【doc】中国北方汉族人HLA—DR的DNA分型

【doc】中国北方汉族人HLA—DR的DNA分型 中国北方汉族人HLA—DR的DNA分型 4弓一牛 中华徽生物学和免疫学杂志1993年第13卷第1期 中国北方汉族人HLA--DR的DNA分型 陈香美刘述文柏立群朱宁 巧辱t伊藤巧一.小幡文弥,z? f,工) 本研究采用聚合酶链反应技术(PCR)扩增DNA片段,利用30种针对HLA--DR不同等位基因DNA的序 列特异性寡接苷酸(SSO)探针检测了2,55例随机中国北方汉族健康人的HLA--DR亚型的基因频率,并与日本 人HLA—DR基因频率进行了比较.该检测方法用血量步,特异性强,SSO作为一种分型制剂可长期使用,从而 为临床上应用此技术检测与疾病相关的HLA—DR抗原提供了依据. 关键调: — HLA — -- DR基因鞭翠,苎兰坠墨皇壁壁区廑 人类白细胞抗原与多种疾病有关,其中 HLA—DR抗原主要存在于B淋巴细胞,单核 细胞及内皮细胞上,对T淋巴细胞识别外源性 抗原起着重要的应答作用.检测HLA—DR的 分布对预测和诊断某些疾病具有重要意义.近 年来,由于分子生物学技术的发展,采用PCR/ SSO技术对HLA—DR抗原DlqA的检测在国 际上已有不少报道,但在我国尚少报道.本文参 照伊藤等人.的方法,采用PCR/SSO技术检 测了我国北方汉族健康人HLA—DR基因频率 的分布,旨在为临床上应用此技术检测与疾病 相关的HLA--DR抗原提供依据. 材科与方法 1.检蔫对象:随机选取的中国北方投族健康人 255倒,男女比例1.1,年静范围16~60岁. 2.外一血辫巴绷囊DNA的摄取:按文献0,3]进 行.255份血标本均为北方地区汉族健康人的外周血. I.DNA的扩增——PcR:参照伊蓐等人的方法 进行. ?.ss0嚣针的翻备置标记t按文献报道方法", 采用BlosearchcycloneDNA合成仪合成本实验所需的 3O种SSO撵针.其合成用的引物为FPR-一AGT— GTCATTTCTTCAA(Tc)GGGACGGA--3~]及DR— BAMPl[5--CGCTGCACTGTGAAGCTCTC--3'].合 成的SSO探针用"P—rATP末端标记法标记制成撵针 备用. s.疆点杂交参照文献[2,3)进行.第一次杂交 后,一70?放射自显影24,72小时冲片取得结果后将 尼龙膜用0.4mol/LNaOH于37?置育l5分钟,再用 0.1XSSC,0.01SDS置育15分钟以除去膜上的探 针,换用其它探针,重复杂交过程即得各种探针的杂交 结果.各种探针杂交后洗膜的溶j葭及温度如下t探针 …FFI,FIl1FFF在54"C下用6~SSC加 0.1SDS洗膜:探针F.FFL口1FmF,FF., FFFm在57"C下用上j葭洗膜I探针F…FFl, F1皿'FIF.11Fl"在62"C下用上液洗膜}FmF*在 57"C下,Ft和F..在62"(2下用3mol/L四甲基氯化铵溶 j葭洗膜.在上述洗膜之前,所有的尼龙膜均先用6× SSC,0.1SDS于室置下洗膜5分钟. 结果 1.DNA扩增效果的检测:DlqA经PCR扩 增后,在琼脂糖电泳凝胶上于238bp处可见一 明显条带. 2.斑点杂交结果:利用各种SSO探针进行 斑点杂交的结果,是依据尼龙膜上的斑点在x线片上相应位置是否显影,并与阳性对照进行 比较来判断为阳性或阴性. 3.2S5倒我国北方汉旗健康人DRB等位 基因的频率分布:1所示为我们用3O种SSO 探针进行HLA—DR基因分翌得出的255倒我 国北方(以jE京地区为主)汉族健康人DRB基 奉谭题为国家自然科学基盒资助 1解放军总医院肾内科北京 2.日本北里大学穆擅免疫教室 学和免疫学杂志1993年第13卷第1 因频率的分布情况表2为根据第十一届国际计算的DR特异性基因频率. 组织相容性学会(1lthIHW)发表的DR亚型 表1华北汉族t蠢供血者基因纂宰分布 Table1.DistributionofDRfxequenciesinheathyHansdonors(n=255) 衰2DR特异性帕基因囊事 Table2.Gene如}qutn嘶ofDR=perJficity 4.本文结集与日本人HLA--DR基因频率 的比较:我们用SSO分型的中国北方汉族健康 人HLA—DR基因频率与伊藤等人用同样方法 测定的日本人HLA—DR基因频率"进行了比 较,发现HLA—DR亚型的分布是一致的,但一 些等位基因的基因频率有差异,其中我国北方 汉族人的DR2,DR3,DR1l(5),DR7的基因 频率高于日本人,面DR1DR4,DR13(6), DR8,DRJX6的基因频率砌低于日本人的相应 基因频率.尤以DR7的基因频率差异最大.由 表3可见,DR7的基因频率在中国人为 14.5,在日本人为0.4. 寰I中国人和日本人HLA--DR基因臻率比较 Table3.Comparisonbelweengonefrequenciesfor HLA—DRobtainedfromChineseandJapanese 讨论 HLA--DR的血清学分型在八十年代获得 巨大进展.过去国内外都采用微量淋巴细胞毒 方法进行HLA血清学检测.由于有许多影响因 素,因此实验结果常不稳定.1986年Saiki等人 利用PCR技术及合成的HLA—DQ2特异性寡 核苷酸探针对HLA—DQ2基因进行了分型. 1987年第十次和1991年第十一次国际组织相 容性抗原会议对国际上HLA等位基因分型进 行了研究和命名.目前国外利用PCR/sSO技 术对HLA—DR基因进行分型已有不少报道, 但是国内尚未见这方面的报道. 本文随机选取我国北方汉族健康人255 例,利用30种SSO探针对其HLA—DR亚型 进行了分型,并对每个分型的等位基因计算了 基因频率.结果发现在我国北方汉族人群中,以 DR2,DR7,DR9的基因频率为高.同时,将本文 的结果与伊藤等人测得的日本人HLA—DR亚 型的基因频率"进行了比较,发现我国北方汉 族人与日本人的HLA--DR亚型的分布是一致 的,但一些DRB等位基因的频率有差异.我国 北方汉族人的DR2,DR3,DR11(5),DR7的基 因频率高于日本人,而DR1,DR4,DR13(6), DR8和DRJX6的基因频率则低于日本人的相 应基因频率,其中尤以DR7的基因频率差异最 大(DR7基因频率在中国人为14.5,日本人 为0.d)这种差异可能与来自不同地区,不同 种族的人群有关. 近年来,由于分子生物学的飞速发展, PCR/SSO技术已广泛应用于医学研究各领域. 利用PCR技术扩增从外周血淋巴细胞提取的 DNA,少量血标本即可满足HLA--DR各等位 基因的检澜,节约了用血量,且特异性强,结果 稳定,并能确认使用免疫学方法不能确认的一 些等位基因,因而能较好地应用于临床. 参考文献 1.ObatsF?etal-HLA—DRgenefrequenciesintheJapanese populationobtainedbyoligonu~leotidegenotyPing?Tissue Antjse皿.1991?38l124. 2.ObamF.et.Seqtteneesa.alysisandolisonucleottde senolypingofHLA—DRYX6,aDRblankhaplotype foundintheJapanesepopIdat;0n.HumImmnnol,1990. 27_289. 3.ObataF?elaJ-Oligonucinotidegenotyplngajttmethodof detectingtheHLA—DR2(DRw15)一Dw2.一DR2 (DRw15)一Dw12.一DR4一Dw18.and—DR?一DKT2 haplotypeintheJapanesepopulation.TissueAntell.? 】989.33J550, 4?ObataF?elal?OIjsonucl~tidege.otypin$mSAmethodof deteetil~theHLA—DR2(DRW15)一Dw2.一DR2 (DRw15)一Dw12.一DR4一Dw15and—DR4一DKT2 haplotypesintheJapanesepopulation?TissueAntigens, 1989.38|550. 5.BellJl?eta1.AIlelinvariationintheDRsuhx'~ginnofthe humanm?rhietocompatibilitycomplex.procNstlAcad SciUSA.1987,84|8234. 8-AbeA?et-TwodistinctsubtypesoftheDRw12hsplo— typesintheJapanesepopulationdetectedbynu~inotMe目e— qnenceanalysisand01isonucleotldegenotyping.Immun~ gonerIns,1989-30|422. 7-MerrymanP-etaI?Nucl~tidesequenceofaDRwlOB chaineDNAclone.Jlmmunol,1988,140,2447. 8.TiaroyJM,etal?DNAtypingofDRw6subtyDes:correta— tJonwithDRBIandDRB8alJeUcsegue~cesbybfortdiza— tionwithol逗onucleotideprobes-Humlmmunol,1989,2{ |1. 9.BodmerJ0.etal-NomenclaturetotfactorsoftheHLA system.1991.TissueAntigens,1992,89,161. (收稿:1992—03—14修回:1992--08一) 1993年第13 HLA—DRGENEFREOUENCIESINcHINESEP0PULAT10N0BTAINED BY0LIG0NUCLE0TIDEGEN0TYPING ChenXlang—meiI.KoichiIto,etat HLA— DRallelesof255randomhealthynorthernChinesedonorsweredeterminedbyusingasetof30 differ— entsequencespecificollgonucleot1de(sso)probesd~ectedtovariousDRB且 Ileles?TheseSSOser~hledugtoidenti- 33differentDRBalleles-GenefrequencieswerecalculatedforeachofDRBallelesidentified bytheSSOtyping. ByComparingthegenefrequenciesforeachofDRallelesobtainedinChLqesepopoulationw iththoseobtainedjn Japanesepopulation,similardistributionofHLA— DRsubtypeswasfoundinthesetwopopulatior~s.butmarked difforencewa8geeningenefreqUenciesof8omeDRBalleles,Inthisstudy,weusedPCR13ri mersthatamplifyaUthe DRBgenesofallthepossibleDRBalleles?PCRrequiresonlyasmallvolumeofbloodand扭 ofhishspec~icitY— SSOscouldbesynthesizedchemicallyinalargeamountandthereforeservedasalong— termanduniversaltyping reagent?BecauseourgenotypingwithSSO—probes证basedonphysicochemicalreaction—itwouldhavesuperiorre— liabilitytoimmurtologicaltyping? Keyword=:Genefrequermey;HLA--DR;Polymerasechainreaction(PCR);ChineseHan'spopulationf Oligonucleotide t-口4'e-"?^仲,tPLAG{且口ital?8嘶i 2.口叩4,咖er".4-l4lhlmmato~of:t,K#aa=*o_…抽口,,J4? 聚合酶链反应检测沙眼衣原体及其质粒特异核酸 汪妍陈火胜蒋文玲罗宪玲韩辉玉.李质怀. 本文报道了检测沙眼衣原俸质粒DNA及抄眼衣 原体MOMPDNA片段的多聚酶链反应方法,其具有 特异,简便,可靠的特点.引物P…P由Dr.G.Ratti提 供,是根据抄眼衣原体特异的7.5kbp的质粒设计合成 的,特异扩增片段约500bp为吉各血清型抄眼衣原体 共有的特异质粒DNA片段,具有种特异性.所用的楼 板为L:型,F型及本室分离阳性株的沙眼衣原体及其 质粒DNA,所设对照包括正常McCoy细胞}加沙眼衣 原俸DNA提取物不加引物对照f加引物不加沙眼衣原 体DNA提取物对照.经92?,46秒65?,30秒一 70?,60秒进行扩增反应,循环3O周期后用l5琼脂 糖凝胶电泳EB鞋色现察结果.对照组均呈阴性结果, 而实验组则观察到预定大小的600bp产韧.引牺P…P 由中山医科大学微生物教研室提供,特异扩增约400bp 的沙眼衣原体主要外膜蛋白基因片段所用的实验组 DNA及对照组与上述系统相同.结果用1.5琼 脂糖凝腔电泳EB染色证实扩增产物大小为所设计的 400bp片段,而对照组均呈阴性结果.用克隆于M载 体中的单链衣原俸MOMP基因片段500ng作 Digoxigenln标记探针,斑点杂交法橙测其PCR产物亦 获同样结果. 沙眼衣原体特异质粒大小7.5kbp,存在于抄眼衣 原体所有血清型中,每十沙眼衣原体细胞存在5,lO 拷贝的上述序列.本文结果还表明P…P扩增沙眼衣 原体MOMPDNA所需模板量比引物P,扩增衣原 俸特异质粒DNA片段所需的摸板量多40倍,故如推 广于临床标本中则用P],扩增其特异质粒DNA鞍 敏感,秘们利用PCR技术在体外成功扩增丁沙眼衣原 体质粒DNA及沙眼衣原体MOMP保守序列的DNA 片段,为利用PCR技术检测临床标本中沙眼衣原体 DNA感染打下良好基础. 1.广东省老年压学研究所病毒室广州 2-中山医科大学撒生物教研室广州 '收穑:1902一O5—28修回:1992—08一l8)