实验报告水杨酸经无毛小鼠皮肤的扩散试验
学号: 132******** 姓名: 冯兴业 导师:陈钧
1.实验目的与要求
通过水杨酸经无毛小鼠全皮及去角质层皮的扩散试验,掌握体外经皮扩散试验的方法以及药物透皮参数的计算方法。学习无毛小鼠全皮玻璃和去角质层皮的制备方法。
2.实验指导
药物通过皮肤的扩散为被动扩散。皮肤对各种药物的透皮特性在体外可用扩散池(diffusion cell)进行研究,以人或动物的离体皮肤(全皮或分离的各层皮肤)作为皮肤模型。本实验采用K-C垂直扩散池。离体皮肤固定于两个半池的结合部,角质层朝向供给池。供给...
水杨酸经无毛小鼠皮肤的扩散试验
学号: 132******** 姓名: 冯兴业 导师:陈钧
1.实验目的与要求
通过水杨酸经无毛小鼠全皮及去角质层皮的扩散试验,掌握体外经皮扩散试验的方法以及药物透皮参数的计算方法。学习无毛小鼠全皮玻璃和去角质层皮的制备方法。
2.实验指导
药物通过皮肤的扩散为被动扩散。皮肤对各种药物的透皮特性在体外可用扩散池(diffusion cell)进行研究,以人或动物的离体皮肤(全皮或分离的各层皮肤)作为皮肤模型。本实验采用K-C垂直扩散池。离体皮肤固定于两个半池的结合部,角质层朝向供给池。供给池内的的药物在一定条件下不断通过皮肤向接受池扩散。
3.实验内容
1. 全批处理:取无毛小鼠,断颈处死或水合氯醛麻醉后,用手术剪剪取背部或腹部皮肤,然后小心剔除皮下肌肉组织,取得离体全皮。将处理好的离体皮肤置于载玻片间,用游标卡尺测量皮肤的厚度。
2. 去角质层皮肤的处理:首先将无毛小鼠四肢固定,用封胶带均匀贴在欲除去角质层的皮肤上,然后揭去胶带,反复操作30-50次,即可除去角质层。测定去角质层皮肤的厚度。
3. 用游标卡尺测量接收池口至少三个方向的直径,计算扩散面积。接受池中加入一粒搅拌子。
4. 剪取适当大小的皮肤,将真皮层对着接受池,夹于两池接口处,用固定器固定,以免渗透溶液。将各对扩散池置于透皮扩散试验仪(TK-20A)中,调整水域温度为37±0.5℃,搅拌转速控制为200rpm。
5. 在扩散池的的接受池内加入蒸馏水至于皮肤界面平齐,装置加水前后称重,重量相差值即为接收介质的真实体积。然后,供给池中加入饱和水杨酸溶液2.2ml,适当添加水杨酸晶体若干以维持试验过程中供给液的包和浓度,池口用Parafilm密封。
6. 装置平衡10分钟后开始记录时间,分别于1、2、3、4和5h自接受池内取样1ml,并立即补入同温蒸馏水1ml。另分别于0h和5h从供给池中取样200ul。精密吸取接受池样品0.8ml,用蒸馏水稀释至5ml,用紫外分光光度计于303nm处测定溶液的吸收度;供给池样品用蒸馏水稀释至50ml,同样测定浓度,取两个时间点供给池浓度的平均值作为Cd。
7. 进行去角质层皮夫的经皮透皮实验时,加液后应立即计时,接受池的取样时间点为0.5、1、1.5、2、3h取样2ml,并立即补入同温蒸馏水2ml。精取接受液1ml用蒸馏水稀释至8ml,紫外测定。供给池于0h和3h取样200ul,样品用蒸馏水稀释至50ml,同法测定。
4.数据处理
用标准曲线计算水杨酸的浓度,并用下式校正取样损失:
Cn校=Cn实+V/VrΣcCn-1实
其中Cn实:各取样点实测浓度;Cn校:各取样点累积透皮浓度;V:每次取样体积;Vr:接受液体积。
计算单位扩散面积的累积透皮量Q=Cn校 X Vr/A(Vr-接受液体积,A-扩散面积)
以扩散达稳态时的累积透皮量(Q)对时间(t)作图并回归得方程:Q=Kt+B,其中k为斜率,B为截距。
根据下列公式分别求算药物的透皮参数:J(流通量,flux,ug/cm2h)、P(透皮系数,permeation,coefficient,cm/h)、tlag(时滞,lag time,h)、D(扩散系数,cm2/h)
J=K, P=J/Cd, tlag=|-B/K|, D=h2/6tlag
其中Cd:供给池中药物浓度(ug/ml); h: 皮肤厚度(mm)
标准曲线方程:C(ug/ml)=48.41A+0.0025(r=0.9999)
浓度(ug/ml) 41.12 20.56 10.28 4.112 1.028
吸光度A 0.8519 0.4182 0.2141 0.0866 0.0216
5.实验数据记录及处理(见附页)
6.讨论(见附页)
附页
实验数据记录及处理
部位:腹部皮肤 ; 肤厚度:0.32mm ; V:1ml ; Vr:17.6ml
接受池直径r(cm)
扩散面积(cm2)
1
2
3
平均值
2.020
1.992
1.994
2.002
2.002
供给池浓度Cd(μg/ml)
第1次取样浓度
最后取样浓度
5.6107985
0.24455
10.977047
取样时间t
(h)
吸光度
A
实测浓度Cn
(μg/ml)
校正浓度Cn校(μg/ml)
累计透皮量
(μg/cm2)
1
0.036
1.74526
1.751826148
15.40066943
2
0.045
2.18095
2.187534986
19.23107680
3
0.921
44.58811
44.5972463
392.0637038
4
0.89
43.0874
43.09641273
378.8695625
5
0.9262
44.839842
44.84899936
394.2769175
回归方程:y=111.74x-95.249
P
19.91694589
J
111.74
td
0.852416324
D
0.020021516
实验讨论
此次实验所得数据线性关系较差,从实验结果可以看出实验过程有很多值得反思的地方:
1. 对皮肤的处理未达到理想状态,出现皱褶情况,并在第一次取样点时,发现皮肤破裂,直接导致实验失败。
分析:皮肤敷上扩散口时,可能绷得太紧而导致破裂;
处理:向其他组借得多余装置继续实验。
2. 在用注射器取样时,发现有溶液滞于橡皮管内,造成第一次取样产生误差。
处理:接下来的取样更换成移液枪取样。
3. 所测得数据线性关系比较差,R2较小,可信度不高,与其他组对比分析发现,本组实验数据明显偏高。
分析:取样结束后,经仔细检查,未发现皮肤有破损情况,查看每次取样体积,稀释倍数等实验记录,也未发现异常,其具体原因有待进一步分析讨论。
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