牡荆子化学成分及紫花牡荆素临床前药代动力学研究(可编辑)

牡荆子化学成分及紫花牡荆素临床前药代动力学研究(可编辑) 牡荆子化学成分及紫花牡荆素临床前药代动力学研究 牡荆子化学成分及紫花牡荆素 临床前药代动力学研究 . ? . ? . ? 一 一一 , :独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责 任。 学位论文作者签名: 日期:加易年月日 绝铘 学位论文版权使用授权声明 本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定,第二 军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版,允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文全 文或部分内容编入《中国学位论文全文数据库》、《中国优秀博硕士学位 论文全文数据库》等数据库进行检索。可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名: 日期:砂?年月上日目 录 摘 要?..?...?...?..一一 /;?...?...??... 缩略语说明??.. 前言.一一 日盯 百.??...一一 第一章牡荆子化学成分研究?.. 一、牡荆子化学成分的提取与分离?一一 一、提取与分离?一.. 二、牡荆子中分离格定的化合物一.。 三、化学成分结构鉴定?一一一 本章小结一. 第二章生物样品中紫花牡荆素体内分析的学研究??.一。 一、仪器与药品.一 二、实验方法与结果?.一 三、讨论??.... 本章小结.. 第三章紫花牡荆素临床前药代动力学研究... ~、仪器与药品.. 二、实验方法与结果?.. 三、讨论??..一一 本章小结一一 总结??.. 参考文献. 综述 牡荆属植物的化学成分和药理研究进展?一. 在读期间发表论文情况.. 致谢??一一 附录??一?牡荆子化学成分及紫花牡荆素临床前药代动力学研究 摘要 牡荆子为马鞭草科植物牡荆 .的干燥成熟果实,味 苦、辛,性温;归肺、大肠经。具有除湿祛痰,止咳平喘,理气止痛的功效,现代药 理研究表明牡荆子具有镇痛、平喘、抗炎、抗菌、抗氧化等作用。该植物生于低山向 阳的山坡路边或灌木丛中,产于全国大部分地区,主要分布于华东及河北、湖南、湖 北、“东、厂。西、四川、贵州等。近些年来对于牡荆属植物化学成分研究表明,牡荆 属植物富含木脂素类、黄酮类、二萜类等成分,这些成分也显示出了一系列活性如: 抗氧化、抗炎、抗菌、镇痛等。牡荆子在民间与传统用药上作为抗炎平喘的药物米使 用,但足由于对牡荆了的系统研究较为缺乏,导致其物质基础不明确,因此,我们对 牡荆子进行系统的化学成分研究,阐明其物质基础,为其进一步开发打下研究基础。 本课主要涵盖以下两个方面: 一、牡荆子化学成分研究 牡荆子药材经低温干燥及打粉后,用%乙醇反复回流提取次,每次小 时。减压同流后得到的总浸膏分别用二氯甲烷、石油醚、三丁醇、 乙酸乙酯和水萃取, 采用柱层析、薄层色潜、半制备液相等方法从二氯甲烷性部位中分离出个化合物, 并应用理化常数测定和光谱,,,.,?,?分析技术鉴 定了其中的个化合物。分别为牡荆内酯、前牡荆内酯、白桦酸、紫花牡荆素、北 美草素..甲醚、对羟基苯甲醛、.谷甾醇、香草醛、.羟基..一羟基一一甲氧基苯 基一 【一羟甲基一一甲氧基.,.二氢..萘醛、一羟基...羟基..甲氧基苯基一?一羟甲 基..甲氧基一,一二氢一一萘醛、泡桐素、,,,,一一乙酰氧基一,, 三降.,.半日花烷交酯、异落叶松脂素、芝麻素、对羟基肉桂酸、熊果酸、金合欢 素、,.二羟基.一甲氧基吡酮、一羟基脱氢松香酸、.羟基一,,’,’.四甲氧基黄酮、 .羟撼一,,’,’.四甲氧基黄酮、对羟基苯甲酸与对甲氧基肉桂醛。我们通过同属植物 黄荆、牡荆、蔓荆、单叶蔓荆以及穗花牡荆化学成分的比较,发现该属植物大多 含有紫花牡荆素,说明紫花牡荆素为该属植物的特征性成分,并且主要成分为紫花牡 荆素的植物提取物在欧洲广泛的用于治疗经前期综合征。但由于 其药代动力学特征不 明确,影响其进一步应用,所以对其进行药代动力学研究,明确其药代学特征,对紫 花牡荆素不发成新药显得尤为重要。第二军医人学硕士学位论文 二、药代动力学研究 药物代谢动力学是定量描述药物进入体内以后的吸收、分布、代谢、排泄过程, 通过测定生物样本中的药物或者代谢产物的浓度,可以更好的阐明药物的药效或者毒 性,为新药研究的代谢筛选和临床用药的安全有效提供重要依据。随着组合化学技术 和天然药物分离制备技术的发展,大量的候选药物需要进行药代动力学评价,这就要 求建立并优化相关分析方法对生物样品中的目标成分进行高灵敏度、快速准确、低消 耗的定量分析。紫花牡荆素,’,.一,’,,.又名 蔓荆子黄素,作为一个重要的黄酮类成分,广泛的存在于牡荆属植物中, 例如蔓荆、穗花牡荆、单叶蔓荆。据报道紫花牡荆素具有抗肿瘤、抗炎、抗高催乳素 血症、抗氧化、镇痛等活性。近年来,紫花牡荆素被认为是抗经前期综合征的主要活 性物质,与传统抗经前期综合征的药物镇痛药、雌激素相比,从天然产物中得到 的紫花牡荆素具有更少的副作用,并在欧洲广泛的用于治疗经前期综合征。鉴于紫花 牡荆素具有抗炎、抗高催乳素血症、抗氧化、镇痛等作用,其发展成为抗经前期综合 征药物的潜力很大,所以建立一种选择性、灵敏性高的定性、定量检测方法,对紫花 牡荆素而言是十分必要的。虽然在以往的研究中,建立了几种通过.定性、 定量检测紫花牡荆素的方法 品的检测报道很少。本文主 测方法,并将其应用于紫花 关键词:牡荆子;牡荆属;牡荆子化学成分及紫花牡荆素临床前药代动力学研究 ?? 刀“门 ., , . ?? . ,, . .,,,,, ., , 艉. , . ? ., ? .. 孑 :. . ? ./.%×,,, ?,. 一 , . ,, .,, ,,’,’, 一一一?, ,,, ,一一一一一?一一, , , , 一一,, , , , 一一一, , 一 一,,’,, 一,,’,, .. . . .,,厂和砌?,护胁?缸 所麟玎“玎如.,., . 聊,配加,砌锄. 砌蹦. ., ., 札锄 ,, 腩 ,. , . , , 切, 刭 , 限一,,,., , .. ., , ., ? 句, . .. 觚 巧, 眦, ,锄,.,? .一牡荆子化学成分及紫花牡荆素临床前药代动力学研究 . ,, .? . . .? , . : .; ;;;, ..第二军医大学硕士学位论文 缩略语说明. ? ? ? ?? .. ....牡荆子化学成分及紫花牡荆素临床前药代动力学研究 ?????一 刖 昌 中药是中华民族优秀的资源宝库及文化瑰宝,中医药作为我国独 具特色的医药文 化资源,与西医药共同承担着维护人民健康的重要使命。中医药 是中国特色医疗卫生 事业不可或缺的重要组成部分,在人类战胜疾病以及推动人类走 向健康的征途中发挥 着重要的作用。随着社会的发展以及人类健康意识的提高,人们越来越关注化学药品 给人类在生活环境及自身健康方面带来的负面影响;保护环境、回归自然已成为一种 处理人类和环境关系的重要指导思想。天然产物在治疗人类疾病方面由于其毒副作用 较小等特点,越来越受到人们的广泛关注,这也给中药的进一步发展提供了一个宝贵 的机遇。虽然中医药事业正在蓬勃发展,但由于现行医疗体制以及中医药自身对中医 药的发展还存在许多制约因素,使中医药事业在面临新机遇的同时,也面临着极其厄 峻的挑战。抓住机遇,迎接挑战,充分认清中药的发展趋势和现状,为了让中药以及 一 中医药文化真正的步入国际市场,我们就应当充分应用现代科学技术和方法,参考罔 际规范,逐步完善和建立药材的种植、方剂的有效性及安全性及饮片的炮制等研究, 优化实验室和临床研究,使中成药在质黾控制和生产等方面进一步规范化,提供安全、 ‘? 有效、规范的中药以适应现代国际市场的新需求。 药代动力学研究是通过动物体内、外和人体外的研究方法,揭示药物在体内的动 态变化规律,获得药物的基本药代动力学参数,阐明药物的吸收、分布、代谢和排泄 的过程和特点。临床前药代动力学研究在新药研究开发的评价过程中起着重要作用。,~ 在药效学和毒理学评价中,药物或活性代谢物浓度数据及其相关药代动力学参数是产 生、决定或阐明药效或毒性大小的基础,可提供药物对靶器官效应药效或毒性的 依据;在药物制剂学研究中,临床前药代动力学研究结果是评价药物制剂特性和质量 的重要依据; 在临床研究中,临床前药代动力学研究结果能为和优化临床研究 给药提供有关参考信息。 牡荆子为马鞭草科植物牡荆 .的干燥成熟果实,具 有除湿祛痰,止咳平喘,理气止痛的功效,味苦、辛,性温。归肺、大肠经 。其 功能与主治在《全国中草药汇编》、《福建药物志》、《浙江药用植物志》等均有记载。 《全国中草药汇编》:“止咳平喘,理气止痛。主治咳嗽哮喘、胃 痛、消化不良、肠炎、 《浙 痢疾。” 《福建药物志》:“治疗中暑、感冒、流感、支气管炎、胃肠炎、痢疾。” 江药用植物志》:“健脾之痛。 《药性考》:“除寒热、疗风止咳、心痛痢疾、带浊耳 《医林纂 聋,服之有益。” 《别录》:“主除骨问寒热,通利胃气,止咳逆、下气。” 要一药性》:“补行肝气,祛风燥湿。能发汗行水,治水肿身黄,又消食健脾。”该植第二:军医大学硕十学位论文 物生于低山向阳的山坡路边或灌木丛中,产于全国大部分地区,主要分布于华东及河 北、湖南、湖北、广东、广西、四川、贵州等。 现代研究表明牡荆子具有平喘【、镇痛‘、抗菌、抗炎‘、抗氧化【等作 用。近些年来研究表明牡荆属植物富含黄酮类、木脂素类、二萜类等【’一成分, 这些成分也显示出了一系列活性如:抗炎、抗氧化、抗菌、镇痛等活性。但由于对牡 荆子物质基础研究不深入,药理筛选不足,导致其物质基础不明确,限制了牡荆子的 进一步开发和利用。综上所述,通过建立合理的实验分离方法,对牡荆子的化学成分 进行系统的研究,阐明其活性物质基础,为将其开发成新药打下良好基础。 我们选择牡荆子为研究对象,对其化学成分进行研究,阐明其物质基础,为该药 材的今后开发与利用打下相应的研究基础。同时,对该属植物的特征性成分紫花牡荆 素的临床前药代动力学进行研究,阐明其药代学特征,为其开发成新药和临床用药的 安全有效提供重要依据。牡荆予化学成分及紫花牡荆素临床前药代动力学研究 第一章牡荆子化学成分研究 牡荆子为马鞭草科植物牡荆的干燥成熟果实,具有除湿祛痰,止咳平喘,理气止 、 、镇痛 痛的功效,味苦、辛,性温,归肺、大肠经。现代研究表明其具有平喘【 抗菌、抗炎、抗氧化等作用。该植物分布广泛,生于低山向阳的山坡路边或 灌木丛中,产于全国大部分地区,主要分布于华东及河北、湖南、 湖北、广东、广西、 四川、贵州等。鉴于牡荆子在治疗相关疾病方面的潜在价值以及 较为丰富的资源,我 们对其物质基础进行研究。 一、 牡荆子化学成分的提取与分离 一提取分离 仪器、材料和试剂 牡荆子药材:年月采自浙江建德市,经本教研室秦路平教授鉴定 为马鞭 草科牡荆属植物牡并 .的果实。 紫外分析仪.型:江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司; 系列; 半制备液相: 柱层析填料: 层析硅胶板:硅胶预制板,烟台芝罘黄务硅胶开发试验厂; .葡聚糖凝胶, ;硅胶型填料 ~目,~目,山东烟台芝罘硅胶开发试验厂; :三菱化工; ?反向硅胶填料~?,公司: 试剂:氯仿、乙醇、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯 、石油醚、正丁醇?、乙酸等均为国药集团化学试 剂有限公司产品。乙醇为工业级,其余试剂均为分析纯; 色谱溶剂系统:/不同比例;/不同比例;/ 不同比例; 薄层板显色荆:香兰素一%硫酸乙醇溶液。 提取与分离 牡荆子药材埏,?干燥后粉碎,过目筛,%乙醇倍量体积加 热回流提取次,减压蒸馏州收溶剂至无醇味。将总浸膏总提取物 均匀第.一:军医大学硕:学位论文 分散于 、石油醚 、正 蒸馏水中,分别用等体积的二氯甲烷 丁醇 和乙酸乙酯 萃取,分别得.氯甲烷部位, 、 石油醚部位, 、正丁醇部位, 和乙酸乙酯部位, 。萃 取后剩下的浸膏为水溶性部位, 提取流程图详见图.。 牡荆子药材粗粉 %乙醇回流提取 提取液 减压浓缩 浓缩液 水部位 石油醚部位 二氯甲烷部位 乙酸乙酯部位 正丁醇部位 硅胶柱色谱 .纯化. . 王 . . 丑 . . . . . . . . .婵 .加 , . , 丑 . . . . 丑 . . 丑 . . 丑 .弼 图.牡荆子的分离流程 一 . 一.牡荆:化。学成分及紫花牡荆素临床前药代动力学研究 二牡荆子中分离鉴定的化合物 化合物分离鉴定信息表: 通过柱层析、薄层色谱以及半制备液相等分离方法,从牡荆子分 离得到个化 合物,采用理化分析及多种波谱分离手段鉴定其中个见表.。 表.化合物信息表第二军医人学硕::学位论文 三化学成分结构鉴定 仪器 红外光谱仪: ;日立.型红外分析仪; 熔点测定仪:天津分析仪器厂型熔点仪;旋光仪: : 紫外光谱仪: 紫外光谱仪; 核磁共振仪: .型; 质谱仪:.磁式.;?. 结构鉴定 ? 白色针晶,..?.? .,, . ,一,.,,一,., ,,.,,. ,一, .,,,.,,一,.,,?,.,,. ,, .,,. ,,.,,.,. ,,.,,,. ,?; ,,一,.,,一,.,,一,.,,. ?? .?,.一,.,.?,., .,.一,.,.,.?,. ,.一, .一,.一,.一,.一,.一,.,. .,.,.,.。以上波谱数据与文献报道的 一致一】,鉴定为牡荆内骆。 一.牡荆子化学成分及紫花牡荆索临床前药代动力学研究 牡荆内酯 一无色油状物,? :【】.? .,, . ,一,.,,. ,一,.,,. ,一,.,, . ,一,.,,. ,一,.,,,.,,. ,一,.,,一,.,,一,.,,一,.,,. ,一;’ .一,.一,.,.一, .一,.一,.,.一,.一,.一,.一,. 一,.一,.,.一,.?,.一,.?,. 一,.一,.,.一。以上波谱数据与文献报道的前牡荆 内酯一致【 ,鉴定为前牡荆内酯。 前牡荆内酯 .白色粉末,.反应阳性,%硫酸一乙醇溶液显紫色,? /:】,分子式为. 显示有个碳信号 .?,.一,.,.一,.一,.一,.一,. ,.一,.一,.?,.一,.一,.一,. 一,.?,.,.?,.一,.一,.一,. 一,.一,.一,.一,.?,.,.一, ..,..。以上波谱数据与文献报道的白桦酸数据一致‘?,因此鉴 定 ..第二军医大学硕十学位论文 该化合物为白桦酸 。 白桦酸 一黄色结晶,...?,盐酸一镁粉反应阳性,. /:】. .,.,.,.,,,.,,一,., ,,’,.,,一’,.,,’;‘? ., .一,.,.,.一,.一,.,. ,.?,.’,.’,.一’,.’,. ’,.一’,.,.一,.,. ,.。以上波谱数据与文献报道一致【引,鉴定为紫花牡荆素。紫 花牡荆素 .白色针晶,..?,. /:】.? .,,,. ,,,.,,,.?.,, ’,’,’,.,,. ,一,.,,. ,一,. ,,., . ,一,.,,,.,,.,. ,,.,, .,. ,一;‘’ .,.一,., .一,.一’,.一’,.’,.一’,.一’, .’,.一,.一,.一,..。以上波谱数据与文 .?牡荆予化学成分及紫花牛:荆素临床前药代动力学研究 献报道的’,’,一三羟基一一甲氧基一二氢黄酮数据一致【,因 此鉴定该化合物为’, ’,一三羟基一一甲氧基一二氢黄酮, 即北美草素一一甲醚’,’, 一一?。’,’,一三羟基一一甲氧基一二氢黄酮 一浅黄色粉末,溶于甲醇、氯仿,..? ?.? . ,,,.,,. ,一,,.,,. ,,; ,.,.一,.一,,.一, .一,。以上波谱数据与文献报道一致因此鉴定化合物为对羟基苯 甲醛 、 ? 。对羟基苯甲醛 一白色针状结晶氯仿,,..??,香草醛一浓硫酸溶液显紫红 色,?反应呈阳性。且与‖.谷鬲醇对照品在多种溶剂系统展开做 对照,值及显色行为一致,且混合熔点不下降,故鉴定该化合物 为‖一符醇 。 伊谷箱醇 .?第一二军医大学硕:学位论文 一淡黄色粉末,..??, /:】.? , .,,. ,一,.,,. ,,.,,.,. 一,.,,,.,,,.,,;?? .,.一,.一,.?,.一,.一,. ,.。以上数据与文献【】报道的香草醛数据一致,因此鉴定化合 物为 香草醛。 香草醛 一淡黄色无定形粉末,. /:】.. ., ,一【,.,,一,.,,. ,一,.,,. ,一, , .,,.,. ,’,.,,. ,一’,.,,. 一’,.,,,.,,?’,.,,,.,,一, .,,,.,,;’ .,. 一,.一’,.一,.一,.一’,.一’,.一, .一,.一,.,.’,.,.一’,. 一’,.一,.,.?’,.一,.。以上数据与 文献【报道的 数据一致,因此鉴定化合物为.羟基一一一羟基一一甲氧基 苯基.【一羟甲基一.甲氧基一,一二氢..萘醛。.羟基一一一羟基一甲氧基苯基一羟甲基一一甲氧基一,二氢萘醛 一黄色针晶氯仿.甲醇,...?,. /:【】..,,一,.,,一,.,,一,.,, ..牡荆子化学成分及紫花牡荆素临床前药代动力学研究 一,.,,一,.,,. ,一’,.,,. ,一’,. ,,.,. ,一’,.,,一,.,,一,.,,一, .,,?,.,,?’;’ .一:, .一,.一’,.一,.,.一’,.一’,. 一,.一,.一,.一,.一’,.一,.一’, .一’,..,.?’,.一,.。以上数据与文献【『 报道的.羟基一一一羟基一一甲氧基苯基. 【.羟甲基一.甲氧基.,一二氢..萘醛数据一 致,因此鉴定化合物为.羟基.一一羟基一.甲氧基苯基一 【一羟甲基一.甲氧基一,.二 氢一一萘醛【一一一?一一一, 一一一】。一羟基...羟基..甲氧基苯基..羟甲基一一甲氧基一,一二氢一一萘醛 一无色针状结晶,易溶于氯仿,..??, /:】. . .,,一,.?.,芳氢,.,,亚甲 二氧基氢,.,,亚甲二氧基氧,. ,,一,.,,一,一,. ,一;”? ,,一,.,,. ,一,.,,..一,.一,.,.一,.一,., .,.亚甲二氧基,.,.×,.,.,.,., .,.,.,.,.,.。以上数据与文献【】报道的泡 桐素数据一致,因此鉴定化合物为泡桐素. ..第二军医人学硕学位论文 泡桐素 一 无色油状物,易溶于氯仿,. /:【.. ,,.,. .,,’,. ,.,.,, ?,.,,?,.,,. ,,.,,.; ’? .一,.一’,.一,.一,. ,.一,.,.,.一,.?,,.一,. ,.,.’,.,.一,.一 ,.. 。以上数据与文献报道的 数据一致,因此鉴定化合物为 , . ,回一一乙酰氧基.,,.三降.,.半日花烷交酯 ,,一一乙酰氧基.,,.三降.,一半日花烷交酯 .无色针晶,易溶于甲醇,..一?. ., ,一,.,,.,. ,一’,.,,,.,,. , ,,. 一’,. ,一’,.,,,.,,,. ,,一,.,,一’,.,,. ,一,.,,一,. ,,’;’, .’,.,.’, .一,.一’,.,.,.’,., 。一’, .’, .,.一,. 一’,., .,.一,..。以上数据与文献【报道的异落叶松脂素数 ..牡荆子化学成分及紫花牡荆素临床前药代动力学研究 据一致,因此鉴定化合物为异落叶松脂素.异落叶松脂素 一白色粉末,..?,. /:】., .,,亚甲二氧基氢,..,芳氢,. ,,.,. , ,.,,. ,一 一,.,,.,. ,一 ,. ,,一 一;? .?,,.一,,.一, ,.×业甲二氧基,.,.,.,.,. ×,.。以一上数据与文献报道的芝麻素数据一致,凶此鉴定化合 物为芝 麻素. 芝麻素 . ?白色针晶,易溶于氯仿,. /:】.. ,,. ,.,,. ,. ,,. ,.,, . ;? .一,.一,..,. 一, .一,一,..,一, .。。以』二数据与文献【】报道的对羟 . 基肉桂酸数据~致,因此鉴定化合物为对羟基肉桂酸? 对羟基肉桂酸 .第二军医人学硕士学位论文 一白色粉末,分子量,.反应呈阳性,.. ?,与熊果酸对照品在多种溶剂系统展开做对照,值及显色行为 一致,混合 熔点不下降,故鉴定该化合物为熊果酸 。 三 熊果酸 .黄色粉末,易溶于甲醇,..??,. /:?】..? ? .,,,.,,,.,,. , ?’,’,.,,. ,一’,’,.,,一,.,,. ,.,,. ,一,.,,一;??? .,.,.一,.一’,.一,.一,. 一’,’,.’,.’,’,.一,.,.,.一, ..。以上数据与文献‘报道的金合欢素数据一致,因此鉴定化合 物为金合 欢素.金合欢素 一 ?,? 橙色结晶,..? /:【】.? , ,一,. ,,. ,一,. ,,.,. , .,,. 一,.,,. ,,.,,.,. ,一,.,,, .,,,.,,一;? ., .,., .一,.一,.,.一,.一, .,.一,.一,.,.一,.一。以上数 据与文献【】报道的,.二羟基..甲氧基比酮数据一致,因此鉴定 化合物为,.二羟 .牡荆化学成分及紫花牡荆素临床前药代动力学研究 基一一甲氧基吡酮,一 . ,.二羟基..甲氧基吡酮 一黄色粉末,?州:】... .,,., .,,,,., ,,. ,,.,,一,., ,.,. ,,.,.,,.。以上数据与文献九报道的.羟基脱 氢松香酸数据~致,因此鉴定化合物为.羟基脱氢松香酸. . 一羟基脱氢松香酸 一黄色粉末,? /】.? .,, ,.,,,.,,’,.,,,.,, 一,.,,一,.,, ,’,.,, ,一’,., . ,, .,’;?? .一,.一, 一,.一,.一,.一’,.一’,.一,. 一’,.一’,.一’,.一’,.一,.,. 一,.,.,.’,.。以上数据与 文献报道的。羟基一,,’,’.四甲氧基黄酮数据一致,因此鉴定 化合物为.羟基 ,’,’一四甲氧基黄酮..,,’:..第二军医大学硕上学位论文 .羟基一,,’,’.四甲氧基黄酮 一 ? .,,一,.,,一,.,, . ,一’,.,,. ,一’,.,,. ,一’,.,, ,.,,,.,,,.,,;??.一,.一,.?,.一,.一, .’,.’,.一,.’,.一’, .’, .一’,.,.,.一,.,. ’一,.。以上数据与文献报道的.羟基.,,’,’.四甲氧基黄 酮数据一致, 因此鉴定化合物为.羟基一,,’,’.四甲氧基黄酮 ,,’,’. .羟基.,,’,’.四甲氧基黄酮 .白色粉末,易溶于甲醇。., .,,. , 一,,.,,. ,.,;., ., ..,..,,.., .一,。以上数据与文献例报道的对羟 基苯甲酸数据一致,因此鉴定化合物为对羟基苯甲酸? . 对羟基苯甲酸 .淡黄色结晶,易溶于甲醇。. .,,. ,,.,,. ,,.,,. ,,.,, . ,一’,. ,,. ,一’,.,,. ,一’,.,, .,’,.,,’一,;’? .?, .?’,.一,.一’,.一’,.一,.一’, ..’,.。以上数据与文献【】报道的对甲氧基肉桂醛数据一致, ..牡荆子化学成分及紫花牡荆素临床前药代动力学研究 因此鉴定化合物为对甲氧基肉桂醛一. 对甲氧基肉桂醛 本章小结 牡荆子为马鞭:草科牡荆属植物牡荆 .口胛门口帕胁的干燥成熟果 实。牡荆子具有较好的:咳平喘、镇痛抗炎等作用,该植物分布广泛,资源丰富,具 有很好的开发价值和前景。但由于对其化学成分研究不够深入,其物质基础不够明确, 限制了牡荆予的进一步开发与利用。 本研究以牡荆子药材为研究对象,经低温干燥及打粉后,用%乙醇反复网流 提取次,每次小时。减压回流后得到的总浸膏分别用二:氯甲烷、石油醚、正丁 醇、乙酸乙酯和水萃取,利用反相硅胶、硅胶、一柱层析、制备、 半制备液相等分离手段对牡荆子二氯甲烷部讧进行化学成分的分离,得到个化合 物,鉴定其中个化合物。我们通过比较了同属植物黄荆、牡荆、蔓荆、单叶蔓荆 以及穗花牡荆的化学成分,发现紫花牡荆素为一卜述植物的共有成分,为该属植物的 特征性成分,而月.本教研室对紫花牡荆素进行了多年的研究,明确其为抗经前期综合 征的丰要活性物质。但由于其药代动力学特征/明确,影响其进一步应用,所以对其 进行药代动力学研究,明确其药代学特征,对紫花牡荆素开发成新药显得尤为重要。第一:军医大学硕士学位论文 第二章 生物样品中紫花牡荆素体内分析的 方法学研究 紫花牡荆素,’,..,。,,.结构见图? 又名蔓荆子黄素,作为一个重要的黄酮类成分,广泛的存在于牡荆属植 物中,例如蔓荆、穗花牡荆、单叶蔓荆。据报道紫花牡荆素具有抗肿瘤】、抗炎 、抗高催乳素血症、抗氧化】、镇痛】等活性。近年来,紫花牡荆 素被认为是抗经前期综合征的主要活性物质,与传统抗经前期综合征的药物镇痛药、 雌激素相比,从天然产物中得到的紫花牡荆素具有更少的副作用,并在欧洲广泛的 用于治疗经前期综合征】.。鉴于紫花牡荆素具有抗炎、抗高催乳素血症、抗氧 化、镇痛等作用,其发展成为抗经前期综合征药物的潜力很大,所以建立一种选择性、 灵敏性高的定性、定量检测方法,对紫花牡荆素而言是十分必要的。在以往的研究中, 建立了几种通过.定性、定量检测紫花牡荆素的方法,但这些方法主 要着重于原材料的检测,而针对于生物样品的检测报道很少。本文主要的目的在于建 立一个快速准确、简单可信的.检测方法,并将其应用于紫花牡荆素的临床前 药代动力学研究。 一 图.紫花牡荆素的化学结构 一、仪器和药品 一实验仪器 型液相色谱一质谱联用仪,包括在线脱气机、四元泵、质谱检测 器、自动进样器和色谱工作站美国安捷伦公司;一型高速离牡荆了化学成分及紫花牡荆素临床前药代动力学研究 心机上海安亭科学仪器厂;.低速台式离心机长沙湘仪离心机仪器公 司; 电子天平瑞士梅特勒托利多公司;移液器 ,美国;氮气吹干装置。 ,德国;涡旋振荡器 二实验药品 对照品 紫花牡荆素对照品,纯度.归一化百分含量%以上,有本实验室 。 自南,检钡波长 山奈酚内标对照片购于中国药品生物制品检定所,纯度大于%批号: 。 试验药品 紫花牡荆素实验室自制纯度大于%,制备流程如下:取蔓荆子药材,自然干燥 后粉碎,过日筛,%乙醇加热同流提取次,减压回收溶剂至无醇昧。将剩余 》 浸膏均匀分散予蒸馏水中,石油醚、二氯甲烷、下丁醇和乙酸乙酯萃取,得到石油醚 部位、二氯甲烷部位、正丁醇部位和乙酸乙酯部位。取二氯甲烷部位硅胶梯度洗脱石 一纯化得到紫 油醚:乙酸乙酯:?:;氯仿.甲醇:.:,再经过 花牡荆素。 三化学试剂 色谱纯甲醇,购自于美国公司,磷酸为色谱纯,购自于美圈公司, 水为纯净水杭州娃哈哈集团有限公司,其余试剂均为市购分析纯。 四生物样品来源 健康大鼠由第二军医大学药学院实验动物中心提供,购自上海斯莱克实验动 物有限责任公司,空白动物血浆均取自未给药的大鼠。 二、实验方法与结果 一试验样品溶液的配制 紫花牡荆素溶液的配制 精密称取紫花牡荆素标准品. 容量瓶中,加甲醇超声 ,置于. 溶解并用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得. /紫花牡荆素的标准贮备液。用移第二军医人学硕士学位论文 液器精密吸取标准贮备液适量,采用逐级稀释的方法,加入甲醇配成浓度为. /的标准溶液。从标准溶液中用移液器精密吸取适量的紫花牡荆 /和. 素标准溶液,加入甲醇,配制成紫花牡荆素系列工作溶液,其浓度 分别为:.,., .,.,.,,和 /,以上溶液紫花牡荆素标准贮备液、 标准溶液和系列工作溶液均避光保存在?冰箱备用。 山奈酚内标溶液的配制 精密称取山奈酚化学对照品. 容量瓶中,加入甲醇超声溶 ,置于. 解并稀释至刻度,摇匀,即得. /的山奈酚标准贮备液。精密吸取山奈酚标 准贮备液一定量,采用逐级稀释加入甲醇,配制成山奈酚浓度为 /的内标溶 液。山奈酚的标准贮备液、内标溶液均避光保存在?冰箱备用。 紫花牡荆素大鼠血浆标准溶液的配制 用移液器精密吸取浓度为.,.,.,.,., ,和 /的紫花牡荆素系列工作溶液适量,加入大鼠空白血浆 与“内 标溶液。紫花牡荆素系列标准血浆样品需新鲜配制。 选用浓度为.,和 /的紫花牡荆素工作液为其低、中、高三个 浓度的质量控制浓度。紫花牡荆素样品需避光保存在.?以下备 用。 二血浆样品预处理 采用眼底静脉丛取血方式,取大鼠静脉血置于. 塑料离心管中, /离心 分离血浆。取血浆 塑料离心管中,加入 血浆置于. 二氯甲烷,涡旋 , ?含山奈酚/的甲醇溶液,涡旋 ,然后加入 :取有机相 离心 ,氮气吹干,加入 甲醇溶液复溶,涡 , , 旋 取上清液 再离心 进行样品分析。 三质谱检测条件 采用离子源正、负离子检测,选择选择性离子检测器工作方式进 行 /,雾化器压 质谱分析。质谱检测工作参数如下:干噪气温度?,流速 。 力 。碎片电压为:紫花牡荆素 ,山奈酚 :毛细管电压: .,山奈酚 系统适应性实验采用选择性正离子检测,紫花牡荆素【】/ .。 【】/ ..牡荆子化学成分及紫花牝荆素临床前药代动力学研究 四色谱分离条件 ×. 选用 . ,..:. 色谱柱;流动相:甲醇:水溶 ;柱温?,采用等梯度洗 液:,其中含有甲酸.%;检测波长: 。 脱方式,流速. /,进样量“,分析时间 五血浆样品方法学评价 分析方法的专属性 方法的专属性是反映该分析方法在排除共存物干扰的情况下对待测物专属而准 确的测定能力。对于生物体内药物分析方法研究而言,专属性通常是指通过对空白血 浆测定、标准品添加实验和峰纯度检查等方面进行考察。 由图?可见,在上述实验条件下紫花牡荆素的保留时间约为. ,内标山 奈酚的保留时间约为. ,大鼠血浆中的内源性物质及其它物质对体内紫花牡 荆素的含量测定未造成干扰。 图 .空白浆;.空白血.浆添 /与内标/;.第二军医人学硕学位论文 大鼠口服 ;.大鼠尾静脉注射 / / 图,/ /,/ / 线性测定和灵敏度检测 线性测定是指在一定的浓度范围内,采用该分析方法获得与待测样品物浓度成比 例的试验结果的能力,在大多数情况下采用线性回归分析方法如加权最小二乘法 所得到得回归方程来评价。在测定大鼠血浆中紫花牡荆素的实验中,标准曲线由 个不同浓度点构成,即.,.,.,.,.,,和 / 的紫花牡荆素系列标准血浆样品。每个浓度点配制份标准血浆样品,按上述血浆样 品预处理方法和色谱分离条件进行次重复测定,得到条定量标准曲线数据见图 对 ?,以血浆样品中紫花牡荆素色谱峰面积与内标山奈酚色谱峰面积比值 相应的紫花牡荆素浓度 ,/进行线性回归,标准曲线方程为.一. .,标准曲线在.. /范围内定量线性良好.。 .? ‘ .。 曙.:./ ?,以 一。 / .。 。牡荆子化学成分及紫花牡荆素临床前药代动力学研究 图. 条标准曲线图 ? 检测灵敏度反映了被测变化量相对于分析仪器的敏感程度。在生物样品分析中, 一般选用定量标准曲线上的最低检测限与最低浓度点即定量下限 来衡量分析方法的检测灵敏度。需符合以条件分析仪器对被测物的响 应值至少为空白生物基质干扰物响应值的倍斛?; 分析仪器对被测物 的检测浓度至少个标准样品应为添加浓度的%~%,且一%。 需符合以下要求:应能满足被测样品的榆测量至少为药代动力学研究~第二军医火学硕卜学位论文 个消除半衰期时生物样品中的药物浓度或达峰浓度的/~/的药物 浓度; 每个测 其响应值至少应为空白生物基质干扰物响应值的倍/?; 定浓度至少个标准样品应为添加浓度的%~%,且测试结果 ?% 在本实验中,为. //且弋%;为 //且一%. 精密度和准确度 精密度是指在特定的分析条件下,反映了在相同基质的情况下相同浓度被测样品 一系列测量值的离散程度,具体数值用相对标准差反映,在通常情况下样品 的应小于%,附近低浓度样品应小于%。 准确度反映在特定的分析条件下被测样品的检测浓度与真实浓度之间相接近的 程度,具体数值大小用相对回收率表示,一般样品的相对回收率应在%~%之 间,附近低浓度样品应在%~%范围内【”】。 在生物样品分析过程中,一般通过选择低、中、高个浓度的质控样品点同时进 行该检测方法的精密度和准确度考察。低、中、高个浓度的一般选择原则为:低浓 度选择通常在的倍以内,高浓度接近于标准曲线的上限,中间选一个浓度。 测定日内精密度,每个浓度至少测定个相同浓度的样品;测定日间精密度,应在不 同的天数连续制备并测定被测检测物,至少有连续个分析次个样品。 日内精密度和准确度考察 选择紫花牡荆素浓度为.,和 /的低、中、高个不同浓度的 标准血浆样品作为质控样品,每个浓度点配制份标准血浆样品,按上述色谱 分离条件和样品预处理方法进行次重复测定,检测出的血浆样品中内标山奈酚色谱 峰面积与紫花牡荆素色谱峰面积比值代入紫花牡荆素血浆标准曲线,通过检测加入量 与测得量的比值求得相对回收率,计算日内、。 日间精密度和准确度考察 日问精密度和准确度考察通过配制紫花牡荆素的血浆标准曲线系列样品进行测 定,并且通过配制血浆样品进行方法学质量控制考察。配制含紫花牡荆素素为 .,和 /的低、中、高种样品,同时配制紫花牡荆素为., .,.,.,.,,和 /的血浆标准曲线系列样品,置于牡荆子化学成分及紫花牡荆索临床前药代动力学研究 .?冰箱保存。同时连续天每天进行低、中、高个浓度的质控样品分析,每个 浓度份,共个分析批,所得峰面积比值代入当天血浆标准曲线中,通过比较加入 量与测量值的比值求得相对回收率,计算日问、。连续天每天检测一组血 浆标准曲线系列样品,以血浆样品中紫花牡荆素色谱峰面积与内标』奈酚色谱峰面积 ,/进行线性同归,得条紫花 比值 对相应的紫花牡荆素浓度 牡荆素血浆标准曲线方程。结果如表一所示。 表.紫花牡荆素血浆样品日内闩问准确度和精密度考察连续天, , 基质效应和绝对回收率 绝对基质效应计算方法为 样品与 样品色谱峰面积比; 样品为将紫 花牡荆素标准添加血浆样品.,和 /低、中、高浓度的空 白血浆液.液萃取添加目标成分得最终测定浓度进行分析; 样品为配制最终测定 浓度的含基质的纯样品溶液; 样品为紫花牡荆素标准添加血浆样品., 和 /低、中、高浓度,按照样品前处理操作进行分析测定。相同浓 度的 样品所得到的色谱峰面积与“样品的色谱峰面积比得到了紫花牛:荆素和 样品与 内标的基质效应;绝对回收率计算方法为 样品的色谱峰面积之比, 基质效应与绝对回收率结果见表.,如表所示在.,和 /三个质 控点浓度下,紫花牡荆素的绝对基质效应分别为%、%、%,内标的绝对基 质效应为%;绝对回收率结果显示紫花牡荆素在以上三个浓度分别为%、 %、%,内标为%。第二军医火学硕士学位论文 表.紫花牡荆素与内标山奈酚在不同浓度下的绝对回收率和基质效应,样品稳定性 样品稳定性反映了待测物在一定时问内、确定条件下、特定环境介质中的待测检 测物的稳定程度。在生物样品分析过程中,为了保证实验结果的准确性和可靠性,需 要根据具体情况,对含待测检测物的生物样品在室温、冰冻和反复冻融条件下以及在 不同存放时间情况下进行稳定性考察,以确定生物样品的时间和存放条件;同时,还 应注意储备液的稳定性以及样品处理后的溶液中待测物的稳定性。 本实验含紫花牡荆素为.,和 /的低、中、高个浓度的质控 样品,分别考察了血浆样品室温下放置小时、冷冻保存天、次反复冻融后的 稳定性以及血浆预处理后室温下放置小时的样品稳定性。在以上条件保存后,对 含紫花牡荆素的待测样品进行色谱分离测定,通过比较得到的浓度和加入的浓度,以 、形式计算含紫花牡荆素的待测样品在不同条件、不同介质、不同时间下的 稳定性,结果表明紫花牡荆素血浆样品在上述条件下稳定性良好,具体数据见表..牡荆子化学成分及紫花牡荆素临床前药代动力学研究 表?紫花牡荆素样品溶液的稳定性 三、讨论 一生物样品预处理的优化 体内药物药物分析是人体或动物的组织或体液的药物浓度分析,由于药物进入 体内会发生反应故存在形式有多种,而且由于待测药物浓度较低,生物介质组份复杂、 干扰物质多,所以除极少情况下生物样品经过简单处理后直接进行测定外,大多数物 质在测定之前都要对样品进行预处理,从而达到分离、净化、富集的目的,为药物的 测量创造良好条件,同时也可以延长色谱柱的寿命和防止仪器的污染、劣化,提高测 定的准确度、灵敏度、精密度和选择性等。 样品的预处理时体内药物分析的重要环节,也是分析中最繁复、困难的部分。 目前:物样品分析主要的预处理方法有液液萃取法、蛋白沉淀法和吲相萃取法。本文 通过比较了不同的蛋白沉淀剂和萃取剂,最终确定了用二氯甲烷为萃取剂的液液萃取 方法。 蛋白沉淀法