AFLP共显性标记的分离、应用与AFLP技术的改良
AFLP共显性标记的分离、应用与AFLP技
术的改良
第1卷第2期
2005年5月
南方水产
SouthChinaFisheriesScience
Vo1.1,No.2
May,2005
?
综述?
AFLP共显性标记的分离,应用与AFLP技术的改良
王小玉,一,喻达辉,龚世园
(1.华中农业大学水产学院,湖北武汉430070;2.中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州510300)
摘要:AFLP作为新一代的分子标记,其应用越来越广泛,技术也越来越成熟.文章综述了AFLP多态带转化为
SNPs,SSR等共显性标记的研究现状及AFLP改进技术的应用发展前景. 关键词:AFLP;共显性带;分离;改进技术
中图分类号:Q75文献标识码:A文章编号:1673—2227一(2005)02—0067—06 IsolationandusefulnessofcodominantmarkersfromAFLPs
andmodificationsofAFLPtechnique WANGXiao.yu,YUDa—hui,GONGShi—yuan
(1.FisheriesCollegeofHuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China;
2.SouthChinaSeaFisheriesInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Guangzhou51
0300,China)
Abstract:AmplifiedFragmentLengthPolymorphism(AFLP)isanewmolecularmarkertec
hniqueonthebasisofPCR.AFLPsare
widelyemployedinmanyfieldsandbecomemoreandmorepopular.YetAFLPsaredominant
markersandhavenaturallimitations. HowtoconvertdominantAFLPmarkersintocodominantmarkersandthemodificationsofA
FLPtechniquearethemainfocusofthisre—
view.TheapplicationsoftheAFLP—derivedmarkersarereviewedaswel1.
Keywords:AFLP;dominantmarker;codominantmarker;conversion
扩增片段长度多态(amplifiedJttlengthpolymor- phism,AFLP)分子标记技术,最早足Ili甜,Keygene公司
Zabeau等提出,并在近年来发展起来的极具生命力的分
子生物学技术.它有效的结合了限制性内切酶片段长度多
态性(RFLP)和随机扩增多态性(RAPD)的优点,克服
了RAPD的不稳定性和RFLP技术受探针来源限制的缺点,
且在缺乏研究对象的DNA序列信息的情况下,短时间内便
可获得大量的分子标记,重复性高.因此,为不同来源和
不同复杂程度基因组的分析提供了一个有力的工具.自从
Vos等第一次报道后,AFLP技术已广泛应用于遗传多样
性,性别鉴定,遗传图谱构建,基因定位E8等各
个领域.
然而,AFLP分子标记是显性标记,无法区分纯合体与
杂合体,具有一定的局限性.与一般基于PCR实验技术的
标记相比,AFLP标记技术要求熟练的实验技巧,价格也相
对较贵.因此,这种技术的使用仍受到一定的限制.近几
年来通过克隆和测序将AFLP显性标记转化为共显性标记
的研究或通过定量检测PCR产物而获得AFLP共显性信
息的相关研究已有不少报道.本文将对AFLP共显性标
记的分离转化及其应用前景和AFLP技术的改良作一简要
综述.
收稿日期:2005-04—12
资助项目:广东省自然科学基金(037148);番禺区科技
项目(2004.Z-61—1)
作者简介:王小玉(1976一),女,硕士研究生,从事海洋生物遗传育种研究.E—
mail:yuerxitan@163.eom 通讯作者:喻达辉,E—mail:yudh231@21cn.eom
南方水产第1卷
1AFLP标记技术的原理
AFLP标记技术的基本原理是利用PCR技术和凝胶电 泳技术对基因组DNA的双酶切片段进行选择性扩增,电泳 分离来检测扩增的DNA片段的长度多态性.一般用EcoRl 和MseI限制性内切酶将基因组DNA进行双酶切,然后将 酶切片段和接头(adapter)连接,连接产物作为预扩增反 应的模板,接头序列加1个选择性碱基作为预扩增引物进 行预扩增,其扩增产物作为模板,用含2-3个选择性碱基 的引物进行选择性扩增.扩增片段经过变性聚丙烯酰胺电 泳分离,银染或自显影检测,即可获得大量的DNA谱 带.对同一基因组DNA而言,引物的选择性碱基数目越 多,扩增出来的带就越少;反之,扩增出来的带就多. 2AFLP共显性标记的分离转化
2.1单核苷酸多态(singlenucleaotidepolymor—
phism,SNP)标记的转化与分离
SNP是指基因组内特定核苷酸位置上存在的单个碱基 的突变所引起的DNA序列多态性.在基因组DNA中任何 碱基均有可能发生变异,非编码序列的变异较多.SNP大 多为转换(transition)突变,即由一种嘧啶或嘌呤碱基转 换为另一种嘧啶或嘌呤.SNP在大多数基因组中存在较高 的频率,人类基因组具有大量的SNP,平均每1.3kb就 有一个SNP存在.因此SNP具有很高的信息含量. 从AFLP标记中分离SNP的方法包括多态带选择和再 扩增,测序,对测序结果首先进行序列比对(alignment)
分析,然后进行BLAST同源分析,并用过滤软件去除重复 序列SINEs和VNTRs(小卫星和微卫星),初步筛选出可 能含有SNP的序列.再用肉眼逐条检查可能存在SNP的序 列电泳图谱(electropherogram),同一位点有重叠峰出现 (两个碱基在同一位置出现),
明来源于父母本的两条染 色体其中1条发生了单核苷酸突变,初步鉴定出SNPs.为 了进一步验证SNPs,可以通过克隆测序,如果发现造成重 叠峰的2个碱基在不同克隆中出现,表明确实为SNP;也 可利用初步鉴定出的含有SNPs的序列设计特异引物,对基 因组DNA进行PCR扩增,直接测序,如果在同一位点仍 为重叠峰,表明该位点确实为SNP….其流程图见图1. Nicod等?"利用上述方法从鳟鱼中分离SNPs,结果在 29条序列带中的1O条发现了24个候选SNPs,29条带共 11.11kb的DNA序列,平均463个碱基就有1个SNP.19 个候选SNPs以杂合形式在个体内检测到,剩下5个候选 SNPs是通过将同一种群不同个体问的带对比得到.通过克 隆方法鉴定出6个SNPs,用特异引物法鉴定出l2个SNPs. 表明AFLP指纹技术是分离SNPs快速,简便而又廉价的方 法.Brugmans等也建立了从AFLP多态片段(100,400 bp)分离SNP标记的方法.
AFLP多态带
PCR再扩增【用原来AFLP多态带的引物】
,l~blast等确定候选SNPs.
肉眼检测初步鉴定SNt's
l
上隆,物基
多\/
图1AFLP显性标记转化为SNP标记
Fig.1Conve~ingdominantAFLPmarkersintoSNP
2.2微卫星(simplesequencerepeats.SSR)标
记的转化分离
微卫星(simplesequencerepeats,SSR)是指以几个核 苷酸(2,6)为单位以首尾相连的方式重复出现多次而组 成的一段DNA序列,重复次数一般为1O,5O,在基因组中 含量丰富,是共显性标记.由于基本单元重复次数的不同, 而形成SSR座位的多态性.用AFLP标记技术分离微卫星, 主要是利用AFLP的扩增原理将可能含有微卫星的酶切片 段大量扩增,从而有利于利用磁珠进行富集,大大提高了 微卫星分离的效率.主要包括双酶切预扩增产物富集和 单酶切产物扩增富集14]2种方法.从磁珠上洗脱下来的 DNA用相应的AFLP引物和扩增条件扩增,再克隆测序, 从所得的序列中找出重复片段位于中间部分,长度适宜的 序列,设计引物进行扩增筛选验证(图2).
高国庆等?用磁珠富集法从AFLP片段中分离微卫星 DNA标记,回收纯化14个片段,测序后发现都含简单重 复序列,其中5个是简并序列,其他9个特异序列中,7 个含有GA重复序列.在9对SSR引物中,Pm一15在44个 花生品种资源中测到4个等位位点.并比较了2种从AFLP 预扩增和选择性扩增片断中分离花生微卫星DNA的方 法?,说明从AFLP片断中分离出SSR标记的方法在研究 花生基因DNA多态性方面具有很大的应用潜力.Wong f畹
第2期王小玉等:AFLP共显性标记的分离,应用与AFLP技术的改良 等在对蜻蛉自然种群的AFLP带的特性分析时发现,大部分多态标记是共显性的,
其中部分标记包含微卫星序列.
微卫星位点
AFLP引物结合位点…一?
ib?E===,
变性的AFLPDNA一
链亲和素包被的磁珠
一寡核苷酸探针
一/
\
-.—J?=,【】?==】
--
o
,,
附与探针杂tssR的片段
J
l在磁场中沉淀磁珠洗涤除去无微卫星的片段
变性,洗脱SSR片段
J
田一含丰富微卫星I~DNA
IPCR扩增(用AFLP相应的引物)克隆,测序
图2采用磁珠富集法从AFLP片段中分离微卫星标记 Fig.2SchematicrepresentationofSSRisolationbymagneticbeadsfromAFLPfragments
2.3特异序列扩增(sequence-characterizedam-
plifiedregion,SCAR)标记的转化与分离
SCAR标记是通过对序列未知的DNA标记进行测序, 设计特异引物转化为基于普通PCR实验技术的分子标记. 扩增产生的片段具有序列已知,遗传一致性(identityby decent)的特点.简单易用,结果稳定,重复性强,是一种 简单实用的标记.因此将AFLP标记转化为SCAR标记可以 扩大AFLP标记的用途.利用AFLP分离SCAR标记的方法 见图3.
SCAR标记主要是围绕性状连锁的AFLP条带来分离筛
选的.xul1等成功地将与苹果抗真菌疤痕(Vf)基 因紧密连锁的AFLP标记转化成SCAR标记.先将与Vf紧 密连锁的AFLP标记从胶上回收,然后将其克隆到pBlue— script—KS质粒上,挑选出阳性克隆,用与原来AFLP标记相 同的引物再扩增,测序,设计SCAR标记的引物.用8个苹 果样品的预扩增产物作为模板DNA检测候选SCAR标记, 最后从15个AFLP标记中分离出11个SCAR标记. 2.4STS(sequence-taggedsite)标记的转化与分离
STS标记实质上与SCAR标记是一致的.也是将与目的 性状连锁的AFLP带进行测序,设计引物,将AFLP显性标 记转化成更简单,更可靠的基于PCR基础上的STS标记. Dussle等对与甘蔗病毒紧密连锁的抗性基因Scmv进行 了研究,将一显性AFLP标记(E35M62—1)转化成插入或 尉
挑选阳性克隆
再扩增
图3AFLP显性标记转化为SCAR标记
Fig.3ConvertingdominantAFLPmarketsintoSCAR
缺失标记,另一AFLP标记(E33M61—2)转化成CAPs (cleavedamplifiedpolymorphicsequence)标记,证实 E33M61—2在3号染色体上,E35M62—1在6号染色体上,与 原来的AFLP标记一样.Bradeen等曾用与Y2(控制胡萝1- o
70南方水产第1卷
素的富集)连锁的6个AFLP片段,通过f2图谱和集合分 离分析方法,发展了一个简单的,PCR基础上的共显性标 记的分离方法.先从AFLP片段中分离出与与Y2连锁的 标记用原引物再扩增,将产物纯化,克隆到质粒pGEM—T
中,转移到Zeta—Probe尼龙膜上Southern杂交,或从AFLP 片段序列中设计反向PCR引物,电泳检测其产物,再按上 面
杂交.
3AFLP共显性标记的应用
3.1种类鉴定
将AFLP标记转化为SNP标记后有助于解释个体的表 型差异,在系统进化和种群遗传学研究中具有很大的应 用潜力.而且,将AFLP标记转换为SNP后能详细描 叙等位基因的变化,有利于鉴定一些分类较模糊的种. Bensch等通过选取瑞典南北柳莺的两亚种(雄性)各15 只,用11对AFLP引物组合标记分析发现,在500个多态 AFLP标记中只有一个多态片段AFLPwwl显示明显的差异, 然后以这个片段为模板再扩增,测序,将其转换为一共显 性的SNP,从而对柳莺的两亚种进行了不同的分类j.Be— hura等对亚洲稻瘿蚊不同生物型(biotype)的AFLP分析 中,发现1个AFLP标记在生物型1,2,5有扩增带,而生 物型4则没有.通过测序将其转换为SCAR标记,通过 PCR扩增得到与AFLP同样的结果.生物型1,2,5对含有 Gm2抗性基因的稻无毒,而生物型4有毒.通过交配遗传 实验,进一步发现该SCAR标记与性别相连锁,结合RAPD 分离的SCAR标记通过套式PCR可将各个生物型分开". 3.2标记辅助选育
分子标记辅助选育(Molecularmarker—assistedselection,
MAS)通过检测与目标基因紧密连锁的分子标记,对育种 材料从DNA水平上直接对基因型进行选择,可以大大提高 育种中选择的准确性和效率,从而达到遗传改良的目的. 它是现代分子生物学与传统遗传育种的结合.近几年来 AFLP标记已用于各个研究领域的遗传图谱构建,但却不能 提供高通量的基因型数据.SNP已用于候选基因鉴定和基
因型的高通量筛选,因此,从AFLP标记中分离出SNP会 提高AFLP标记的应用范围,适于标记辅助选育.已有 AFLP标记与RAPD转化成SCAR标记用于植物标记辅助选 育的报道[2.并且利用AFLP转化成SCAR标记将更有利 于分子标记在选育中的应用.
3.3基因定位克隆
Meksem等将经过AFLP分析的目的片段克隆转换,从 2个大豆品种的1O个AFLP标记中分离出6个长960bp的 STS(sequence.taggedsite)标记,这些STS标记包含8个插 入或缺失,2个微卫星,8个SNP,并与大豆的抗性基因有 关,1在连锁群G上,Rhg4在连锁群A上,克隆的 AFLP带用于PCR再扩增,作为探针筛选大豆的BAC文 库].这种方法为未知基因的定位克隆,提供了一种有效 的工具.xu等将分离出的与苹果抗真菌疤痕(0基因紧 密连锁的15个AFLP标记中的1】个成功转化成SCAR标 记,这些SCAR标记的精细作图显示其中7个SCAR标记位 于基因的右侧,3个SCAR标记位于其左侧,1个位于其 中.因此SCAR标记可以很快地定位苹果的BAC文库,最 终获得基因.
4AFLP改良技术的发展与分离共显性标记
的前景展望
AFLP技术作为新一代的分子标记技术,自从其诞生以 来,已有大量文章开始发表,但它与其它分子标记一样也 存在许多不足之处.近几年来,AFLP技术有了很大改善与 发展,如采用单酶切或三酶切等.
4.1单酶切AFLP技术
这种方法是在传统的AFLP技术基础上以改进.采用 一
种酶,一个接头,酶切连接反应在一个反应内进行,使
用琼脂糖凝胶电泳代替变性聚丙烯酰胺凝胶电泳.这种单 酶切的方法能增加扩增带的特异性,减少弱带,每个引物 多态位点数多,所需时间短,实验过程较传统的AFLP技术 简单.可用于DNA指纹图谱构建.Suazo等用这种改进 的方法研究非洲蜜蜂与欧洲蜜蜂,优化PCR条件,带出现 的强度随DNA浓度增加,DNA浓度在2.0和2.5mM间时 结果具有重现性,引物浓度增加也会形成更多的带.对非 洲蜜蜂和欧洲蜜蜂的DNA样品采用3种引物进行AFLP分 析,结果所有引物都出现大量的多态带,而且每个样品都 有唯一的特异带,从而显示很大的遗传变异性.Rana— mukhaarachchi等用这种改进的AFLP技术与RAPD技术比 较研究植物的遗传特征,1O个RAPD引物共产生99条带, 其中49个是多态,筛选出的8对AFLP引物共产生95条 带,52条是多态,RAPD每个引物的平均带数为9.9, AFLP的平均带数为11.9,RAPD每个引物的平均多态带是 4.9,AFLP的平均多态带是6.6,说明改进的单酶切AFLP 技术的重复性,可靠性,应用性都大大加强,且能用于 病原菌的快速鉴定.
4.2SAMPL(selectiveamplificationofmicrosat-
ellitepolymorphicloci)指纹技术
是在AFLP基础上发展起来的一种指纹技术.利用与 AFLP相同的模板并经过双酶切,对应接头连接和预扩增. 所用引物对中一个是AFLP选择性引物,一个是包含一段 复杂微卫星序列的SAMPL引物,由于微卫星座位是基因组 高变区,从而再对遗传变异低的样本进行分析时,SAMPL 分析就显得更加灵敏,高效,能有效的显示关系较近的基 因组高变异区微卫星位点的不同,评估种群内遗传变 异].Singh等对印度楝树采用EcoRI/MseI共1O对引物组 合进行AFLP分析,产生422个扩增片段,E—ACG×M—crITI'
这对引物扩增出54个片段,多态带占44%,但排除外来添 加种后只发现22%的多态片段,而(GA).TAT/M—CTA的
第2期王小玉等:AFLP共显性标记的分离,应用与AFLP技术的改良71
这对SAMPL引物组合共有61个扩增产物,89%的扩增片 段是多态,因此其检测出的多态百分数比AFLP技术的 高.
4.3TE.AFLP
TE—AFLP(threeendonuclease—AFLP)即三内切酶扩增 的限制性长度多态性,是由荷兰科学家derWurff在AFLP 技术基础上发展起来的一种新的指纹技术.用两种低频 率切点内切酶(通常为6碱基位点识别酶)和1种高频率 切点内切酶(通常为4碱基位点识别酶)代替了AFLP技 术的双酶切,但仍用两个接头连接,产生的片段只与低频 率切点内切酶所切片段末端有共同粘性末端的2个人工接 头连接,选择性扩增的引物末端加上1,2个选择性核苷 酸,使既能与接头粘性末端配对又能与引物的选择性核苷 酸配对的限制性片段得到扩增.这种方法可以减少传统 AFLP技术中带的数量,提高复杂基因组的分辨能力.肖兴 国根据自己的理解和与发明人的个人通信讨论认为:TE— AFLP经济,快速和操作简单方便的特性将会比常规AFLP 的应用更广泛,更普及.Lindstedt等采用BsrGI和XbaI 两种罕见限制酶与HinP1I或MseI常见酶酶切,将XbaI— MseI和XbaI—HinP1I组合,BsrGI酶作为第二种罕见酶酶切, 当采用XbaI—MseI时,扩增片段数由14增加到20,增 加了AFLP标记的分辨能力.
AFLP标记的多态是通过限制位点的选择性碱基数来检 测,对于大基因组物种而言,增加选择性碱基数可以减少 带的复杂程度,但是一些小基因组的物种若采用传统的
AFLP分析将限制大量数据的产生.James等利用选择性碱 基数减少到1或0的改进技术,对草莓黑斑病进行AFLP分 析,当EcoRI+1碱基与MseI+3碱基组合时可产生足够的 带,E+2与M—C组合产生带最多,在44和101之间. 这种方法为小基因组的物种研究拓开了一条新的道路.万 春玲等在上述单酶切技术的基础上对AFLP技术从限制性 内切酶水解,扩增条件,检测方法3方面又作了一些改进, 采用PstI单酶水解基因组DNA,高温退火经过一次PCR扩 增,扩增片段大多在100,2500bp问,小面积变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳即可获得丰富的多态性带,使得AFLP标记 更简单,经济,适于一般
研究.
4.4AFLP分离共显性标记的前景展望
AFLP分子标记技术已经在农业,林业,畜牧业,水产 等诸多领域广泛应用,从其显性带中分离出的共显性带具 有更加广泛的用途.尽管AFLP技术存在对模板质量要求 较高,谱带有可能发生错配和缺失,成本较高,实验操作 技术较复杂等缺点,但在这种技术基础上演变出的改进方 法已越来越多,使AFLP技术逐步完善,应用也更加灵活, 相关方面的研究文献呈现逐年上升趋势.AFLP技术的不断 改良和发展,将在遗传图谱的构建,重要经济性状的定位, 基因表达,微生物鉴定等方面有更广泛的用途. 参考文献:
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