生物素测试剂盒操作流程维生素B7(生物素)检测试剂盒实验操作流程
一、实验前准备工作
1、灭菌(在做实验前,至少提前两个小时以上灭菌)
实验器材名称
规格
数量
黄色吸头
20-200ul
200个
蓝色吸头
100-1000ul
200个
带塞可离心试管
50ml
至少是当次检测样品数量
离心管
1.5-2.0ml
100个
注射器
至少比当次检测样品数量多2个
如果有一次性无菌注射器则不需要灭菌注射器
没有枪头盒时用其他器皿装枪头一起灭菌(如烧杯,灭菌时放入枪头后用报纸...
维生素B7(生物素)
试剂盒实验操作
一、实验前准备工作
1、灭菌(在做实验前,至少提前两个小时以上灭菌)
实验器材名称
规格
数量
黄色吸头
20-200ul
200个
蓝色吸头
100-1000ul
200个
带塞可离心试管
50ml
至少是当次检测样品数量
离心管
1.5-2.0ml
100个
注射器
至少比当次检测样品数量多2个
如果有一次性无菌注射器则不需要灭菌注射器
没有枪头盒时用其他器皿装枪头一起灭菌(如烧杯,灭菌时放入枪头后用报纸把烧杯口封起来),同时带两把小镊子,做实验时取枪头用。
2、配制溶液
(1)准备10mlHCL溶液:1.0mol/l
(2)配制氢氧化钠溶液:1mol/l
a)称取0.4 g 氢氧化钠
b)用10 ml双蒸水或去离子水充分溶解
注:用带橡胶塞的玻璃瓶储存。
3、实验过程中需要的其他设备及器材:
无菌工作台
酶标仪(540nm或630nm)
37℃黑暗条件下的培养箱
95℃水浴锅(实验前需要提前加热到95℃)
振荡器
pH测量仪或pH试纸
双蒸水
0.2um无菌滤膜
酒精棉
二、样品处理
1、称取1g奶粉样品至一个50ml无菌试管中,加入40ml无菌水摇匀,用HCL或NaOH调整pH值到8.0 +/- 0.2,充分混匀;
2、在95℃水浴中提取30分钟,期间所有样品试管需每隔5分钟振荡一次,并一直保持试管塞紧闭
3、迅速冷却至室温(即把样品试管放进水里,保证试管塞紧闭)
从下面这一步开始需要在无菌工作台进行
4、分别取1ml样品用0.2um无菌滤膜过滤至1.5~2.0ml无菌试管中
5、根据样品中生物素含量用试剂盒中提供的无菌水进一步稀释样品,稀释后的样品即可用于检测。
样品稀释倍数计算如下:
例如:固体样品标注浓度为80ug/100g
用该浓度除以标准2
计算: 80 μg ÷ 0.24 μg =333
→ 结果为稀释倍数大约为300
→ 1 :300 稀释
稀释步骤:
a) 1 :9(100ul样品提取溶液 + 900ul试剂盒中的无菌水),
b) 1 :9(100ul a液 + 900ul试剂盒中的无菌水),
c) 1 :2(200ul b液+ 400ul试剂盒中的无菌水)
注:每一步稀释都需要充分混匀后再做下一步稀释,提取稀释液需立即使用。
三、检测过程
1、配制标准品
装有无菌水的瓶子:推开蓝色帽,沿着玻璃边缘垂直向上拉开,丢弃。
标准品必须在试验之前新鲜制备。
-打开生物素标准品瓶,取出盖子。丢掉盖子和红色塞子
-加入x ml无菌水,至标准品瓶中。充分溶解标准品,即配成标准品浓缩液。
注:x详见质控
和标准品包装标签,每一批次所加体积会略有不同,无菌水必须是取自试剂盒中提供的。
-取6个无菌管(1.5~2.0ml)并按照下列
格准备标准品溶液。
标准曲线*
μg/100g(ml)
无菌水
μl
标准浓缩液
μl
总体积
μl
空白:0
900
+
0
=
900
标准品1:0.08
900
+
100
=
1000
标准品2:0.24
350
+
150
=
500
标准品3:0.40
250
+
250
=
500
标准品4:0.56
150
+
350
=
500
标准品5:0.72
50
+
450
=
500
注:配制每一个标准品,都是取标准浓缩液进行稀释。
2、制备生物素培养基
注:培养基必须在试验之前新鲜制备。
—打开瓶盖用镊子从干燥剂中取出培养基,丢掉干燥剂。
-加入10ml无菌水(必须取自试剂盒中)至生物素培养基中。
-盖好培养基瓶,充分摇匀。
-在95℃水浴中加热至少5分钟,期间振荡至少2次,保证瓶子封闭。
-迅速冷却至室温(低于30℃)。
-使用0.2μm无菌滤纸过滤培养基至15ml无菌离心管中。
3、检测过程
-取出当次实验需要数量的微孔板条,并固定在板上,未使用的微孔板条立即放回原来的箔袋中,并与干燥剂一起重新封好,储存在2-8℃条件下。
-用移液枪取150μl生物素培养基至微孔中
-用移液枪取150μl标准品或样品至指定的微孔中
-用粘合箔盖住微孔条或微孔:用手或压舌板将粘合箔平压,使其充分封闭微孔板条。
注意:保证粘合箔和微孔的封闭性,特别注意微孔的边缘部分。
-在37℃黑暗条件下(可用孵育器)孵育44~48小时。
注:37℃孵育不能超过48小时。
以两次平行、两个样品为例,取两条微孔板条,每孔加样如下:
150ul生物素培养基+150ul无菌水
150ul生物素培养基+150ul无菌水
150ul生物素培养基+150ul标准品1
150ul生物素培养基+150ul标准品1
150ul生物素培养基+150ul标准品2
150ul生物素培养基+150ul标准品2
150ul生物素培养基+150ul标准品3
150ul生物素培养基+150ul标准品3
150ul生物素培养基+150ul标准品4
150ul生物素培养基+150ul标准品4
150ul生物素培养基+150ul标准品5
150ul生物素培养基+150ul标准品5
150ul生物素培养基+150ul样品1(稀释后)
150ul生物素培养基+150ul样品1(稀释后)
150ul生物素培养基+150ul样品2(稀释后)
150ul生物素培养基+150ul样品2(稀释后)
4、读取数据
-再次向下挤压粘合箔,将微孔板向上放置在桌面上,在桌面上来回振荡,使微生物溶解在培养基中
-从对角开始小心揭去粘合箔,从左边开始进行;
-微孔液体表面有泡沫时可以用移液枪头去除
-用酶标仪630nm(或540nm)条件下读取浑浊度
四、结果计算
推荐在计算结果时使用专业计算软件。并使用4参数计算公式进行结果计算。
判断检测结果有效:
-OD空白值 < OD标准1
-OD标准5 > 0.6 OD
从标准曲线上读取的浓度×稀释倍数
样品中生物素含量 = ────────────────────
(μg/100ml) 样品总量 g(ml)
(μg/100g)
注:稀释倍数为样品处理过程中所计算的整数倍,不包括提取过程中的40倍,这个倍数已经在曲线中考虑进去。
例如:
样品重量: 1 g
样品提取稀释倍数: 1:40(不需要被考虑进去)
其它稀释倍数: 1:300(必须考虑)
从标准曲线中读取浓度值: 0.24 μg /100 g(ml)
0.24 ×300 / 1 = 128 μg / 100 g(ml)
五、实验注意事项
1、试剂盒应存放在2-8℃条件下。
2、微孔板操作时使用的必须是无菌样品提取液或稀释液,并且样品稀释时需要使用盒中提供的无菌水。
3、样品提取和稀释必须在无菌条件下进行。
4、检测培养基有可能刺激眼睛、皮肤和黏膜。
5、完成试验后须根据规章处理检测仪器(如使用高压灭菌锅)。
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