人类性激素结合球蛋白的单克隆抗体
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人类性激素结合球蛋白的单克隆抗体
(SHBG):表征在一个简单的酶联
性激素结合球蛋白(ELISA)检测血浆中的免疫吸附试验
约翰G ?刘易斯*,尼古拉斯J.朗利,彼得A. 爱尔德
类固醇及免疫学生物化学实验室,临床生化组,坎特伯雷卫生实验室,新西兰基督城
23日 1998年5月22日,1998年11月
摘要
提出了四个人类性激素结合球蛋白的单克隆抗体和特点 。 四分之三个抗体
公认的SHBG不同的抗原决定簇 。 两个不同的抗体用于免疫印迹,并确认
人体血浆中46 kDa的次要组成部分以及主要48 kDa区。 碳水化合物的残留物不会形成抗原的一部分
这两种抗体的决定因素,尽管这些发现增加的信号,去除N -连接低聚糖。 在同一天有些
被选中的抗体在HSBG的基础上在血浆中,进行非竞争,酶联免疫吸附试验(ELISA) 。 该试剂盒采用纯化IgG2a性激素结合球蛋白单克隆抗体吸附到一个微孔板井。 在阻止任何物质进一步吸附到板上,在室温下分别加入标准或稀释患者样本经过5 h的潜伏期后
板被冲走,反SHBG过氧化物酶标记的IgG1单克隆抗体检测抗体绑定SHBG
antimouse IgG1和 邻苯二胺底物。 与现有的2天ELISA检测相关血浆SHBG使用
多克隆抗体,并与dihydrosterone(DHT)的配体结合法相关 。 单克隆抗体为基础的ELISA显示
性能优良的特点,是增加睾丸激素或雌激素的影响 。 ? 1999爱思唯尔科技公司保留所有权利。
关键词:单克隆抗体;性激素结合球蛋白SHBG,ELISA
血浆性激素结合球蛋白(SHBG)的水平
广泛使用性激素检测,以确定
蛋白质之间的分布性类固醇激素
必然和自由的分数[1] 。 很明显,水平低
SHBG条件可能与过度的一个
氢行动2],且有在近期利益关系
性激素结合球蛋白和血浆脂蛋白之间tionship [3]。 在
此外,unliganded血浆中的作用的类固醇结合蛋白
作为一个传递机制的约束膜受体蛋白
靶细胞的类固醇备受关注[4,5]
并建立了一个功能链接到类固醇激素受体
职权范围[6]。 SHBG在细胞水平上,并在的研究
流通可以提高使用的单克隆
SHBG tibodies。 在这里,我们报告的生产和char
acterization四个单克隆抗体对人类SHBG
SHBG研究可能证明有用的工具。 在
此外,我们在同一天,简单报告其使用,并
直接酶联免疫吸附试验(ELISA)
人类血浆中SHBG。 虽然其他人已经报告
SHBG [7,8],放射免疫和酶联免疫吸附检测
也是第一份报告,使用专门的单声道的 ELISA
单克隆抗体。
1。 实验
1.1。
人类性激素结合球蛋白是从斯克里普斯实验室获得,
加利福尼亚州圣迭戈,美国和Antimouse IgG1的过氧化物酶和
antimouse IgG2a北欧免疫过氧化物酶,弼
伯格,荷兰。 Antimouse免疫球蛋白过氧化物酶和isotyping
从生命科学学院,英国Amersham公司,试剂盒。 兔聚;
对人类SHBG,都完好无损,过氧化物单克隆抗体
案例分析标记,DAKO公司,卡奔塔利亚,
美国加利福尼亚州。
*通讯作者。 邮政信箱151,新西兰基督城。 电话:
64-3-364-0888传真:64-3-364-0889。
E - mail地址:johnL2@chhlth.govt.nz(JG刘易斯)
类固醇64(1999)259-265
0039-128X/99 / $ -见前面问
? 1999爱思唯尔科技公司保留所有权利。
有价证券投资收益:S0039 - 128X(98)00119-6
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1.2。 免疫和细胞融合
女RBF - DN小鼠免疫10克
在完成Freunds辅助SHBG每隔4周。
一个星期后的第三次注射,脾脏切除
FOX - NY骨髓瘤细胞融合的比例脾细胞
5:1如前所述[9]。
1.3。 筛选的上清
酶标板(猎鹰3912微量三; Beckton迪克
inson,奥克斯纳德,CA)分别涂在4 ? C过夜100
L /以及兔抗- SHBG血清,稀释的磷酸 BUFF
ERED等效液(PBS),29升的抗体在10毫升PBS。 磷
phate,缓冲液为0.05 M的NaH
2
宝
4
,0.15 M氯化钠(NaCl),
5个M氢氧化钠调整pH值至7.4。 次日,
板洗涤用PBS含0.1,的四倍
吐温20(V / V)和阻止缓冲液PBS CON -
含0.1,的Tween - 20(V / V)和0.1,明胶(W / V)] 150
L / 5-10分钟,以及在20 ? C 后板被掏空,
100升稀释,汇集,人类妊娠血浆(1:1000
在缓冲液中),其中包含的SHBG水平升高( 400
nmol / L的),每孔加入孵育过夜
在4 ? C 翌日,板块再次洗净,
缓冲液和50升,每孔加入,其次
上清液50 L的2 - H进一步的潜伏期在20 ? C
板洗四次,羊antimouse
免疫球蛋白过氧化物酶(100升/以及在1:1000在检测
缓冲区)在20小时1?,分别洗净后,板,
和底物溶液加入。 基板是新鲜
编制由40毫克 邻苯二胺
60升30,的H
2
Ø
2
100毫升0.05 M娜
2
宝
4
和
0.025 M柠檬酸,pH值5.0。 颜色发展端子
提早终止100升1.25氢
2
SO
4
每口井,
在492 nm处读取吸光度。 使用一个贝林
ELISA处理器II(德国赫司特,)允许半AU -
进程tomation的。
1.4。 SHBG Dako公司酶联免疫吸附
SHBG使用Dako公司多克隆抗体的酶联免疫吸附
制造商的建议进行了 。
简而言之,包被酶标板4?,过夜
完整的兔抗SHBG血清稀释在PBS(29日升 10
毫升PBS)中,每孔100升。 翌日板
洗涤缓冲液(150升,每孔)阻塞
1小时在20 ? C 板倒置,然后清空
图 1。 (一)SDS - PAGE电泳免疫印迹人类妊娠血浆,车道
1,人类男性的血浆,2巷,探讨抗体11F11 。 车道
载有相同的样品负荷和巯基乙醇存在。
分子量标记表示。 (二)SDS - PAGE电泳免疫印迹
部分纯化的人类SHBG以下deglycosylation,泳道1和
3,探测与抗体11F11和7H9,分别。 部分纯化
非deglycosylated人类SHBG,2和4车道,探讨与抗体
11F11和7H9表示。 车道包含相同的样品负荷
巯基乙醇存在。
图 2。 相对的抗原决定簇映射 。 酶标板涂有
性激素结合球蛋白多克隆抗体和0到400 nmol / L的标准除了
多克隆抗体绑定SHBG顺序探讨用单克隆
抗体,如前所述,每个抗体之间的洗涤步骤 。 单
对性激素结合球蛋白的单克隆抗体2G11,7H9,16D5(亚型IgG1的),并
11F11(亚型IgG2a)。 单克隆抗体的结合
SHBG检测antimouse IgG1的过氧化物酶和antimouse IgG2a -
过氧化物酶(分别为IgG1的和IgG2a) 。
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SHBG 100升的标准血浆或患者血浆(1:1000
缓冲液稀释)以上,每孔加入
晚上潜伏期在4 ? C。 SHBG标准血浆
来自池,女,孕晚期,怀孕
血浆中有400 nmol / L的SHBG水平 标准
等离子最初是在缓冲液稀释1:1000和然后
连续生成了一系列的标准,从0到 400
nmol / L的 板块再次洗净,过氧化物酶
标记的兔抗血清性激素结合球蛋白(缓冲液1:3000)
在20 ? C孵育6小时,每孔100升 “
板终于洗净, 邻苯二胺分
strate上架。
图 3。 Dako公司酶联免疫吸附测定血浆SHBG水平,使用性激素结合球蛋白多克隆抗
体和血浆性激素结合球蛋白结合配体的比较
ELISA法测定的11F11/16D5(面板A和C)或11F11/2G11(板B和D)的组合使用性激
素结合球蛋白单克隆抗体的水平。
表1
deglycosylation血清SHBG水平的影响:去除N和O -连接寡糖
检测抗体
2G11
7H9
16D5
样品稀释
0.5
1.0
2.0
0.5
1.0
2.0
0.5
1.0
2.0
Deglycosylated
血清
48
2
90
4
184
3
81
8
134
2
259
8
69
1
120
12
250
1
对照血清
40
1
80
4
160
10
43
10
103
14
203
24
42
2
79
1
154
2
SHBG是通过检测抗体酶联免疫吸附使用11F11作为涂层抗体检测。 值(nmol / L的)
quadruplicates手段
政府统计处。
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1.5。 SHBG ELISA法(单克隆抗体)
酶标板包被蛋白的纯化
单克隆抗体11F11稀释1:1000 6米水
盐酸胍(1.0克/毫升),100升,每孔过夜,
4 ? C。 然后冲板和缓冲液受阻
在20 ? C 1小时 板被掏空颠倒,
无论是标准或样品分别加入先前
刻划为5 h在20 ? C 板,然后洗4次,
和100升的单克隆抗体上清16D5(1:20在
缓冲液)20?时为30分钟,每孔加入
板清洗和antimouse IgG1的过氧化物酶
添加(1:1000缓冲液)为20分钟,另有30 ? C
和后续处理说明。 一个系列exper,
iments测量在男性和女性血浆的性激素结合球蛋白
或者补充睾酮所载越来越多
(0.7-347 nmol / L的)或雌二醇(0.7-368 nmol / L的),以确定
有无明显的SHBG水平是受另外
这些类固醇进行。
1.6。 SHBG配约束力的检测
血浆SHBG是由配体结合检测
法[10]。 简言之,血浆或标准进行稀释
用冷PBS和400升的8倍重复等分培育
bated同为100升0.75纳克的DHT的混合物和
20 000 DPM
3
H - DHT或100吴DHT和20 000 DPM
3
PBS 10分钟的H - DHT在4 ? C。 等体积
冷,饱和硫酸铵添加,混合,和
孵育10分钟(1500
G)在4 ? C
管,离心,取上清液计算。 无线电
从第一套管积极计数更正
所使用的管和结果第二组的淬火
插上的标准曲线。
1.7。 蛋白层析
性激素结合球蛋白单克隆抗体纯化培养
TURE上清蛋白- A通过使用色谱
阿菲凝胶蛋白一个地图II试剂盒(Bio - Rad公司,大力士,CA,
美国)。 这个系统允许的净化至10毫克
鼠标从200毫升培养上清抗体。 后续
ING广泛透析对自来水的纯度
孤立鼠IgG证实了琼脂糖凝胶电
电泳在pH值8.9。 纯化的免疫球蛋白
冻干玻璃小瓶,并存储在
20?,直到重新
quired。
1.8。 SDS - PAGE电泳,Western印迹
垂直十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶
电泳(SDS - PAGE)进行了10,聚
丙烯酰胺凝胶[11]与人类相同的负荷
血浆和使用Bio - Rad公司的迷你Protean的系统 。 横贯
FER至硝酸纤维素核实使用Bio - Rad公司
万花筒预染色标记。 抗体染色,
硝化棉最初封锁潜伏期在三
缓冲生理盐水(TBS)(0.015 0.15 M氯化钠(NaCl),中号三,pH值7.4)
含0.1,吐温- 20(V / V)和1,牛血清
白蛋白(BSA)(W / V)20 ? C时为1小时 硝酸纤维素
当时含0.1,的TBS洗(三次)
Tween - 20与文化稀释上清孵育
1点20含有超过0.1,的Tween - 20和1,BSA的TBS
夜间在20 ? C。 硝化棉是洗(三次)
孵育antimouse免疫球蛋白过氧化物酶(1:10 000
TBS的含0.1,Tween - 20与1,BSA)1 h后
20 ? C。 最后,硝化棉是洗涤和免疫
增强化学发光法通过可视化的结合物
(Amersham公司)。
1.9。 相对的抗原决定簇的映射
进行了实验,以确定是否
性激素结合球蛋白,单克隆抗体11F11(亚型IgG2a) recog
nized从这些不同SHBG行列式超
上清2G11,7H9,或16D5(所有同型IgG1的)。 酶联免疫吸附
涂板Dako公司的多克隆抗体,阻断,
SHBG标准如前所述。 “
表2
纯化的SHBG水平的deglycosylation影响:N的去除和
O型挂钩低聚糖
检测抗体
2G11
7H9
16D5
Deglycosylated SHBG
114
11
145
14
218
16
控制SHBG
110
10
113
11
106
11
SHGB测定涂层抗体酶联免疫吸附使用11F11和
检测抗体的指示 。 值(nmol / L的)是指dupli
盖茨的SD。
表3(a)
O型挂钩低聚糖清除血清SHBG水平的影响
检测抗体
7H9
16D5
样品稀释
0.5
1.0
0.5
1.0
酶处理
血清
68
6
153
15
48
5
100
10
对照血清
74
5
179
16
46
6
105
9
表3(b)
随后的N -连接寡糖去除血清SHBG的影响
各级
检测抗体
7H9
16D5
样品稀释
0.5
1.0
0.5
1.0
酶处理血清
45
4
98
7
60
6
114
9
对照血清
35
4
81
7
46
5
82
8
SHGB测定涂层抗体酶联免疫吸附使用11F11和
检测抗体的指示 。 值(nmol / L的)是指dupli
盖茨的SD
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翌日,竞争实验,以确定
无论是IgG1的性激素结合球蛋白抗体上清(2G11,7H9 ,
16D5)能阻断11F11随后约束力
上清(同型IgG2a),反之亦然进行了
加上适当的控制。 这些实验
开展使用每30分钟连续孵化
在室温彼此之间的洗涤步骤
tibody孵化。 约束的单克隆SHBG抗体
终于发现与antimouse IgG1的过氧化物酶
和/或antimouse IgG2a过氧化物酶(缓冲液1:1000)
与先前所描述的类似的条件。
1.10。 Deglycosylation的SHBG
SHBG从孕晚期,人力,怀孕血浆
通过亲和层析纯化使用Pro
蛋白质纯化的11F11抗体共价连接到CNBR
活化琼脂糖- 4B。 部分纯化的SHBG分
jected酶低聚糖释放前SDS
PAGE和Western印迹法来确定,如果任何
抗体识别的是N或O型连锁oligosaccha
加载上SHBG。 一个血浆样本还受到
deglycosylation,连同SHBG准备,
使用单克隆抗体
的ELISA检测
11F11涂层钢板和2G11,7H9,或DE - 16D5
tection抗体antimouse IgG1的过氧化物酶
如上所述。 结果与对照组相比,
样品用去离子相同的对待 DIS
蒸馏水代替酶。 接下来的n -和O -
挂钩低聚糖的释放,血浆样品
赛义德在三个不同稀释度一式四份,
部分纯化的SHBG一稀释法测定
重复。 寡糖的酶法释放车
里德,来自Bio - Rad使用deglycosylation套件
实验室。 用试剂盒提供的牛
胎球蛋白控制,这是一个效率的检查
deglycosylation。
1.11。 正常范围等离子体
从访问正常范围内的血浆
基督城Endolab参考范围收集CON -
senting的选民登记册上的成年人 。 绝经前
女性年龄范围为23-43年,而男性的年龄范围
是30-70岁。 妊娠血浆样品
在孕晚期妇女。
2。 结果与讨论
融合协议,连同筛选和subse
quent recloning,确定了4个杂交瘤细胞株的秘密
ING以性激素结合球蛋白的抗体 。 (2G11,7H9,其中三个
16D5)IgG1的亚型;第四,11F11,IgG2a。
两个抗体(11F11和7H9)是有用的
SDS - PAGE电泳,Western印迹,确定一个主要的48K SPE
CIES和未成年人血浆中的46K组件[12 ]
在人类怀孕等离子体增强的信号相比,
正常成年男性血浆[图。 1A]。 当部分纯化
人类SHBG遭到N和O型挂钩低聚糖
charide释放SDS - PAGE和Western印迹
婷,这些抗体表明迁移的转变并没有损失
相比,未经处理的控制SHBG的信号。
这表明分子量的损失
碳水化合物的去除和碳水化合物的组成部分
SHBG不直接构成的抗原决定簇
11F11或7H9抗体[图。 1B]。 事实上,抗体7H9
呈增加的信号以下deglycosylation ,
这是与抗原的概念一致阻止
minant是在SHBG的糖基化位点靠近
和碳水化合物的去除允许抗体7H9 IM
证明其结合位点的访问 。 效率degly
cosylation证实了并行处理的牛
胎球蛋白,这显示了类似的迁移转变的SDS -
页(数据未显示)。
相对的抗原决定簇映射实验
表明11F11的单克隆抗体(IgG2a亚型 )
不与任何三个IgG1的共享抗原决定
单克隆抗体(2G11,7H9,或16D5)(图2)。
在上游面板图进行比较 。 2,对于
抗体2G11,表明产生的剂量-反应曲线
ated时Dako公司抗体绑定SHBG探测与
11F11和抗体2G11终于antimouse
IgG2a过氧化物酶是相同的,11F11其次
表4
从3例(样品1,2,3)血浆样品线性测定SHBG在不同的血浆稀释,使用11F11/2G11和
11F11/16D5
抗体组合
样品
抗体结合
11F11/2G11
抗体结合
11F11/16D5
1
2
3
1
2
3
稀释
1:1000
5
2
64
5
192
20
10
2
62
5
242
21
1:2000
4
2
28
3
72
6
7
2
27
4
135
10
1:4000
一
14
2
33
4
一
13
2
74
6
1:8000
一
7
2
16
2
一
5
1
33
4
值(nmol / L的)是重复的SD。
一
未确定。
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antimouse IgG2a过氧化物酶,提示无干扰
抗体2G11。 这是确认身份
曲线11F11和抗抗体2G11
鼠IgG1过氧化物酶和抗体其次2G11
antimouse IgG1的过氧化物酶。 另外值得一提的是缺乏
响应使用antimouse其次的抗体 11F11
作为控制亚型特异性IgG1的过氧化物酶。 西米,
larly抗体,2G1,7H9,16D5,其次
antimouse IgG2a过氧化物酶显示没有响应(数据未
所示)。
Dako公司多克隆SHBG ELISA相比,
单克隆抗体为基础的SHBG ELISA 11F11 /
16D5组合和11F11/2G11结合
如图。 分别为3A和B , 这些已被取消
通过使用各种组合的一个,纯化蛋白- termined
fied性激素结合球蛋白单克隆抗体,并表示,OPTI -
正常结果获得11F11涂层
抗体和16D5或SHBG第二现场的 2G11
antibodie。 后来,第二个系列实验使用不同
ferent病人样本显示一个比较单
单克隆抗体为基础的SHBG酶联免疫吸附与配体绑定
ING
,图。 3C和D.
deglycosylated血浆和SHBG测定
控制见表1。 SHBG测定上
部分纯化和deglycosylated SHBG相比
控制表2所示。 它们共同提供分
stantial有关的其它信息的性质
SHBG的各种抗体的结合位点 。 他们
确认的11F11的抗原决定不
共同与其他单克隆抗体,就像
2G11,相对碳水化合物去除的影响 。
关于抗体7H9的结果呈现出显着
cantly升高SHBG水平以下碳水化合物重新
去除率都与免疫印迹数据一致
建议增强约束力以下的碳水化合物去除 。
这也是与抗体16D5的情况下,甚至更高
明显的SHBG水平测定碳
水合物去除。 因此,它似乎在SHBG
7H9和16D5识别位点是在接近
N或O型挂钩低聚糖和他们重新
去除率允许提高抗体访问。 当另一SE -
糖酒会样品是O型挂钩低聚糖重新
去除率,其中包括desialylation步骤,和检测
使用固定11F11和7H9或作为16D5
检测抗体,之间有没有差异
酶处理和对照样品,每个抗体, SUG
gesting,性激素结合球蛋白抗体7H9的识别位点
和16D5不位于靠近O型挂钩
糖基化位点[表3A]。 类似的结果,其中
使用多克隆免疫法确定的SHBG水平
抗体sialylidase治疗后的影响,有
得到最近报道[13]。 O型挂钩degly
cosylation,包括desialylation步骤,N -连接寡糖
进行了pH值调整和糖类释放
此外,作为详细的试剂盒说明书,PNGase F
样品reassayed SHBG。 结果
表3b所示。 两者合计,抗体11F11,
2G11,和16D5/7H9认识到不同的网站上 SHBG
11F11和2G11独立的碳水化合物MOI
eties,和16D5/7H9认识到,在接近一个网站(S)
N -连接糖基团等,他们的去除
增强的抗体结合 。 据了解,两个N -
上SHBG挂钩的糖链在天冬酰胺
残留的351和367,这 是非常接近的C端
的蛋白质,这些残基之间的半胱氨酸 361
形成二硫键的半胱氨酸333 [14]。 因此,
似乎Western印迹数据的基础上 ,
这种债券由巯基乙醇裂解,随后
承认抗体7H9,是针对
SHBG,而不是更高的结构的主要结构
元素。 仍有待确定是否16D5识别
nises 7H9 SHBG相同的网站。 感兴趣的
观察,至少有一个N -连接的存在公开进修学院
gosaccharide是重要和高效的生产
分泌性激素结合球蛋白和他们不参与
类固醇性激素结合球蛋白[14]结合的特点。 在非
碳水化合物类固醇具有约束力的残留 volvement
符合我们的研究测量血浆中SHBG
样品中的存在和补充睾酮的情况下
或雌激素。 当样品,进行了分析immunore
通过使用单克隆抗体系统积极SHBG
涂层抗体,要么与11F11描述
2G11或作为检测抗体16D5,并无
样本之间的差异显著分析在AB -
添加类固醇,或者347 nmol / L的或368的感
nmol / L的补充睾酮和雌二醇,分别
(数据未显示)。
是否检测血浆正常范围相似
Dako公司的方法,DHT的配体结合,或11F11 /
16D5或11F11/2G11组合。 成年雄性范围
(9-40 nmol / L的平均20
10),成年女性的范围(23 -
加入100 nmol / L;平均48
20),和怀孕的范围(250 -
500 nmol / L的平均380
78)按照与其他
工人[7,10,15]。 Dako公司的方法和酶联免疫吸附
11F11/16D5或11F11/2G11组合显示林
earity上连续稀释的血浆样品(见表4) 。 在
traassay和测定间变异系数分别为
由每五个重复测定
4个质量控制等离子池 。 这些泳池范围
7日至150 nmol / L的SHBG。 抗体结合
11F11/2G11返回为批内,12,的变化
所有4个游泳池和测定间变异为18 ,
其余三池池和低14,。 安
tibody结合11F11/16D5生产批内
三个包含37个游泳池,60 12,的变化,
和130 nmol / L的性激素结合球蛋白和20,为低的变化
interas,类似的不精确值SHBG池
说变化。 最低检测SHBG水平是3
nmol /升两种抗体组合。
虽然其他有报道单克隆抗体
SHBG [12,16],抗体的特性重新
这里移植和ELISA检测后使用
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JG刘易斯等人。 /类固醇64(1999)259-265
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在血浆中SHBG表明这些单克隆抗体
SHBG可能证明是有用的的分析工具以及潜在
tially有用的附加 生物探针的研究
SHBG。 至少有一个,7H9,这些抗体能识别
网站包括表位比接近C -末端
氨基酸136-138单克隆抗体确认
小号
1
乙
5
[17],因此,可以增加单面板
SHBG的结构研究的单克隆抗体 。
此外,该抗体可以研究利息
后修饰的SHBG的地方比较
SHBG水平的儿子在并行使用抗体检测
11F11/2G11和11F11/16D5可以提供信息
性激素结合球蛋白糖基化的程度 。 这些抗体COM -
binations似乎是首选,因为比较
isons循环水平和推断成熟SHBG显示
极好的协议(图4) 。 然而,这些抗体的 COM
binations不会有用的调查临床
ICAL实用desialylated SHBG差检测
半乳糖的具体要求asialo - SHBG检测
探针[13]。 尽管这个限制,初始绑定
SHBG仍可以通过使用抗体
11F11本文所述。
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图 4。 用ELISA法测定血浆SHBG水平的相关性
SHBG
单克隆
抗体
11F11/16D5
和
11F11/2G11
组合。
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JG刘易斯等人。 /类固醇64(1999)259-265
英语原文:
Monoclonal antibodies to human sex hormone-binding globulin
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