融合蛋白在大肠杆菌中的诱导
达及G13结构域的分离纯化
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融合蛋白的诱导表达及包涵体的处理
将含有重组质粒pThioHisA-G13的
菌接种到含氨苄青霉素(50 mg/mL)的LB培养基中37oC振荡培养过夜, 按1%的接种量接种到相同的LB培养基中进行放大培养, 37oC振荡培养至OD600为0.5~0.6时, 加入终浓度1 mmol/L的IPTG, 37oC振荡培养, 诱导4 h后, 8000 r/min离心10 min收集菌体, 把菌体重悬于Buffer A(50 mmol/L Tris·HCl pH 7.9; 0.5 mmol/L EDTA; 50 mmol/L NaCl; 5% 甘油; 0.5 mmol/L DTT)中, 超声破碎菌体(超声4 s, 间隔 6 s, 120次循环, 功率500 W), 12 000 r/min离心 10 min, 取上清、沉淀进行SDS-PAGE (5%分离胶, 15%浓缩胶)电泳。
将沉淀用Buffer B (50 mmol/L Tris·HCl pH 7.9; 0.5 mmol/L EDTA; 50 mmol/L NaCl; 1% Triton X-100; 0.5 mmol/L DTT)洗涤, 4oC离心(12 000 r/min) 15 min。将洗涤后的包涵体溶于尿素溶液(8 mol/L Urea, 0.1 mol/L HCl), 4oC离心(12 000 r/min) 15 min, 收集上清, 进行SDS-PAGE电泳, 用凝胶分析软件BandScan进行灰度扫描分析融合蛋白在包涵体中所占的比例, Bradford法测定包涵体溶解液中的蛋白含量。
重组G13结构域的纯化及鉴定
按照蛋白质: CNBr为1:5的比率(W/W), 将 CNBr溶液(400 mg/mL)加入到包涵体溶解液中, 于室温下避光反应24 h[6], 加1倍体积的ddH2O终止反应, Tricine-SDS-PAGE(16.5%)电泳分析切割效果, 剩余样对2000 mL PB缓冲液透析48 h。透析产物经0.45 mm的滤膜过滤后上PB缓冲液(20 mmol/L, pH 8.0)预平衡的CM-32阳离子交换柱, 0~1 mol/L NaCl线性梯度洗脱, 收集目的峰。Tricine-SDS- PAGE分析纯化产物, ESI-MS检测其分子量。纯化后的样品透析脱盐后冻干, 溶于pH 7.2、10 mmol/L的PBS缓冲液中。