提示p14基因除了与甲状腺肿瘤的发生发展有关以
外,也可能是甲状腺肿瘤的分子标志物之一,可作为鉴
别甲状腺腺瘤和滤泡癌的辅助指标.
总之,我们的研究提示,甲状腺肿瘤中抑癌基因
p14AR的纯合性缺失是一个较常见的现象,从而导致
其产物表达失活,功能丧失和细胞增殖加速,促进了甲
状腺肿瘤的恶性进展.但仍有部分无p14AR蛋白表达
的病例,未检测到纯合性缺失,p14基因在甲状腺肿
瘤中是否还有其他变异,尚须进一步证实.
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收稿日期:2004—12—03修回日期:2005,03—31
(编辑:陶阳)