小鼠大脑新皮质片层化和细胞周期变化研究

小鼠大脑新皮质片层化和细胞周期变化研究 河南大学 硕士学位 小鼠大脑新皮质片层化和细胞周期变化的研究 姓名:臧建峰 申请学位级别:硕士 专业:神经生物学 指导教师:邓锦波 2011-05 摘要 大脑皮质(cerebral cortex)位于大脑层，由灰质构成，是神经元胞体集中的地方。 按皮质板发育分化程度不同，可将大脑皮质分为异型皮质(allocortex)和同型皮质 (isocortex)或称为新皮质(neocortex)。爬行类大脑皮质主要是由异型皮质构成，结构 相对简单，而哺乳类大脑皮质中 90%为新皮质。新皮质神经元主要包括两个类型:兴奋 性锥体神经元(80%新皮质神经元)和抑制性中间神经元。大脑皮质的发育与神经细胞 的迁移、增殖、分化密切相关。细胞周期在调控脑的大小、组织的发生、神经分化和干 细胞的维持等方面具有重要的作用。对于大脑，人们以往多集中于对其形态、细胞构筑、 纤维联系及神经递质等方面的研究，而对于大脑新皮质片层化的形成过程中神经细胞增 殖特点、细胞周期与细胞迁移的关系及其特异性蛋白表达的研究较少。所以此问题的阐 清将进一步加深我们对大脑发育规律的认识，也能为某些神经系统退化性疾病提供必要 的帮助。 目的:探讨小鼠大脑新皮质片层化的组织发生过程和锥体细胞的发育;大脑新皮质 片层化过程中神经细胞增殖的规律;大脑新皮质片层化中细胞周期和神经细胞迁移的关 系以及特异细胞周期蛋白的表达特点。 方法:本课题应用免疫荧光、BrdU 和 DiI 标记等技术对胚胎和出生后小鼠大脑新 皮质进行形态学观察，对皮质 BrdU 和 CyclinD1 阳性细胞密度进行测量。 结果:? 小鼠大脑新皮质皮质板形成于 E15，深层(第 VI-V 层)片层化进程开始 于 P0，浅层(第 IV-II 层)的片层化趋势开始于 P5，P7 时六层结构完全形成，但未呈 现片层化特点，P14 时小鼠大脑新皮质片层化的特点完全形成，P30 时片层化结构趋于 稳定。在大脑新皮质片层化过程中，幼稚的锥体细胞在 E17 时呈椭圆形，树突有小分支， 在 P15 时发育成熟，形状呈锥形并有复杂的顶树突和基树突。? BrdU 可以特异性标记 处于 S 期的增殖细胞，P0 至 P30，小鼠大脑新皮质片层化过程中,BrdU 阳性细胞在皮质 的表达逐渐减少。P0 时 BrdU 阳性细胞密度最高，随后逐渐减少，细胞密度呈 CUB 型 曲线变化，其发育过程中增殖神经细胞的差异有统计学意义，P,0.05。? CyclinD1 和 CDK4 是细胞周期 G1-S 期的特异性蛋白，P0 至 P30，CyclinD1 阳性细胞密度呈 CUB 型曲线先增加后降低，P12 较大，P0 和 P30 较少，其发育过程中 CyclinD1 阳性细胞密 I 度的差异有统计学意义，P,0.01。CDK4 在小鼠大脑新皮质持续表达，P60 后逐渐减少。 结论:小鼠大脑新皮质片层化过程主要经历了细胞增殖、分化与迁移。P0 至 P30 是小鼠大脑新皮质片层化形成的主要阶段，P7 时大脑新皮质六层结构已经形成，P30 时 片层化结构成熟，整个过程遵循由内向外的原则，锥体细胞随片层化的形成而逐渐发育 成熟。P0 至 P7 是神经细胞增殖活跃期，大脑新皮质片层化过程中神经细胞的增殖能力 随年龄增长逐渐减弱，这些增殖细胞是处于 S 期的祖细胞和神经胶质细胞。P7 至 P14 是皮质神经细胞迁移活跃期，迁移的细胞主要是处于 G1-S 期的增殖细胞，其迁移在 P12 时达到高峰。 关键词:新皮质片层化，神经细胞增殖，细胞周期，神经细胞迁移 II ABSTRACT The brain's surface is cerebral cortex which is constituted by the gray matter where the nerve cells are concentrated. The cerebral cortex is divided into allocortex and isocortex,or as the neocortex. The structure of allocortex is simple.The cerebral cortex of reptiles is mainly constituted by allocortex, while 90% of mammalian cerebral cortex is neocortex. The neocortex contains two primary types of neurons, excitatory pyramidal neurons (80% of neocortical neurons) and inhibitory interneurons. The development of cerebral cortex is closely related to neuronal proliferation, migration and differentiation. Cell cycle has an important role in the regulation of brain size, the occurrence of tissue, neural stem cell differentiation and maintenance. At present people made penetrating research on its morphous, cell chemical construction, fiber contact, neurotransmitter and the mechanism of different neuroapoptosis. But the data about characteristics of cell proliferation and relationship of cell cycle and cell migration and its specific protein expression during the development in cerebral cortex is relatively less. With the problem is clarified, it will deepen the understanding of law during the nervous system development, and it will offer necessary help for some catagenetic nervous system disease. Objective: To investigate the formation of lamination and development of pyramidal cells, the rules of cortical neurons proliferation and the relationship between cell cycle and migration with the characteristics of specific protein expression during the development of mouse cerebral cortex. Methods: The immunofluorescent stainings, DiI tracing and 5-bromodeoxyuridine (BrdU) assay were used to observe the changes in embryonic and postnatal mice cerebral cortex, and density of BrdU and CyclinD1 positive cells on cerebral cortex were measured. Results: ? After postnatal day 0 (P0), the lamination of deep cortical layers (VI-V) start, the trend of lamination of superficial cortical layers (IV-II) began after P5, the six layers were fully formed at P7. Developed to P14, the feature of lamination in cerebral cortex was fully formed, then stabilized at P30. In the process of lamination, pyramidal cells were oval-shaped and had small branches with their dendritics at E17. At P15, the pyramidal cells were mature and appeared with complex apical dendrites and base dendrites. ? BrdU is the specific marker of proliferating cells in S phase. From P0 to P30, the density of BrdU-positive cells decreased in cerebral cortex, proliferating cells density was the highest at P0. Cell III density decreased estimating CUB curve and the difference about proliferating cells has statistical significance during the development in mouse cerebral cortex, P,0.05. ? CyclinD1 and CDK4 is the specific protein in G1-S phase.The density of CyclinD1 positive cells was the highest at P12 and lower at P0 and P30. Cell density increased firstly then decreased estimating CUB curve. The difference about CyclinD1 positive cells has statistical significance during the development in mouse cerebral cortex, P, 0.01. The expression of CDK4 positive cells were continued in mouse cerebral cortex from P0 to P30, and reduced gradually after P60. Conclusions: The laminating neocortex experiences are mainly cells proliferation、differentiation and migration. It was an important period for the lamination in cerebral cortex from P0 to P30, the six layers of neocortex had been formed at P7, the structure of lamination was mature at P30. The development of lamination in neocortex followed “inside-out” pattern, meanwhile, the pyramidal cells were gradually mature. During the development of lamination, neural stem cell proliferation gradually decreased with age. These proliferating cells were progenitor cells and glial cells which are in S phase. Active period of cell proliferation was from P7 to P14, the active period of their migration was from P7 to P14. These migrating cells were mainly glial cells in G1 phase. The migration of cortical neurons reached a peak at P12. KEY WORDS:Neocortex lamination, Nerve cells proliferation, Cell cycle, Nerve cells migration IV I 引 言 引言 大脑又称端脑，是脊椎动物高级神经系统的主要部分，由左右两半球组成。大 脑半球表面有很多深浅不等的沟或裂，沟或裂之间的隆起叫回，它们大大增加了 大脑的表面积;大脑外侧面重要的沟、裂有大脑外侧裂、顶枕裂和中央沟。由于 三沟裂之界隔，使大脑皮质组分为额叶、顶叶、颞叶、枕叶四大部分。大脑皮质是 中枢神经系统进化的产物，从种系发生来说，大脑皮质可以分为异型皮质(allocortex) (古皮质(archicortex)与旧皮质(paleocortex))和同型皮质(isocortex)，又称新皮质 (neocortex)。异型皮质多见于爬行动物结构比较简单，而哺乳动物大脑皮质中 90%为 新皮质。 依据细胞的构筑特点，大脑新皮质具有典型的六层结构，自外向内依次分为分子层 ( molecular layer)、外颗粒层( external granular layer)、外锥体细胞层 (external pyramidal layer)、 内 颗 粒 层 ( internal granular layer)、 内 锥 体 细 胞 层 ( internal pyramidal layer)和多形细胞层( polymorphic layer)。大脑新皮质的神经元都是多极 神经元，按其细胞的形态分为锥体细胞、颗粒细胞和梭形细胞三大类，锥体细胞是大脑 皮质的主要投射(传出)神经元。大脑的神经发生涉及增殖和分化[1]，在细胞周期而言， 这意味着重新进入和退出细胞周期。神经母细胞重新进入细胞周期的次数在很大程度上 决定了大脑的大小。由于大脑功能复杂，发育周期长，较易受环境变化的影响，损伤 后症状表现明显，所以大脑成为研究发育、脑外伤及神经退行性疾病很好的模型。目前 对大脑的研究主要集中在对大脑新皮质的细胞构筑、纤维联系、神经递质和细胞迁移等 方面的研究，而对于大脑新皮质片层化的形成过程以及此过程中神经细胞增殖、细胞周 期和细胞迁移关系的研究资料较少。因此本课题以胚胎 15 天(Embryo 15，E15)至生 后成年小鼠大脑皮质为研究材料，运用免疫荧光、DiI 标记和 BrdU 检测等技术，试图 就以下方面进一步探讨:? 大脑新皮质片层化的形成过程和锥体细胞的发育;? 神经 细胞增殖和大脑新皮质片层化的关系;? 细胞周期和神经细胞迁移在大脑新皮质片层 化中的关系。 通过上述研究，将使我们能够深入了解大脑新皮质发育的特点并为片层化和细胞周 期以及神经细胞增殖、迁移之间的关系提供深入的研究资料，加深对发育神经生物学领 1 小鼠大脑新皮质片层化和细胞周期变化的研究 域的研究，如神经系统的发生、发育、老化及神经细胞移植和再生等热点研究。同时也 为认识某些神经系统疾病提供帮助，如有利于细胞周期蛋白和转录因子在中枢神经系统 疾病中的治疗和应用。 2 1. 材料、仪器与方法 1.材料、仪器与方法 1.1实验动物 选取 C57BL/6J 成年健康小鼠，动物和饲料购自河南省动物实验中心，常年在 ,,70,、室温在 22,25 ?环境下饲养。定期消毒，房间面积 60 m?。按 相对湿度 60 自然昼夜节律采光，自由进食和饮水。小鼠饮用水选用实验室自制单蒸水，并定期更换 垫料、消毒。实验中将雌雄鼠于 18:00 时以 2:1 合笼，次日 8:00 前查栓，发现母鼠 阴道栓塞之日计为受孕 0 天(Embryonic，E0)定为妊娠的开始，仔鼠出生当日计为生 后当天(postnatal day 0，P0)。选取 E15、E17、P0、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P10、 P12、P14、P16、P18、P20、P25、P30、P90 仔鼠共 200 只，孕鼠用苯巴比妥钠(30 mg/kg) 腹腔注射麻醉后直接剖腹取出胎鼠，剪取整个胎头;P0-P90 仔鼠麻醉后，开胸暴露心 脏，剪开右心耳，自心尖部进针，用含 4,多聚甲醛的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)经心尖 缓慢灌流固定后，开颅取脑，4,多聚甲醛的磷酸盐缓冲液中浸泡固定 24 h。 1.2实验材料 实验中所用一抗及其工作浓度和来源 working host product number source antibody dilution 1:500 FOXP2 Rabbit ab16046 Abcam CDP(C-20) Goat sc-6327 Santa Cruz 1:300 Nkx2.9 Rabbit ab5742 Chemicon 1:200 Nestin Mouse sc-33677 Santa Cruz 1:200 CyclinD1(A-12) Mouse sc-8396 Santa Cruz 1:200 CDK4 Rabbit sc-260 Santa Cruz 1:500 北京中杉金桥 BrdU Mouse ZM-0013 1:100 3 小鼠大脑新皮质片层化和细胞周期变化的研究 实验中所用二抗及其工作浓度和来源 working antibody host product number source dilution Alexa 488 驴抗兔 IgG Rabbit A21206 Invitrogen 1:300 Alexa 488 驴抗鼠 IgG Goat A21202 Invitrogen 1:300 Alexa 588 驴抗羊 IgG Rabbit A11057 Invitrogen 1:600 Alexa568 驴抗兔 IgG Mouse A10042 Invitrogen 1:600 另抗体稀释液和山羊血清均购置福州迈新生物技术有限公司，载玻片和盖玻片购置 郑州玻璃仪器厂。 1.3试剂配方 (1)0.1mol/L PB(工作液) 4.370 g 磷酸二氢钠(NaH2 PO4?2H2O) 磷酸氢二钠(Na2 HPO4?12H2O) 25.787 g 双蒸水定容为 1000 ml，pH 计调整 PH 为 7.2。 (2)4,多聚甲醛(工作液) 多聚甲醛 40 g 0.1 mol/L PB 液 1000 ml 60?搅拌至完全溶解，过滤后 pH 计调整 pH 为 7，24?保存待用。 (3)1,异戊巴比妥钠(工作液) 异戊巴比妥钠 (粉剂) 0.25 g 生理盐水稀释为 100 ml。 (4) PH8.0 硼酸缓冲液(工作液) 甲液: 0.1 mol/L 硼酸(H3BO4 ) 0.618 g 硼酸溶于 100 ml 双蒸水中即得到; 乙液: 0.025 mol/L 硼砂(Na2B4O7?10H2O) 0.945 g 硼砂溶于 100 ml 双蒸水中即得到; 甲液 93.3 ml，乙液 40 ml 充分混合即得到 pH8.0 的硼酸缓冲液。 (5)2N 盐酸(HCL)(工作液) 浓盐酸 16.7 ml，双蒸水稀释体积为 100 ml。 4 1. 材料、仪器与方法 (6)一抗稀释液(工作液) TritonX-100 液 0.3 ml 叠氮化钠(NaN3) 0.1 g 胎牛血清(BSA) 1g 0.1 mol/L PB 液 稀释体积为 100 ml 轻轻摇匀后分装至 EP 管中，4?储存待用。 (7)二抗稀释液(工作液) TritonX-100 液 0.1 ml NaN3 0.1 g 0.1 mol/L PB 液 加至 100 ml 摇匀后分装至 EP 管中，4?储存待用。 (8)4%的琼脂糖(工作液) 琼脂糖 4g 双蒸水 稀释为 100 ml 加热煮沸至澄清。 (9)强酸洗液的配制 重铬酸钾 630 g 双蒸水 2000 ml 缓慢加浓硫酸 10 L，边加边搅拌以利于散热，可将预配洗液的容器放在另一个 加水或冰块的大容器中，以利散热。 1.4主要仪器 设备名称 厂家、型号 产地 激光扫描共聚焦 Olympus，FV10 Japan 显微成像系统 振荡切片机 LR59590 USA Olympus，BX61 Japan 荧光显微镜 Beckman 公司 USA 高速冷冻离心机 MP 200B 电子天平 上海 5 小鼠大脑新皮质片层化和细胞周期变化的研究 数显电热恒温水温箱 上海 HH WZ1 600S pHs-25 型 数显酸度仪 上海 TA-2R 型 上海 台式冷冻离心机 Hoefer 公司 PS 500XT 直流稳压电源 USA Germany Heraeus 公司 电热恒温水浴箱 FE20 型 上海 实验室 pH 计 WD 9405A 型 脱色摇床 北京 TG 16W 型 微量高速离心机 长沙 KQ 5200DE 型 数控微波清洗器 昆山 1.5切片的制备 本实验中我们采用振荡切片，将 E15、E17、P0-P90 的小鼠大脑经 4%的多聚甲醛浸 泡固定 24 h 后，PB 液换洗 3 次，每次约 8 h，再用 4%的琼脂糖包埋，振荡切片机制成 50-70 µm 的冠状切片。切片保存在 0.1 M PB 中备用。 1.6免疫组织化学荧光染色 1.6.1免疫组织化学荧光染色原理 免疫组织化学荧光染色是将荧光作为标记物的免疫组织化学技术，利用该技术可以 检测组织内的抗原或半抗原。其原理是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，再与相 应的抗原或抗体反应，从而形成带有荧光素的抗原抗体复合物，该复合物在荧光显微镜 的 FITC 和罗达明激发光下发出荧光显示出其结合部位。通过化学反应使标记抗体的显 色剂 (荧光素、酶、同位素、金属离子) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)， 对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或 免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。免疫组织化学技术按照标记物的种类可分 为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自显影法等。 1.6.2免疫组织化学荧光染色步骤 振荡切片经 0.1 mol/L 的 PB 漂洗后，在封闭液(10% 正常山羊血清，0.3% Triton X-100，1% BSA，PB 配制)中室温孵育 30 min，一抗孵育过夜(4?C)。然后用 0.1 mol/L 6 1. 材料、仪器与方法 的 PB 漂洗 3 次，每次 5 min。二抗室温避光孵育 3 h，0.1 mol/L 的 PB 漂洗后 65,的甘 油封片。随后在罗达明和 FITC 激发光下，用 Olympus 荧光显微镜(BX61，Japan)进 行观察，拍片。同时，挑选一些染色理想，结构典型的切片，在激光共聚焦显微镜(FV10， Japan)下进行观察，拍片。 1.7 DiI示踪技术 DiI( 1,1'-dioctadecy1-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)，即 1 ，1′- ，3 ，3′，3′-四甲基吲哚羰花青,高氯酸盐，属于羰花青类染料族，是一种 双十八烷-3 紫红色晶体。和以往传统的示踪方法相比，它具有独特的优势，DiI 标记神经元和神经 胶质细胞主要是利用 DiI 的亲脂性这一特性来达成的，DiI 可以沿着神经细胞脂质单位 膜扩散，从而达到标记的目的。通常 DiI 顺行和逆行标记神经纤维及神经元是将 DiI 晶 体植入中枢神经系统的某一部位，然后 DiI 沿着纤维进行扩散，从而达到示踪神经纤维 和神经元的目的，这种方法常用于示踪神经纤维传导通路[2]。DiI 示踪标记:在体视显 微镜下，将 4,多聚甲醛的磷酸盐缓冲液中固定 24 h 的脑组织沿正中矢状位切开后，挑 取约 0.05 mm 大小的 DiI 晶体若干枚植入胼胝体部位。然后将标记后的脑组织重新放入 4,多聚甲醛的磷酸盐缓冲液中室温避光孵育固定 2-3 w。振荡切片作 50 µm 厚的冠状切 片，一部分在 Olympus 荧光显微镜(BX61，Japan)，罗达明激发光下观察由胼胝体-视 皮质神经通路和被 DiI 标记到的锥体细胞。 1.8 BrdU标记增殖细胞技术 BrdU(5’- bromodeoxyuridine，5’ -溴脱氧尿嘧啶核苷)作为一种 DNA 前体嘧啶类 似物，其化学结构特点是通过竞争掺入 S 期细胞单链 DNA 核苷酸序列替代胸腺嘧啶， 当细胞处于 DNA 合成期即 S 期而同时有 BrdU 存在时就会有 BrdU 掺入新合成的 DNA 中，只要细胞不消亡，这种 BrdU 会永久在胞核的 DNA 中存留。BrdU 抗体不与胸腺嘧 啶发生交叉反应，经免疫组织化学染色可观察 BrdU 在细胞内的掺入情况，故 BrdU 标 记和检测的准确性高，而且方法简便、迅速、安全，是反映细胞增殖的理想指标，所以 为了研究片层化过程中大脑皮质神经细胞的增殖能力，我们选用 BrdU 来标记增殖细胞。 过程如下:将 1mg BrdU (Sigma 公司，B-5002) 粉末溶解在 1 ml 生理盐水中制成溶液， 闭光保存。然后按剂量 25 mg/kg 将 BrdU 溶液注射于 P0-P30 仔鼠的腹腔。为了强化这 7 小鼠大脑新皮质片层化和细胞周期变化的研究 一作用，于第二天的同一时间重复注射一次，第三天将该鼠处死，取其脑浸泡固定于 4% 的多聚甲醛中 24 h。随后脑组织常规灌流固定行免疫荧光双标实验。在此过程中为了暴 露染色体中 BrdU 的位点需要 DNA 解链，将切片在 2 N HCL 水溶液中 37?孵育 30 min， 用 pH8.0 的硼酸缓冲液漂洗 3 次，每次 10 min，然后在 0.1 mol/L PB 溶液内漂洗 5 次， 每次 10 min，10%的正常山羊血清封闭 30 分钟后，直接将一抗小鼠抗 BrdU 单克隆抗体 (1:100，北京中杉，ZM-0013)，羊多克隆 CDP(C-20)抗体(1:300，Santa Cruz 公司， sc-6327)加入含切片的 24 孔板中，放入 4?冰箱孵育过夜。第二天回收一抗，用 0.1 mol/L PB 液充分漂洗后加入相应的二抗 Alexa 488 驴抗鼠 IgG(1:300，Invitrogen 公司，A21202); Alexa588 驴抗羊 IgG(1:600，Invitrogen 公司，A11057)，室温下避光摇床孵育 3 h，0.1 mol/L PB 漂洗后 65%的甘油封片。在激光共聚焦显微镜下(Olympus，FV10，Japan) 观察 BrdU 与 CDP 双标细胞。 1.9 BrdU和 CyclinD1阳性细胞的计数和统计学处理 大脑新皮质片层化形成过程中 BrdU 和 CyclinD1 阳性细胞的表达具有规律性，故我 们将其作为量化标准进行细胞测量和统计学处理:用 BrdU 和 CyclinD1 免疫组织化学切 片，统计大脑新皮质单位面积内的 BrdU 和 CyclinD1 阳性细胞数，实验数据以均数?标 准差( x ?S)表示，然后应用 SPSS 统计学软件，对各年龄组大脑新皮质 BrdU 和 CyclinD1 阳性细胞密度进行曲线拟合及回归分析。 8 2. 实验结果 2.实验结果 2.1小鼠大脑新皮质片层化的形成过程和锥体细胞的发育 实验中我们将 FOXP2、CDP 作为小鼠大脑新皮质层次的标记物研究片层化形成的 过程。FOXP2 即叉头框基因，是与人类语言相关的基因，其能特异性在大脑新皮质第 VI 层即多形细胞层表达。CDP 又名 Cux-1，是一种果蝇同源剪切基因，同时也是一种标 记大脑新皮质上层神经元和其前体细胞的分子标记物，可以特异性标记大脑皮质上层 (II–IV 层)的锥体神经元。FOXP2 和 CDP 的双重免疫荧光标记结果显示:E15 时，FOXP2 阳性细胞开始在小鼠大脑皮质板(cortex plate，CP)深层和下皮质板表达，表达在胞核， 此时 FOXP2 相对在中间层(intermediate zone，IZ)即神经细胞迁移区表达缺失(图 1A)。 随着小鼠出生，P0 时 FOXP2 阳性细胞富集在下皮质板(图 1C)。为了观察新皮质发育 中神经细胞的迁移方式我们应用放射状胶质细胞标记物 Nestin 和皮质第 VI 层神经元标 记物 FOXP2 免疫荧光双标显示，FOXP2 阳性细胞似沿放射状胶质细胞向脑膜表面迁移 (图 1J)。随着年龄的增加，下皮质板逐渐演化为皮质第 VI 层，圆形或椭圆形的 FOXP2 阳性细胞摆列整齐表达在大脑皮质第 VI 层，此时第 V 层也有 FOXP2 阳性细胞被观察 到，但主要在大脑新皮质更内侧第 VI 层密度较密，FOXP2 阳性细胞开始由第 VI 层向 第 V 层迁移。 P5 时，FOXP2 阳性细胞强烈表达在新皮质 V-VI 层，第 V 层和第 VI 层 细胞密度均匀(图 1D-E)。P7 时，FOXP2 阳性细胞在第 V-VI 层的表达有片层化的趋 势，第 VI 层细胞密度较大，第 V 层细胞密度相对较少(图 1F)。小鼠发育到 P14，新 皮质六层片层化特点完全形成，皮质第 V-VI 层界限比较清晰，此时 FOXP2 阳性细胞 在第 V 层弱表达，而在第 VI 层强表达(图 1G)。E17 时，CDP 阳性细胞开始在大脑新 皮质出现，占据新皮质浅层位置，表达比较微弱，主要表现在染色较弱，细胞轮廓有些 模糊(图 1B)。P0 时可以看到 CDP 阳性细胞在室管区(ventricular zone，VZ)表达， 并向上积累表达在新皮质上层神经元中形成未来第 IV-II 层(图 1C)。P5 时，CDP 阳性 细胞的表达有片层的梯度变化，即由第 IV 层到第 II 层表达开始呈梯度下降(图 1D-1E)。 在此阶段，小鼠大脑新皮质第 II-IV 层的片层化开始形成。P7 时可以明显看到由大脑皮 质第 V-VI 层向上迁移的 FOXP2 阳性细胞通过第 IV-II 层 CDP 阳性细胞占据的位置定 9 小鼠大脑新皮质片层化和细胞周期变化的研究 CDP 共表达细胞(图 1F)，此时大脑新皮质六层结构 居下来，黄色细胞即为 FOXP2 和 完全形成。小鼠发育到 P14，大脑新皮质片层化的特点完全呈现，CDP 阳性细胞排列整 齐表达在大脑皮质第 IV-II 层，FOXP2 阳性细胞主要表达在第 VI 层，第 V 层也有散落 的 FOXP2 阳性细胞(图 1G)，小鼠大脑新皮质片层化的特征完全形成。在大脑随后的 发育中，P30 时片层化的特征趋于成熟。在 P30 和 P90 能发现第 V-VI 层的零落的 CDP 阳性细胞(图 1H-1I)。 为了观察锥体细胞的发育，我们将 DiI 植入 E17 和 P15 小鼠正中矢状位胼胝体 (corpus callosum，CC)发现，E17 时大脑新皮质初步有片层化的特点从内到外分为 VZ、 IZ、CP、MZ。被 DiI 标记的的胼胝体神经纤维和皮质板中的胼胝体皮质神经元能被观 测到，皮质中可以看到幼稚的锥体细胞，占据在 VZ 和 CP，形状为椭圆。胼胝体投射 神经元开始出现在皮质板的深层，即未来的大脑新皮质第 IV 和 V 层。胼胝体纤维占据 中间层的内层和脑室下区。这些胼胝体投射神经元有顶枝延伸到皮质表面(图 1K)。 E17 被 DiI 标记到的幼稚锥体细胞呈椭圆形，树突比较光滑少有分支(图 1L)，P15 时 被 DiI 标记到的成熟锥体细胞可以观测细胞形状为三角形，胞核变明显，有复杂的顶树 突和基树突，锥体细胞体积逐渐增大(图 1M)。这些说明新生的幼稚锥体细胞随着大脑 新皮质片层化的形成在向成熟锥体细胞转变，同时 P30 时转录因子 NKX2.9 蛋白在大脑 皮质的表达(图 1N)，说明此时锥体细胞的功能和分化也趋于成熟。 2.2小鼠大脑新皮质片层化中神经细胞的增殖 神经干细胞的增殖在 CNS 发育过程中起着至关重要的作用，神经祖细胞首先在脑 室区(VZ)增殖，形成假复层上皮细胞。有丝分裂后，它们中的一些迁移越过脑室区 (VZ)，在那里它们分化成神经元或神经胶质细胞形成新皮质[3-6]。放射状胶质细胞在中 枢神经系统的发育过程中起着非常重要的作用，被认为是神经干细胞。BrdU (5’- bromodeoxyuridine，5’ -溴脱氧尿嘧啶核苷)是标记脑神经干细胞增殖和分化能力的一个 可靠标记物，目前已被广泛用于研究活体脑神经干细胞生物学行为动态变化等方面。我 们采用 BrdU 和 FOXP2 免疫荧光标记发现，P0 时 BrdU 阳性细胞主要密集在神经干细 胞的增殖区-室管膜下区(SVZ)，向上迁移越过中间层(IZ)和由 FOXP2 阳性细胞组 成的皮质板(CP)即未来新皮质的第 II-VI 层，广泛分布于大脑皮质(图 3A)，此时 BrdU 阳性细胞表达较多。这些增殖细胞是处于细胞周期 S 期的祖细胞和神经胶质细胞。 10 2. 实验结果 随着新皮质第 V-VI 层片层化的逐渐形成，P7 到 P14 过程中，室管膜下区(SVZ)的 BrdU 阳性细胞表达逐渐减少，同时分布在大脑新皮质的 BrdU 阳性细胞表达也逐渐变 少。我们同时对大脑新皮质单位面积的 BrdU 阳性细胞数进行了统计(表 1)，并对所得 )并绘制曲线拟合图(图 4A)，BrdU 阳性细 数据进行了曲线拟合，得出拟合方程(表 2 胞在大脑新皮质的密度由高到低呈 CUB 型拟合曲线(图 4A)，统计结果，P<0.05，大 脑发育过程中的皮质 BrdU 阳性细胞即增殖细胞的差异有统计学意义。 2.3小鼠大脑新皮质片层化中细胞周期和细胞迁移 在细胞周期进程中，CyclinD1 的含量受到生长因子等因素的调控，呈周期性变化。 CyclinD1 是 G1 期细胞周期素，与 CDK4 或 CDK6 在 G1 期结合形成复合物，再通过 N 末端的 LECXE 基序与视网膜母细胞瘤(Rb)编码蛋白 pRb 结合，使 pRb 的 Ser 和 Tyr 残基磷酸化，释放出转录因子 E2F，驱动细胞由 G1 期进入 S 期，促进细胞增殖[7-9]。本 实验中研究者利用 CyclinD1 和 CDP 免疫荧光双标和 CDK4 蛋白观察皮质中 CyclinD1 和 CDK4 表达的变化，实验结果如下: P0 时 CyclinD1 阳性细胞广泛分布于整个大脑 新皮质，胞核较小(图 3A)，此时 CyclinD1 阳性细胞表达较少。P7 时 CyclinD1 阳性细 胞染色较强，胞核较大(图 3B)。随着小鼠发育到 P14，CyclinD1 阳性细胞表达较多， 随后 CyclinD1 阳性细胞表达逐渐减少，P30 时 CyclinD1 阳性细胞排列逐渐松散，胞核 较小(图 3D)。同时我们对大脑新皮质单位面积的 CyclinD1 阳性细胞进行了统计，并 对所得数据进行了曲线拟合，得出拟合方程(表 2)并绘制曲线拟合图(图 4)，P0 至 P30 大脑新皮质片层化过程中，CyclinD1 阳性细胞的密度呈 CUB 型曲线先增加后降低 (图 4B)，P12 时，CyclinD1 阳性细胞密度达到峰值，这些细胞是处于 G1 期迁移的增 殖细胞。统计结果 P<0.01，CyclinD1 阳性细胞密度的差异有统计学意义，提示皮质神 经细胞在片层化过程中迁移的活跃期在 P7 至 P14。CDK4 阳性细胞主要表达在细胞核， 染色较强，细胞排列紧密，由 P0 发育到 P7，其在小鼠皮质神经元中均有丰富的表达(图 3E)，但到 P30 以后，CDK4 的表达有减少的趋势，P60 时表达稀少，表现为细胞染色 变淡，密度变得稀疏(图 3F)。 11 小鼠大脑新皮质片层化和细胞周期变化的研究 表 1 大脑新皮质中 BrdU和 CyclinD1阳性细胞密度结果( ?S) Tab 1 Result of the positive cells density of Brdu and CyclinD1 in the layer of neocortex( ?S) 日龄 BrdU 阳性细胞密度 CycilnD1 阳性细胞密度 2 (day) 2(D2) cells/mmcells/mm( D1) P0 201.4?49.9 808.8?318.1 P2 272.0?39.9 P3 326.0?63.6 686.3?169.3 P4 405.4?84.4 P5 470.5?120.0 P6 519.8?79.7 P7 601.5?82.5 309.5?80.8 P10 629.4?113.7 P12 669.2?100.3 P14 607.8?98.7 181.0?24.0 P16 512.6?100.7 P18 386.7?80.8 P20 291.7?84.3 163.3?37.8 P25 223.2?72.9 P30 154.0?53.9 146.3?41.7 表 2 SPSS软件统计结果及曲线拟合方程 Tab 2 Statistic result of SPSS and equation of Curve Estimation 曲线拟合方程 确认系数 F 值 P 值 Equation of Curve Estimation R2 F P Y=849.842-96.489X+4.3429X2 -0.0635X3 21.47 ,0.05 D1 0.970 2 3 D2 0.916 40.09 ,0.01 Y=113.501+111.758X-7.5136X +0.1275X D1 D2 900 700 800 600 700 500 600 500 400 400 300 300 200 Ob s e rve d Ob s e rve d 200 100 Cub ic 100 Cub ic - 10 0 10 20 30 40 - 10 0 10 20 30 40 P P 4A 大脑新皮质 BrdU 阳性细胞密度呈 CUB 型曲线拟合 4B 大脑新皮质 CyclinD1 阳性细胞密度 呈 CUB 型曲拟合 图 4 大脑皮质 BrdU 和 CyclinD1 阳性细胞密度曲线拟合图 Fig.4 Graph of Curve Estimation of the positive BrdU and CycilnD1 cell density in neocortex. 4A: The positive BrdU cell density in cerebral cortex estimates CUB curve. 4B: The positive CyclinD1 cell density in cerebral cortex estimates CUB curve. 12 3.讨 论 3.讨论 3.1小鼠大脑新皮质片层化结构的形成和锥体细胞的发育 小鼠大脑新皮质的神经元发生部位是在胚胎早期端脑脑室层，它是一层假复层神经 上皮细胞，即神经祖细胞。大脑新皮质的形成是通过神经祖细胞的分裂、增殖和分化过 程实现的。神经祖细胞一再增殖，有些分化为成神经细胞，向外迁移位于脑室层和缘层， 分为浅、深两层。浅层即皮质板上层，它进一步发育为中间层。深层为皮质板下层在中 间层上面。成神经细胞沿放射状胶质细胞向外迁移到达皮质板下层的上方即皮质板 (cortical plate)。大脑新皮质的片层化结构是其最鲜明的特征之一，在片层内有特定的 神经元分布。在新皮质，具有典型的六层结构，自外向内依次用 I-VI 罗马数字表示。 第 I 层也叫分子层，这一层的特征是细胞相对稀疏，内面含有胞体扁平多突起的 Cajal-Retzius 细胞。第 II 层由大量的颗粒细胞和小锥体细胞密集排列而成;第 III 层含 有大量典型的锥体细胞;第 IV 层有密集的星状细胞;第 V 层由中型和大型锥体细胞、 颗粒细胞和马提诺蒂(Martinotti)细胞构成;第 VI 层含大量梭形细胞和少量星形细胞 [10] 。 本实验研究发现小鼠大脑新皮质片层化是在皮质板(CP)的基础上形成的，陆续迁 移而来的神经元将在不同的部位定居下来，进一步形成了皮质板内部的片层结构。E15 时小鼠大脑皮质板下层开始形成，此时大脑新皮质由软脑膜开始到室管层，依次可分为 边缘层(MZ() 未来新皮质第 I ( 层)、皮质板(CP) 未来新皮质第 II-VI 层)、中间层(IZ)、 室管下层(SVZ)和室管层(VZ)等结构。出生后小鼠大脑新皮质的片层化过程逐渐开 始，在 P0 至 P5 阶段，下皮质板逐渐演化为新皮质深层第 IV 层和第 V 层，边缘层(MZ) 演变成分子层。大脑皮质浅层第 IV-II 层的片层化在小鼠 P5 时开始有出现的趋势，P7 时六层结构都已出现，小鼠发育到 P14 整个大脑新皮质六层结构的片层化特点完全形 成，P30 时片层化结构完全成熟。这说明整个大脑新皮质的片层化过程中，皮质神经细 胞的发生遵循由内向外(inside-out)的原则进行，即:迁移的神经细胞穿过最先生成的 神经元占据的位置，由内及外按顺序形成新皮质的分层，位置深的层最先形成，位置靠 上的层最后形成。大脑新皮质片层化的结局和出生顺序之间的联系对所有的皮质神经细 13 小鼠大脑新皮质片层化和细胞周期变化的研究 胞都有关联，包括有投射成分神经元组成的放射状神经元和最初抑制局部环路神经元组 成的中间神经元[11-13]。随着大脑的发育，下皮质板以下形成由中间层衍变而来的髓质， 有大量过往的神经纤维。本实验中通过胼胝体通路的神经纤维寻径发现，随着大脑新皮 质片层化的结构成熟，锥体细胞的生长具有规律性，发育早期成神经细胞迁移到皮质板 时可分化为有一个传出轴突的幼稚锥体细胞，接着长出一个短的树突。随着大脑新皮质 的逐渐形成，锥体细胞树突分支稍多，胞体基部发出基树突，轴突发出短的侧支，随后 树突分支增加，基树突扩展。锥体细胞的发育成熟主要在出生后进行，FOXP2 比 CDP 的早表达说明深层锥体细胞比浅层的锥体细胞发育的较早。到了 P30，浅层神经细胞和 深层神经细胞发育成熟的程度是一致的。此时转录因子 Nkx2.9 的强表达表明此时锥体 细胞的蛋白表达和细胞分化程度也趋于成熟。锥体神经元在皮质发育过程中一般都可以 采用较直接的放射状路径到达它们的片层位置，但是中间神经元必须历经一个曲折很远 的距离。这也证实了神经元的分化、发育成熟大致上也是由内至外呈放射状连续出现， 即由 VI-V 层神经元开始发育成熟，然后到 IV-II 层神经元的成熟。锥体细胞的发育随 大脑新皮质片层化的形成在形态和功能方面逐渐成熟，和片层化的发育过程相一致。 一些研究认为，单一的皮质祖细胞在大脑新皮层的几个层次生成神经元，在祖细胞 中的定时功能环境线索说明细胞分裂前，促进了大脑皮质层次的命运[14]。此外，皮质祖 细胞可以初步产生任何层神经元。但为了发育的继续，祖细胞的潜力缩小[15]。如果皮质 面积和皮质层次在皮质层神经元生成时已被指定[16]，那么理解皮质神经发生的事件和机 制将至关重要。大脑皮质上下层细胞的产生依赖于不同的分子机制。小鼠遗传研究表明， 下层的发育，需要神经源基因 Ngn1 和 2[17]。Cux2 已被证明和产生上层细胞有关联[18]。 本试验中通过小鼠大脑新皮质片层化的实验结果证实转录因子果蝇同源剪切基因 CDP 参与了小鼠大脑皮质上层(第 II-IV 层)神经细胞的形成，言语相关基因 FOXP2 被证实 与小鼠大脑皮质下层(第 V-VI 层)神经细胞的形成有关联。同时在胚胎期小鼠大脑皮 质的中间层(神经细胞迁移区)FOXP2 阳性细胞很少被观察到，提示 FOXP2 基因有可 能涉及神经细胞的分化。基因编码的各种蛋白质，包括转录因子、细胞粘附和轴突导向 分子在皮质层模式中都有表达，其中的一些蛋白可能调节皮质层特异投射到大脑的其他 部位[19-20]，如本实验中提及的转录因子 CDP 和言语相关基因 FOXP2。 14 3.讨 论 3.2大脑新皮质片层化中神经细胞的增殖 胚胎和出生早期是神经系统快速增殖发育的阶段，在这时期神经干细胞存在于许多 部位包括大脑皮质、纹状体、海马、嗅球、小脑、脊髓等[21-23]，神经干细胞不仅存在于 发育中的哺乳动物神经系统，而且还存在于成年哺乳类动物神经系统中，一般认为，室 管膜下区(SVZ)，海马齿状回(DG)和嗅回是三个神经干细胞增殖区，其中，目前认 为成年大脑的侧脑室下区(SVZ)和海马齿状回(DG)是两个主要的神经干细胞聚集 区[24-26]。神经干细胞是多能干细胞的一种，具有干细胞的两个基本特性:自我更新能力 和多向分化潜能。主要能通过两种细胞分裂方式，即不对称分裂和对称分裂来维持干细 胞库的稳定。大脑新皮质的形成与神经上皮细胞增殖以及细胞迁移息息相关。神经祖细 胞首先在脑室区(VZ)增殖，形成假复层上皮细胞，有丝分裂后，它们中的一些迁移 越过脑室区(VZ)，在那里它们分化成神经元或神经胶质细胞形成新皮质。与其他部位 的神经祖细胞不同，室管膜下区(SVZ)的神经干细胞在迁移过程中保持神经元特征， 在成年后仍保持有分裂能力。由于室管膜下区(SVZ)存在大量的成神经细胞和成胶质 细胞，而且这些细胞具有分裂能力，故室管膜下区(SVZ)细胞可见大量的分裂相。 本试验中观察到小鼠 BrdU 阳性细胞主要密集在神经干细胞的增殖区之一室管膜下 区(SVZ)并向上迁移越过皮质板广泛分布在整个新皮质，在那里它们最后分化成成熟 神经元。P0 时增殖的神经细胞密度最高，这些增殖细胞主要是祖细胞和迁移前的处于 S 期的具有分裂功能的神经胶质细胞。随着小鼠大脑的发育成熟即新皮质片层化的形成， P0 至 P30 增殖细胞密度逐渐减少。神经干细胞增殖过程中可形成增殖细胞(proliferative cell)和有丝分裂后神经元(postmitotic neuron)，从脑室区(VZ)产生的神经祖细胞主 要是通过不对称分裂，但是从 SVZ 的细胞主要由终端进行对称细胞分裂[27]，可分化为 中枢神经系统内三种主要细胞即神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。室管膜下区 (SVZ)和皮质增殖的神经细胞逐渐减少，这也提示 P0-P7 是大脑新皮质神经细胞增殖 的活跃阶段。在室管膜下区(SVZ)的神经前体细胞被认为会引起生成上层神经元，而 较低位置的脑室区(VZ)生成第 V 和第 VI 层的神经元。转录因子基因 Svet1 和 Cux2 的表达支持了大脑皮质上层和下层细胞主要来源之间的这一区别[27-29]。细胞的增殖和分 化可以通过对细胞周期的调控来实现的[30]，很多与分化和增殖有关的细胞因子和调控蛋 白都是作用在细胞周期的 G1 相，而几乎调控 G1 相的所有周期蛋白都影响细胞的分化 [31-33] ，例如细胞周期调节蛋白 D 可以下调 bHLH 基因 NeuroD 的活性[34]，细胞周期调节 15 小鼠大脑新皮质片层化和细胞周期变化的研究 蛋白 D3 能够直接调节维甲酸受体 α 的转录活性来促进神经发生[35]。本实验中小鼠生后 P0 时大脑新皮质增殖神经细胞密度最高，随着大脑片层化的形成，其密度逐渐减少， 这提示小鼠大脑新皮质片层化发育过程中神经细胞的自我更新能力、增殖、分化能力等 都随着年龄的增长而逐渐减少。 3.3大脑新皮质片层化形成中细胞周期和细胞迁移 细胞周期是指连续的分裂细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束所经历 的整个过程。细胞周期的运行十分有序，沿着 G1 期-S 期-G2 期-M 期的顺序进行，这 种严格的顺序运转与相关调控基因在时间和空间上的有序表达是分不开的。细胞周期的 调控是通过 Cyclin、CDK、CDKl 三方面的相互作用来完成的，其核心机制是 CDK 活 性的调控。CDK 的活性由 Cyclin、CDKI 和其自身的磷酸化共同调控。Cyclin 与 CDK 结合后可以促使 CDK 磷酸化，而 CDKI 则阻止 Cyclin 与 CDK 的结合，并阻止 CDK 的 磷酸化。磷酸化后的 CDK 能够通过磷酸化其下游底物 Rb 使细胞进入细胞周期。大脑皮 质的组织发生是通过神经祖细胞的分裂、增生和分化过程完成的。神经祖细胞经历反复 周期性分裂，在适当的神经祖细胞数目以及组织发生时间，经放射状胶质细胞和传入神 经纤维的引导使神经祖细胞分化的成神经细胞或称神经母细胞迁移到合适的位置。 目前很多研究针对于细胞周期相关蛋白在发育过程中的表达，有研究认为发育过程 中细胞周期相关蛋白均有较丰富的表达，但随着年龄的增加，Cyclin 的表达下降，CDKI 的表达增加，提示年龄增加，增殖受阻[36-37]。相反，亦有很多研究表明在神经细胞发育 的不同阶段中细胞周期蛋白(Cyclin、CDKs、CDKI)的表达量无明显变化，而仅表现 为细胞内分布的改变 [38]。本研究显示小鼠由出生到大脑新皮质片层化形成过程中， CyclinD1 和 CDK4 在皮质神经细胞中持续表达，但是 CyclinD1 蛋白的表达呈 CUB 曲线 改变，P0 至 P7，CyclinD1 细胞密度由少到多，在 P12，CyclinD1 细胞密度达到高峰， 随后逐渐减少，P30 时更为稀少。这些实验结果提示皮质神经细胞迁移的高峰期发生在 P7-P14，而这些 CyclinD1 细胞可能是处于 G1-S 期迁移来的增殖细胞，提示小鼠水平皮 质发育可能致使 CyclinD1 的上调和神经前体细胞周期的缩短，从而导致过度增殖。 Cyclin D1 是调节 G1-S 期的细胞周期蛋白，是决定细胞周期能否开始的启动因子，其表 达在 G1 期末期达到高峰。CDK4 在各个年龄的小鼠皮质神经细胞中高度表达，P60 后 有减少趋势但是没有 CyclinD1 变化明显。这说明细胞周期蛋白依赖激酶的表达并不能 16 3.讨 论 准确反映神经细胞细胞周期的变化，而细胞周期蛋白的表达和细胞周期的改变密切相 关。细胞周期的进程是受正性和负性调控子所控制，最显著的特点是利用细胞周期蛋白 依赖性激酶(CDK)和细胞周期蛋白(Cyclin)复合物及其抑制。细胞周期蛋白在特定 的细胞周期阶段表达(和退化)，并各自在二聚化后激活 CDK，从而促进进入下一阶段 的细胞周期。CDK 抑制剂控制细胞周期的速度并调控进入静止期。本实验中，CyclinDl 和 CDK4 在 P30 后的表达含量不断下降，提示 CyclinDl-CDK4 的结合能力随大脑新皮 质的发育成熟不断地下降，进而抑制了 Rb 蛋白的磷酸化反应，使其不能释放转录因子 (E2F)，使细胞不能从 G1 期进入 S 期，从而将细胞周期阻抑在 G1 期。CDK4 的表达 在 P60 后才明显的减弱也可能是由于细胞在衰老晚期功能减弱，使细胞的清除能力下降 更明显，代谢废物的不断累积，引发细胞内环境的紊乱，导致细胞合成功能下降，从而 影响蛋白的表达。神经系统发育的主要要求是细胞周期的协调和细胞命运的测定。最近 很多观测突出显示分子控制这两个过程的相互干扰功能，调节细胞周期进程的关键因素 影响神经细胞的命运，决定和分化因素在调节细胞周期中起到作用[39-41]。虽然一些分子 间相互作用和路径已被澄清，但仍有一些重要的问题仍未获答案。 总之，本实验说明了 P0-P30 是小鼠大脑新皮质片层化形成的重要时期，E15 时， 大脑皮质板已经形成，P7 时新皮质六层结构完全形成，P30 时新皮质六层片层化特点完 全成熟，整个片层化过程遵循由内到外的原则，锥体细胞随片层化的形成其形态和功能 以及分化逐渐成熟。大脑新皮质片层化的形成和神经细胞的迁移、增殖、分化密切相关， P0-P7 是大脑皮质神经细胞增殖的主要阶段，增殖细胞是处于 S 期的祖细胞和神经胶质 细胞。P7-P14 是大脑皮质神经细胞迁移的主要时期，P12 时迁移达到高峰，迁移的细胞 主要是处于 G1-S 期的具有分裂相的增殖细胞。同时提示我们利用转录因子和细胞周期 蛋白可能会对一些神经系统退行性疾病的治疗有重要的指导意义。 17 结 论 结论 1. 小鼠大脑新皮质发育过程中片层化是其主要特点，P0-P30 是片层化形成的重要时期， E15 时大脑皮质板已经形成，P7 时新皮质六层结构完全形成，P30 时新皮质六层片层化 特点完全成熟，整个过程遵循由内到外的原则，锥体细胞随片层化的形成其形态和功能 以及分化逐渐发育成熟。 2. 小鼠大脑新皮质片层化的形成和神经细胞的增殖，迁移，分化密切相关，P0-P7 是 大脑皮质神经细胞增殖的主要阶段，增殖细胞是处于 S 期的祖细胞和神经胶质细胞。 P7-P14 是大脑皮质神经细胞迁移的主要时期，P12 时迁移达到高峰，迁移的细胞主要是 处于 G1-S 期的具有分裂相的增殖细胞。 19 参考文献 参考文献 [1] Ohnuma S, Harris WA. 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Annu Rev Neurosci, 2000, 23:531-556. 23 附 图 附图 图 1小鼠大脑新皮质片层化的形成和锥体细胞的发育。(免疫荧光染色和 DiI标记) 图 2小鼠大脑新皮质片层化发育中神经细胞的增殖。(免疫荧光染色) 25 小鼠大脑新皮质片层化和细胞周期变化的研究 图 3:小鼠大脑新皮质片层化过程中 CyclinD1(3A-3D)和 CDK4(3E-3F)在新皮质的表达。(免疫 荧光染色) 26 图片说明 图片说明 :小鼠大脑新皮质片层化结构的形成和锥体细胞的发育，免疫荧光染色和 DiI 图 1 标记。 FOXP2(绿)和 CDP(红)免疫荧光双标记显示如下。A: E15 时，FOXP2(绿) 在小鼠大脑皮质板(CP)表达，此时大脑新皮质上层神经元还没出现。B: E17 时，CDP (红)开始在小鼠大脑新皮质上层表达，染色较弱。C-D: P0-P2，FOXP2(绿)主要 表达在下皮质板(SP)其随后演化为皮质第 VI 层，而 CDP(红)表达在上层皮质第 II-IV 层。E-F:P5-P7 时 FOXP2 细胞(绿)在大脑皮质第 V-VI 层表达强烈，CDP(红)在 大脑皮质第 IV-II 层的表达呈梯度递减的趋势，上层神经元的片层化过程开始。P7 时可 以观测到 FOXP2 和 CDP 共表达细胞(黄)，这是由大脑新皮质第 VI-V 层向上迁移的 FOXP2(绿)通过第 IV-II 层 CDP(红)占据的位置定居下来。G:发育到 P14 时，FOXP2 (绿)主要表达在新皮质第 VI 层，在第 V 层也有散落的 FOXP2(绿);CDP(红)排 列在新皮质第 II-IV 层。H-I:P30-P90，小鼠大脑新皮质片层化的特点趋于稳定和成熟， I-VI 层结构非常清楚。J:P0 时 Nestin(红)FOXP2(绿)的免疫双标显示，FOXP2 细 胞沿放射状胶质细胞向上迁移。K:E17 时通过胼胝体通路的胼胝体投射神经元(红) VZ 和 CP 被观测到。L:E17 被 DiI 标记的幼稚锥体细胞(红)，其细胞轮廓较圆， 在 树突少有分支。M:P15 时被 DiI 标记的成熟锥体细胞(红)可以看到细胞轮廓为锥形， 有明显的胞核和清晰的顶树突和基树突。N:P30 时可以观测到大脑新皮质广泛分布的 NKX2.9 细胞(绿)，表达在胞浆。标尺:1A-1C=50 µm，1D-1I=100 µm，1J=50 µm， 1K=80 µm，1L-1M=30 µm，1N=80 µm。 Fig.1 The formation of lamination and development of pyramidal cells in mouse neocortex, immunofluoresence (IMF) and DiI tracing. With FOXP2 (green) and CDP immunofluoresence double-labeling, A: FOXP2 (green) were expressed in cortex plate (CP) at E15, the upper cortical neurons were not appear. B: CDP (red) began to appear in the upper cortical neurons at E17. C-D: From P0 to P2,FOXP2(green) were mainly expressed in Subcortical plate (SP) which evolved into cortical layer VI ,while the CDP (red) were expressed in the upper cortex layer, the future layer II-IV. E-F: FOXP2 (green) were strongly expressed in layers V-VI from P5 to P7, CDP 27 小鼠大脑新皮质片层化和细胞周期变化的研究 (red) followed a layer IV to layer II decreasing gradient of expression after P5. The coexpression of FOXP2 and CDP showed that FOXP2 migrated from layer VI-V upward through the layer IV-II then occupied the position of CDP and settled at P7. G: Developed to P14, characteristics of lamination in cerebral cortex were showed completely. FOXP2 (green) were mainly expressed in layer VI and they were also scattered in layer V. CDP (red) were intensely expressed in layer II-IV. H-I: From P30 to P90, the characteristic of lamination was table and mature, therefore the structure of layer I-VI was very clear. J: Nestin (red) radial s glial cell and FOXP2 (green) in cerebral cortex at P0, their location suggested that FOXP2 cells seem to move up along radial glial cells. K: A crystal of DiI was placed into the midsagittal CC at E17. The CC projection neurons (red) located in the lower CP and VZ. L: Immature pyramidal neurons (red) which were labeled DiI appeared with oval-shaped and rarely-branching dendrites at E17. M: Mature pyramidal neurons (red) appeared with clear nucleus and apical dendrites and base dendrites at P15. N: NKX2.9 (green) were widely distributed in cerebral cortex, expressed in cytoplasm. Bar: A-I=100µm, J=50 µm, 1K=80 µm, 1L-1M=30 µm, 1N=80 µm. 图 2 小鼠大脑新皮质片层化发育中神经细胞的增殖。 2A: P0 时，BrdU 阳性细胞(绿)主要密集在神经干细胞的增殖区-室管膜下区 (SVZ)，向上迁移过中间层(IZ)和由 FOXP2 阳性细胞(红)组成的皮质板广泛分布 于大脑新皮质。2B-2C: P7-P30，随着大脑新皮质片层化的形成，SVZ 的 BrdU 阳性细 胞逐渐减少，分布在 FOXP2 阳性细胞组成的第 VI 层的 BrdU 阳性细胞也逐渐减少，表 现为染色较弱，胞核较小。标尺:2A-2C=50 µm。 Fig2. Neurons proliferation with the development of lamination in neocortex. 2A: BrdU (green) were mainly concentrated in subventricular zone (SVZ), migrated upward through the intermediate zone (IZ) and cortical plate (CP) which were composed of FOXP2 (red). Then BrdU (green) were distributed widely in cerebral cortex at P0. 3B-3D: With the formation of lamination, BrdU (green) gradually decreased in SVZ and cerebral cortex from P7 to P30, appeared with weakly stained and smaller nuclei. Bar: 2A-2C=50 µm. 图 3:小鼠大脑新皮质片层化过程中 CyclinD1(3A-3D)和 CDK4(3E-3F)在新 皮质的表达。 3A:P0 时，CyclinD1 阳性细胞(红)由 VZ 区向上迁移越过 IZ、CP 和 CDP 阳性 28 图片说明 细胞(绿)组成的皮质第 II-IV 层广泛分布于新皮质，此时 CyclinD1 阳性细胞胞核较小。 3B-3C:P7-P14 随着大脑新皮质第 II-IV 层的片层化的形成，CyclinD1 阳性细胞的表达 逐渐增强。3D:P30 时，CyclinD1 阳性细胞在新皮质的表达减少，染色较弱，胞核较小。 2E-2F:P7 时 CDK4 阳性细胞(绿)在大脑新皮质的表达较高，表达在胞核，染色较 强。P60 表达较少，表现为细胞密度稀疏，染色较弱。标尺:3A-3D=50 µm，3E-3F=100 µm。 Fig3. The expression of CyclinD1 and CDK4 with the development of lamination in neocortex. 3A: CyclinD1 (red) migrated from VZ up through IZ, CP and the future layer II-IV which composed of CDP (green), then widely distributed in cerebral cortex. 3B-3C: CyclinD1 (red) gradually increased with the development of lamination in cerebral cortex from P7 to P14. 3D: The density of CyclinD1 (red) was lower and appeared with weakly stained and smaller nuclei. 3E-3F: CDK4 (green) were intensely expressed in nucleus at P7.However, CDK4 (green) were sparse and appeared with weakly stained at P60. Bar: 3A-3D=50 µm, 3E-3F=100 µm. 29 综 述 综述 大脑皮质发育和细胞周期 大脑奇妙的发育特点是，虽然神经元由大脑深处脑室壁的神经祖细胞发生，新生神 经元还是往往能够从它们的出生地长途跋涉迁移到达最终目的地。这一特点在皮质发育 过程中尤其明显，新生神经元必须迁移到皮质外表面。大脑皮质的神经发生涉及增殖和 分化，就细胞周期而言，这意味着重新进入和退出细胞周期。人类大脑发育中有很多与 不正常增殖有关的疾病[1]，例如，Dyrk1A 可能是唐氏综合症的一个致病因子[2]，Six3 突 变的结果导致前脑无裂畸形[3-4]，Emx2 和 TSC2 在皮质的缺陷导致脑裂畸形和协调发育 不良(增厚和组织的无序)[5-6]。此外，几乎所有和神经发育有关的信号通路与肿瘤的 发生也有牵连。其次是细胞周期的退出和神经细胞命运决定因子之间的分子协调，决定 因子影响细胞周期，细胞周期因子影响神经细胞命运决定因子。在这里我们主要介绍大 脑皮质发育和神经元的迁移以及细胞周期如何调节神经元的迁移和大脑皮质发育中细 胞周期的特点。 1大脑皮质发育和神经元迁移 1.1神经元迁移模式 大脑皮质发育过程中神经元迁移模式主要有两种:放射状迁移和切线位迁移。迁移 和转移过程对于大脑皮质正确的发育很重要，在大脑皮质早期发育中神经元迁移主要遵 循放射状迁移，在晚期皮质板形成后迁移主要是切线位迁移。哺乳动物神经系统发育中 的神经干细胞来自脑室区一种上皮细胞，其具有极化的特点，它的尖端区域界限在神经 管的内腔。随着发育的继续进行，一定比例增加的神经干细胞(如神经上皮细胞和放射 状神经胶质细胞)，开始从分化产生转换(扩大)，从而生成另外的干细胞去分化产生受 约束的前体细胞或有丝分裂后神经细胞[7-8]。特别是在大脑皮层的转分化导致神经元和 基底(或中间神经元)前体细胞的发生，使其离开脑室区在软脑膜边界形成第二个生发 区-脑室下区，它被认为在演化过程中对于皮质表面积的增加很重要[9]。在胎儿的大脑， 31 小鼠大脑新皮质片层化和细胞周期变化的研究 具有有限的自我更新和多能性基本特点的神经祖细胞增殖和分化为神经元，它们后来成 为神经胶质细胞(星形胶质细胞和少突胶质细胞)。神经祖细胞首先在脑室区(VZ)增 殖，形成假复层上皮细胞，发育晚期被称为放射状神经胶质细胞。神经系统的发育起源 有研究表明中枢神经系统(central nervous 于神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)， system，CNS)内所有的神经细胞和胶质细胞都来源于胚胎神经管壁的神经上皮细胞[10]， 但最近 Sottile[11-13]等发现神经干细胞就相当于放射状胶质细胞，该细胞表达星形胶质细 胞特异的标志物谷氨酸转运体(GLAST)、脑脂质结合蛋白(BLBP)和胶质纤维酸性蛋 白(GFAP)等，多年来被认为是胶质细胞的特殊表现形式，并且引导新生神经细胞的 放射状迁移。神经干细胞的增殖和迁移在 CNS 发育过程中起着至关重要的作用，并且 放射状胶质细胞可能与 CNS 形态的形成密切相关。有丝分裂后，它们中的一些迁移越 过脑室区(VZ)，在那里它们分化成神经元或神经胶质细胞形成皮质。某些关键基因， 如 Reelin ，CDK5，Dcx，Lis1 和 Nudel 都参与了此次迁移[14]。Reelin 是细胞外大分子 蛋白，丰富表达在 Cajal-Retzius 细胞上[15]，有研究证明 Reelin 信号是通过迁移神经细 胞表面低密度脂蛋白受体(VldlR)和载脂蛋白 E2 受体(ApoER2)两个受体发挥作用， 若两者发生突变则会导致皮质分层缺陷[16]。此外， Notch 信号也参与 Reelin 调控神经 细胞放射状迁移的过程，比如，在迁移的神经细胞上同时去除 Notch 1 和 Notch2，则引 起该类细胞的迁移缓慢，其表型似 reeler 皮质结构[17]。因此，Reelin 信号对于皮质神经 细胞的准确迁移及层状结构的形成是必要的。在大脑的发育中，跨膜受体 Notch 的活化 促进 bHLH 转录性抑制因子 Hes1 和 Hes5 的表达，从而下调 Notch 配体和颈板基因，如 Ngn2。这是在活化的细胞中维护神经胶质身份和激活细胞增殖的双重效应，从而提高临 近细胞的分化，一种在姊妹细胞中经历不对称细胞命运的变化，这一机制被称为侧抑制， 从而影响细胞周期调控子如细胞周期蛋白和 CDK 抑制剂的表达。Notch 延长细胞周期 的网络效应还不太清楚，细胞周期正性和负性调控子都是由 Hes 所抑制。Hes 把 Ngn2 定为目标不仅了神经元的身份，而且似乎在中期向晚期皮质发生过程中调节放射状 神经胶质细胞向基底前体细胞的发展。Ngn1 和 Ngn2 的缺乏，在脑室区的分裂中基底祖 细胞的数量增加，导致脑室区前体细胞在胚胎期被耗尽。这看来 Ngn2 不仅允许前体细 胞成熟，而且其行为作为一个延缓可以避免神经前体细胞的过早枯竭。 最近的研究还发现，神经营养因子也在皮质神经细胞迁移中起着重要作用，包括脑 源性神经营养因子(BDNF) 、神经生长因子(NGF)等。也有文献报道血小板源性生 32 综 述 长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)及谷氨酸等可能引导少突胶质细胞前体细胞 的迁移[18-19] 。最近对于皮质神经元的起源位置和迁移模式的探讨和研究已经证实皮质 锥体神经元产生于背侧端脑的生发区，大多数但不是所有的皮质中间神经元产生于端脑 的腹侧区。后者的区域包括增生性的神经节隆起区域(MGE)。因此，锥体神经元在皮 质发育过程中一般都可以采用较直接的放射状路径到达它们的片层位置，但是中间神经 元必须历经一个曲折的、很远的距离。神经元在端脑背侧和腹侧的迁移路线现在已经是 比较热门的研究，最近的研究尽管没能完整的描述，但显示迁移模式很复杂，所有锥体 和中间神经元在运动方向和迁移速度都有空间和临时的变化特点。由于所有在神经节隆 起区域(MGE)产生的皮质中间神经元必须通过切线位迁移到皮质，早期在鼠类的神经 细胞中 γ-氨基丁酸表达的细胞通过中间层(IZ)的神经节隆起分散到所有皮质层，而后 来生成的细胞通过纹状体 VZ 区和 SVZ 区迁移进入皮质[20-21]。随着皮质的发育，初始迁 移的中间神经元显著地存在于位置较低的室管膜下区(SVZ )、中间层(IZ)、下皮质板 (SP)以及边缘带(MZ)。许多中间神经元到达皮质板显示出复杂的途径，例如很多中 间神经元沿切线迁移通过 SVZ–IZ，然后转向放射状迁移通过皮质板到达缘层。迁移阶 段的转变可能涉及环境信号和依赖于特定细胞内事件。此外，特定神经元的迁移障碍可 能涉及神经元从一个阶段到另一个阶段转换的失败。例如，皮质下带移位可能参与第二 阶段迁移过程中神经元的阻滞。最近的研究应用 Doublecortin 的小干扰 RNA (siRNA) 对 VZ 前体细胞进行宫内电穿孔导致过早捕捉在 SVZ–IZ 迁移的神经元。这一观察和神 经元不能够从迁移的第二阶段过渡到第三阶段相符合。Doublecortin 蛋白有使微管稳定 的作用，已有人提出该蛋白在核移位或延伸过程中有一定的功能。因为 Doublecortin 蛋 白的功能障碍被认为在动力学或微管结构中产生破裂作用。这些观察表明，细胞从脑室 到 SVZ 的初始运动和多极细胞的寄居阶段可能是相对独立的 Doublecortin 功能。不过， 定向向脑室或皮质板的放射状迁移可能依赖于 Doublecortin 相关微管的重组。 1.2大脑皮质发育的特点 大脑皮质的发育遵循由内及外的模式，早期生成的神经细胞占据深层，后期生成的 神经细胞迁移超越早期生成的神经细胞的位置去占据更多的上方的皮层。中间神经元和 锥体细胞都遵循由内及外的分层序列。最初的皮质有丝分裂后神经元由内到外有序形成 过渡层叫做前皮质板，随后产生的神经元迁移到前皮质板集体地形成一系列的层统称为 皮质板，从而将前皮质板分为浅层、缘层和一个深层，下皮质板。另外，迁移的神经元 33 小鼠大脑新皮质片层化和细胞周期变化的研究 穿过最先生成的神经元由内及外按顺序形成皮质的分层，位置深的层最先形成，位置靠 上的层最后形成[22]。皮质片层化的结局和出生顺序之间的联系对所有的皮质神经元都有 关联，包括有投射成分神经元组成的放射状神经元和最初抑制局部环路神经元组成的中 间神经元[23]。 2细胞周期和神经元迁移 2.1细胞周期和核迁移的关系 迁移是大脑皮质发育关键的一步，分化的神经元或神经胶质细胞以放射状或切线位 方式迁移去构造大脑结构[24]。增殖的神经祖细胞，众所周知如早期发育的神经上皮细胞 和晚期发育的放射状神经胶质细胞，也有一个具体的迁移系统，分裂间期核迁移 (interkinetic nuclear migration)，也称为“电梯运动”。新生细胞的细胞核需要在 G1 期 迁移远离顶膜，经过 S 期基底联合，在 G2 期扭转它们的迁移后续进行顶端有丝分裂。 这个过程被定义分裂间期核迁移(interkinetic nuclear migration)，是与细胞周期同步最 有趣的标志之一，该过程中的核位置和细胞周期相关[25-26]。S 期细胞核定居在 VZ 外区， 在 G2 期向内迁移，有丝分裂发生在脑室表面，细胞核然后向外迁移过程中由 G1 期进 入了 S 期。因此，神经祖细胞似乎在精确的调节细胞周期及核迁移的增殖方面很必要。 然而，阐述这些调节的机制仍不清楚。据报道，一个由肌动蛋白的聚合或破坏微管功能 对 VZ 区核迁移的抑制不影响细胞周期进程，这是因为神经祖细胞在通过 VZ 区时发生 异位核分裂中断了迁移。另一方面，秋水仙素或长春新碱，能够抑制有丝分裂，诱导这 些优先沿着脑室表面的细胞分裂阻滞。这些结果表明，分子对于迁移的调控不控制细胞 周期的进展，但细胞周期调控因子可能控制核的迁移。Interkinetic 核迁移作为一个很基 本的组织发生现象，广泛应用于许多上皮系统包括神经上皮，然而，此次迁移的生物学 意义目前还不清楚。 2.2细胞周期对核迁移的调控 目前的研究，为了澄清调节细胞周期是否控制神经祖细胞的核迁移，可利用两种化 学药品，5 氮杂胞苷(5AzC)和环磷酰胺(CP)，诱导神经祖细胞细胞周期停滞，然后 检查核迁移是否停止或不随细胞周期而阻滞。这些化学药品都是防癌药物，当胎鼠的大 脑被注射可发现凋亡诱导细胞周期的停滞[27]。神经祖细胞在脑室区的核位置与细胞周期 密切关联，即在细胞周期被破坏，而且神经祖细胞的细胞核只有当它们的细胞周期运行 34 综 述 才可以发生迁移。这些结果表明，细胞周期的调控可能通过共同的机制控制迁移。在环 磷酰胺(CP) 注射的大脑中，沿着脑室有丝分裂细胞的数量在 6 至 12 小时减少，表明 细胞周期阻滞发生在有丝分裂前。5 氮杂胞苷(5AzC)的注射引起 G2 / M 期阻滞，神 经祖细胞的细胞核在 VZ 内区停止迁移，在那里它们通常被设在 G2 期。结果表明存在 一种机制连接核迁移和细胞周期进程，此外，核迁移的抑制作用不影响细胞周期，这表 明细胞周期调控因子控制核迁移，但迁移系统并不能控制细胞周期。据推测，细胞周期 调控因子在 G2 期发挥的作用也可能促使外来核迁移。一旦细胞周期调控因子停止 G2 期过渡，它们也可能会阻止外来移位，同样的现象发生在假定的其他细胞周期阶段。 3大脑皮质发育和细胞周期 3.1细胞周期以及重要的周期蛋白 细胞周期是指连续的分裂细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束所经历 的整个过程，真核细胞的细胞周期分为 4 期:G1、S、G2 及 M 期。静止细胞处于 G0 期，在促有丝分裂因子的刺激下细胞能再次进入细胞周期。在 S 期，细胞进行 DNA 复 制，在 G2-M 期终末，细胞分化为 2 个细胞，这一精确的过程受到细胞周期蛋白的调控。 在哺乳动物的细胞中，细胞周期的 G1 期由 CyclinD 调控，它是细胞周期中 G1-S 期的 重要因子。在 G1 中期，CyclinD 与 CDK4/6 相互作用，参与 CDK4/6-Rb-E2F 通路;在 G1 晚期，CyclinD 和 CyclinE-CDK2 复合物相互作用。进入 S 期，通过与 CyclinE 解离 的 CDK2，从而和新合成的 Cyclin A 相互作用。CDK2-Cyclin A 复合物磷酸化多种蛋白， 使得细胞顺利通过 S 期。CyclinA 在 S-G2 期中起着重要作用，CyclinA 在 G2 期被降解， CyclinB 合成，CDK2 与 CyclinB 结合启动有丝分裂，CyclinB 是 G2-M 期重要因子。CDK 的抑制剂受生长抑制转录因子的直接控制，例如，肿瘤抑制基因 p53 诱导 p21 的转录， 激活 p53 的细胞周期加长，降低了神经前体在成年脑中发育中的扩张。相反，p53 的缺 失增加了胚胎和成年脑中的增殖，导致大脑增生，增殖导致的一种表型降低这两种结合 体的细胞凋亡。生长抑制转录因子和 CDK 的抑制剂通过抵制 CDK-Cyclin 复合物促进 肿瘤抑制基因视网膜母细胞瘤(pRb)的活化。蛋白磷酸酶(PP)19 和白血病蛋白(PML) 也是 pRb 激活的。 3.2大脑发育中细胞周期的作用 大脑皮质发育的整个过程中，细胞周期对于其大小、组织发生、神经分化都有联系。 35 小鼠大脑新皮质片层化和细胞周期变化的研究 大脑的整体大小是受细胞周期机械控制的，已经有研究表明大脑增大的小鼠普遍缺乏细 胞周期抑制蛋白 p27kip1[28-29]。增殖基因 p27，一种 CDK2/CyclinE 抑制剂延缓 G1 期向 S 期过渡，早已被提出来作为少突胶质细胞通过定时器检测其对细胞周期的连续积累分 蛋白已被证明具有两个功能域去抑制细胞周期和独立 化的机制。在皮质的发育中，p27 推广分化。事实上，p27 在皮质发育中的过度表达诱导神经元的发生，而它在成年前体 细胞中的消耗提高了增殖。同样，在成年小鼠的神经和造血系统中，p21 做为另一个 CDK2/CyclinE 抑制剂复合物的消耗，已被证明可以促进干细胞的扩充和诱导它们的静 止，从而最终导致其耗尽。抗增殖基因 Tis21 和 BM88(众所周知分别作为 PC3 和 Cend1) 在前体细胞从扩张转向分化中具有选择性神经表达标记的特点。它们的过度表达足以延 长细胞周期(可能是通过下调 CyclinD)并引发神经发生。沉默的抗增殖的基因如 p21 和 ink4a/Arf 由 polycomb 蛋白 Bmi1 分泌对于胚胎和成体神经前体的重建是必不可少的。 此外，p21 基因表达被 Olig2 抑制，Olig2 对于胚胎神经前体的自我重建而言是一种重要 的转录因子，但由于大脑一些部位比其他部位有大的倾向，许多细胞周期的复合物在特 异区域表达并控制区域的增长。例如，细胞周期蛋白 D1(CyclinD1)在视网膜和小脑 有高度限制的表达模式[30-31]，而在后脑 CyclinD1 和 CyclinD2 在不同的菱脑节表达[28]。 这些基因敲除的小鼠显示了各自区域的特定增殖缺陷[32-34]。大脑的大小是由其组成细胞 倍数和平均每个细胞的大小决定的。这些部分和神经元发生的途径以及细胞周期组件相 关联。切换从对称分裂开始，分裂的两个细胞都停留在细胞周期，而对于不对称分裂， 其中一个子细胞离开细胞周期，这可以用来调节神经元数[35]。 3.3大脑皮质发育中细胞周期的特点 我们知道，神经细胞的命运往往取决于它们最后的细胞周期，有实验证明皮质祖细 胞被移植到老的动物体中时，只有当祖细胞在 G1 或 S 期被移植才能在老的环境里改变 命运，被移植的细胞在 M 期保留了早期的命运[36-37]。内在的因素也可能和细胞周期特 定的阶段有关联，例如 Prox1 作为一个同源蛋白对脊椎动物的视网膜水平细胞的测定很 重要，其在 G2 期有最大的发生和表达[38]。在 S 期，染色体 DNA 必须通过染色质的移 动而加以暴露，才能使复制进行。 M 期:在 M 期，继承下来的因素成为决定母细胞进行局部不对称分裂的因素。神 经前体细胞的不对称分裂已在蝇类神经发生中被广泛地研究[39-41]。在这里有两个基本 点。第一，基本的细胞周期机制涉及设立不对称分裂。第二，隔离的决定因子会影响细 36 综 述 胞命运和细胞进一步的增殖。 G1 期:一个关键的细胞周期限制点位于 G1 期末期，如果细胞通过这一点，它们几 乎总是会完成细胞周期。这个限制点是受许多 G1 期组件包括 CDK4， CDK6， CDK2， CyclinDs，CyclinEs，Cyclin As，RB，E2F，p53 和细胞周期蛋白抑制剂所调控，为了分 化，细胞需要留在细胞周期 G1 期，进入 G0 期不通过细胞周期限制点。这说明特定细 胞周期蛋白抑制剂过度表达使 G1 期阻滞从而促进分化，通过 G1 期分裂的细胞可以抑 制分化。这一预测在爪蟾视网膜实验中得到证实，CDK 抑制剂 p27Xic1 的高表达可阻 滞细胞的 G1 期，同时分裂的细胞通过 CyclinE1 的高表达诱导原神经基因的活化[42]。同 样在哺乳动物细胞培养，CyclinD1 下调了 bHLH 基因 NeuroD 的转录活性[43]，CyclinD3 直接调节维甲酸受体的转录活性，从而促进神经发生[44-45]。事实上，几乎所有的 G1 期 调控组件已经报道可以影响神经决定，而且许多研究认为这些因子直接阻滞 G1 期，激 活决定因子通路[46]。虽然许多 G1 期细胞周期组件影响决定因子，反之亦然，即有很多 决定因子也影响 G1 期，允许细胞采取 G0 期分支[47]。例如，原神经基因 NeuroD2，Mash1 或神经元素-1 的过度表达可以使小鼠 P19 胚胎癌细胞转化为分化的神经元，在这个过程 中，它们诱导 p27kip1 表达使细胞周期 G1 期阻滞。外部神经决定因子和增殖信号也似 乎通过 G1 期细胞组件工作。Wnt 信号，通过 CyclinD1、CyclinD2 和 c-Myc 的表达调节 细胞周期[48-49]，Shh 调节 CyclinD1 和 N-myc 的转录[50]。 S 期:染色质的凝聚程度在细胞周期中有了变化[51- 53]，在 S 期染色体失去组蛋白开 始复制它们的 DNA，然后染色体再浓缩，有时会纳入染色质重塑。因此，神经系统发 育可能特别容易受到染色质重塑因素的影响。事实上，一些研究表明，复杂的染色质重 塑复合如 SWI/SNF 在神经系统发育中起着关键的作用。 在这篇综述中，我们阐述了大脑皮质发育的特点以及在此过程中神经发生、迁移、 分化和细胞周期之间的联系。神经系统发育过程中，我们对于细胞周期的探索得到重要 的提示是许多细胞周期基因的表达受限制并影响细胞的命运。相反，许多神经分化因子 调节细胞周期，无论直接和间接的影响。事实上细胞周期组件和发育因子之间似乎有许 多的复杂关系，我们现在可能只是抓住这个问题的表面，但在未来几年中，我们希望连 接细胞周期和神经发生各个方面之间的逻辑网络能得到阐明。 37 参考文献 参考文献 [1] Walsh CA. 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Death receptor 5 and neuroproliferation. In submission. 5. 席艳，张俊士，臧建峰等，孕期酒精暴露对子鼠视皮质突触数量影响的体视学研究 [J].药学学报，已刊. 6. 邓锦波，李瑞玲，臧建峰，张俊士，崔占军，范文娟. 妊娠酒精暴露致仔鼠畸形眼 球病理学研究. 神经解剖学杂志，审稿中. 43 致 谢 致谢 在举笔即将完成这篇致谢的时候，我猛然发觉自己即将离开校园，人生又将 写下新的篇章。在这离别之际，尽管依依不舍，却很珍惜，因为在我的生命中有 那么多可亲可敬可爱的人值得感激。 首先，我要感谢我敬爱的导师------邓锦波教授。在三年的研究生生涯中， 很幸运得到老师的抬爱，师恩如父，永刻于心。难忘老师坚强的性格与不屈的意 志，做为我的导师他以严谨细致、一丝不苟的学术作风，循循善诱、不拘一格的 教导风格深深的影响着我，也使我在学术方面不断进取、刻苦追求。感谢老师在 科研思路和统计方法上的教诲与鞭策，这些是我的毕业论文得以顺利完成的重要 因素。惟愿师生情谊一生延续～祝愿老师及家人健康快乐，永远幸福～ 衷心感谢河南大学神经生物学研究所的牛艳丽老师、文曙光老师、崔占军老 师、席艳老师、李明善老师、于东明老师、厉永强老师;感谢范文娟师姐、同学 樊晓、邓同兴、刘曦、曹瑞萍、朱珂、马战友;师弟金海啸、师妹孔维芳、周洁、 高文静、符星、刘静、邹建玲、刘青颖及所有在平时的实验中对我悉心指导与帮 助的人。三年来，我们在学习和工作中结下的深厚友谊，令我终生难忘。 由衷感谢我的室友同学张冬、程洪广、高华。他们开创性的研究拓展了本论 文的学术视野，无数次的探讨使我的研究工作有了长足的进展。 对我学业最支持的当然是父母，感谢你们竭尽所能地为我提供良好的学习环 境，给予了我健康的体魄，诚朴正直的品质，这些都是我受益终身的财富。感谢 父母和哥哥们给予我成长的关怀，祝你们永远健康平安～ 最后，感谢曾经教育和帮助过我的所有老师。衷心地感谢为评阅本论文而 付出宝贵时间和辛勤劳动的专家和教授们～ 臧建峰 2011 年 4 月 44