体内药物分析总结

体内药物总结 专一:生物样品处理原则与技术 一、一般问题 1. 药物的体内过程(ADME) 吸收:药物由给药部位未经过化学结构变化进入血液循环系统的过程。 首过效应:药物经肠道吸收首次进入肝脏时，有些药物可被肠液或肠道上的肠菌酶破坏，或在肝内受到微粒体混合功能氧化酶代谢，使进入体循环的药量减少。 分布:药物吸收后，由血液透过各种生理屏障向机体各部位可逆运转的过程。影响分布因素: 1) 药物化学结构与理化性质2)血流量与膜通透性3)药物与血浆、组织蛋白结合率 注意竞争血浆蛋白结合的药物间相互作用及其临床意义:显著增强其药理效应或毒性。 转化(代谢):药物经吸收分布后，在药酶作用下经历化学变化的过程。 排泄:药物及代谢物从体内被清除的过程。主要是肾排泄和胆汁排泄 肠肝循环:药物经胃肠吸收，经胆汁分泌进入小肠或药物经吸收后在肝转化为代谢物，经胆汁分泌排入小肠，在小肠处重吸收的过程。特征为―双吸收峰‖。 1. 药物体内状态及待测物选择 a.一般测定血清或血浆中结合型和游离型药物总浓度，几个别用全血(环孢霉素A) b.游离型:理论上说游离药物与药理作用强度直接相关。主要方法有2种: 1平衡透析法:将含药物的血浆与透析液放置于半透膜两侧，在一定温度下搅拌使其平衡。半透膜能阻挡血浆蛋白和结合药物的血浆蛋白，而游离药物自由通过半透膜并达平衡。优点:平衡状态下，结果真实可靠 缺点:受稀释作用影响，费时 2超滤法:利用离心力迫使药物通过半透膜，同时血浆中水分也不断被滤除，使样品管内血浆样品不断浓缩，打破了药物与血浆蛋白结合的动态平衡。优点:设备简单，时间短，收集到足够的超滤液可直接进样 缺点:非平衡状态下测定。 1. 生物样品种类、特点与选取和取样方式 种类:血液、尿液、唾液、头发、脏器组织、乳汁、胆汁、粪便等 特点:干扰杂质多、样品量少、待测物浓度低。方法灵敏度及专属性要求高 a.血液:损伤性取样，较麻烦，较好体现药物浓度和疗效的关系。主要用于药动学、生物利用度、临床治疗药物监测中，大都测定原型药物总量。b.尿液:无损伤取样，方便，药物浓度较高，收集量可很大。但易受食物、饮水多少影响。主要用于药物剂量回收、药物尿清除率、生物利用度的研究。 c.唾液:无损伤取样，易收集，可用于药动学，药物滥用，可体内微量元素检测。d.组织:常采用肝、胃、肾、肺、脑、肌肉等脏器组织。首先需将检材均匀化，制成水基质溶液，然后再用适当方法萃取药物。e.头发:取样方便，无伤害，可用于体内微量元素含量测定，药物史估计、滥用药物监测以及毒性药物的检测。 - 1 - 1. 样品处理的目的和要求: a. 从缀合物中释放出来，测定总浓度b.介质组成复杂，干扰多，而组分微量，必须经预处理纯化和富集。c.为适应和符合测定方法所要求的灵敏度d.防止分析仪器污染劣化，提高检测器灵敏度，准确度，精密度和选择性。 1. 样品制备时应考虑的问题:a.待测物理化性质与存在形式b.浓度范围c.样品测定目的d.选用 生物样品类型e.预处理与分析结果之间的关系 2. 样品预处理技术 一、有机破坏法:湿法破坏、干法破坏、氧瓶燃烧法 二、除蛋白法: 目的:a.使结合型的药物释放出来，以便测定药物总浓度。b.预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成。c.保护仪器性能(如保护HPLC柱不被玷污)，延长寿命. 1.加入与水混溶的有机溶剂:乙腈，甲醇，乙醇，丙醇，丙酮，四氢呋喃(广泛使用) 原理:使蛋白质分子内及分子间氢键发生变化而使蛋白质凝聚，促使结合药物的释放。 2.加入中性盐:硫酸铵，硫酸钠 原理:使蛋白质离子强度发生变化，将水置换出来，使蛋白质脱水而沉淀。 3.加入强酸:10%三氯醋酸 6%高氯酸 原理:PHPI时，金属阳离子与蛋白质阴离子形成不溶性盐而沉淀。 5.超滤法:以多孔性半透膜为介质 原理:通过选用不同孔径的不对称性微孔膜，按截留分子量的大小可分离可溶性大分子物质。 6.酶水解法 7.加热法:只能出去热变性蛋白 三、液液萃取法(LLE)和离子对萃取 原理:基于被测组分在不混溶的两种溶剂中的分配系数不同而得到分离。多数药物是亲脂性的，而血样或尿样中含有的大多数内源性杂质是强极性水溶性物质。因而用有机溶剂萃取一次即可除去大部分杂质，从大量的样品中萃取药物经浓集后作为分析用样品。 需考虑的问题: a.溶剂的选择和纯度的要求:考虑提取效率与选择性和操作是否方便 选择溶剂注意事项:1相似相容2对未电离形式可溶而电离形式不溶3沸点低，易挥散便于浓集4与水不容5无毒，不易燃烧6不易乳化7较高化学稳定性和惰性8不影响紫外检测 b.有机溶剂相和水相体积(一般1:1或1:2) c.水相的PH值:碱性药物用氨水调至PKa+(1~2)，酸性药物用甲酸调至PKa-(1~2) - 2 - 优点:选择性好，药物能与大多数内源性杂质分离 缺点:a.乳化现象导致回收率降低。解决方法:1加入适量固体NaCL,减轻乳化程度。2已经微乳化的，适当转速离心，使水相和有机相完全分开。 3严重乳化的，置低温冰箱使水相快速冻凝，坏乳化层，再融化后离心。 b.有机溶剂易挥发、有毒性、对环保不利及不能自动化。 离子对提取法(特殊的一种LLE):适用于极性大呈离解状态的药物，添加于药物离子电荷相反的反离子后，形成脂溶性离子对，这时可用有机相从水相中提取分离。碱性药物反离子:烷基磺酸类(己烷磺酸)。酸性药物反离子:烷基季胺类(四丁基胺) 常用提取溶剂:四氯化碳，环己烷，乙酸乙酯，正丁醇 四、固相萃取(SPE) 原理:SPE是一种吸附剂萃取，样品通过填充吸附剂的一次性萃取柱，分析物和杂质被保留在柱上，然后分别用选择性溶剂去除杂质，洗脱出分析物，从而达到分离的目的。SPE柱的填料粒径(>40µm)要比HPLC填料(3~10µm)大。由于短的柱床和大的粒径，SPE柱效比HPLC色谱柱低得多，只能分开保留性质有很大差别的化合物。 两种洗脱方式:1药物先被保留，在用溶剂洗脱。2药物直接被洗脱 分类:亲脂型(大孔吸附树脂，亲脂性键合相硅胶)，亲水型(硅胶，硅藻土)，离子交换型 1.亲脂性键合硅胶相:烷基，苯基。C18最常用。适用于萃取纯化水基质液体中疏水性药物。 1)一般实验步骤:1吸附柱的选择:据检测量大小、待检物质理化性质。2活化填料:采用甲醇活化，有利于吸附剂和目标物质相互作用，提高回收率，还能起到除杂作用。3进样:使样品流经吸附柱进行吸附。4冲洗 :用水或者是适当的缓冲溶液对吸附柱进行冲洗，将杂质冲洗掉。5洗脱 :选择适当的洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液， 然后进行浓缩检验或者是直接在线检验 2)注意事项:1体液样品可直接上柱，体积0.1~2ml，流速1~2ml/min。2萃取碱性药物时，常加酸，有机胺或氨水，醋酸铵或离子对试剂，以减少硅醇基的吸附作用3苯基，腈基柱有一定极性，可用于正相模式。 2.大孔吸附树脂:适用于吸附较大的分子，具有高的传质速率。不会对碱性药物产生强吸附。 3.离子交换树脂:适用于高极性，可电离药物。回收率好(>90%)，选择性好，但是费时。 4.亲水型填料:与LLE无本质区别。只是样品分布在表面积很大的SPE支持物表面，使有机溶剂和水相充分接触，比LLE更容易达到平衡。 萃取方法选择:1较亲脂药物最好用烷基硅胶键合相省时，碱性药物用大孔树脂为佳。 2较亲水且具有酸碱性，可电离，采用离子交换树脂 3较亲水但不能解离，不易萃取，沉淀蛋白后直接进样 SPE优点:1引入杂质少，样品用量少2避免乳化3萃取率高，重现性好4易于自动化 - 3 - SPE缺点:1贵 2技术要求高 3批与批之间差异 4柱子易阻塞 SPE技术新进展:1扩大萃取剂的适用范围,即提高通用性2固相萃取的填料更具有选择性 沉淀蛋白法，LLE和SPE的比较: 沉淀蛋白法:快速简便，回收率好，但待测物含量低时不用。 LLE: 选择性好，有毒性、对环保不利及不能自动化，乳化现象—导致回收率降低 SPE:短时间内达到有效萃取，可自动化，对酸碱度要求无LLE严格。 固相微萃取法(SPME):分为萃取过程(直接或顶空)和解吸过程。 1. 直接固相萃取:将涂有高分子固相液膜的石英纤维直接插入样液或气样中 2. 顶空固相萃取:石英纤维停放在样品溶液上方进行顶空萃取，避免基本干扰 3. 解吸:热解析，将萃取器针头插入气化室，使萃取物不断被解吸出来。 特点:整个过程实现无溶剂化，减轻污染，提高柱效，节省时间。 五、直接进样技术:适用于极性很大的药物 条件:待测组分不经浓集就达到足够的检测灵敏度，而且在流动相中引入较多体液水分对待测物的色谱分离和色谱系统无影响。 应用:1直接进样与沉淀蛋白进样:前者最适合尿样分析。后者的局限性:沉淀剂加入体液后样品被稀释，检测灵敏度变低;残余沉淀剂引入色谱柱对组分的色谱分离有影响。 2柱切换技术:详见下 3胶束色谱法:用含有高于临界胶束浓度的表面活性剂作为流动相。被分离组分在胶束，水相和固定相三相之间存在分配平衡，通过静电作用，疏水作用，增溶作用和空间作用等综合性的协同作用分离，而获得一般色谱所达不到的分离效果。适用于化学结构类似，性质差别细微的样品组分的分析。特点:1选择性高 2有利于梯度洗脱 3提高检测灵敏度 4不适用于制备 六、柱切换技术 定义:指由阀来改变流动相走向与流动相系统,从而使洗脱液在一特定时间内从预处理柱进入分析柱的技术。 主要目的:1在线净化样品，使前处理自动化。2富集微量组分。3在线衍生化。4在一个色谱网络中达到多个分离目标。5增加色谱分辨率与选择性 优点:1操作简单，全自动化。2含蛋白样品可直接进样或简单经蛋白沉淀后进样，精密度高。3适用于不稳定样品，基于全过程在封闭状态下进行。4提高检测灵敏度。 缺点及对策: 1系统峰的干扰:柱切换过程中有较大体积的预处理流动相进入分析柱，分析柱的平衡可能被破坏，往往会产生系统峰干扰测定。解决方法:a.调节预处理流动相的PH;b.改变预处理流动相的组成。使其尽量与分析流动相接近。 - 4 - 2峰展宽:解决

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:a.采用洗脱能力比预处理流动相大的分析流动相使峰在分析柱上进行压缩变尖。b.采用反冲方式，使组分从预处理柱端反向进入分析柱。c.加入离子对试剂，同时提高选择性。 3回收率低:解决方案:a.调节预处理流动相PH值。b.降低预处理流动相的流速。c.提高固相填料竞争蛋白结合药物的能力。d.减少药物与蛋白质的结合。 应用:1.在线去蛋白2.全血直接进样3.柱切换与在线透析联用4.柱切换与在线衍生化联用 七、衍生化技术 定义:在色谱过程中用特殊的化学试剂，借助化学反应给样品化合物接上某个特殊基因，使其转变为相应衍生物之后进行检测的方法。有紫外~，荧光~，电化学~，手性~四种。 GC中衍生化的目的:1使极性药物变成非极性易挥发药物，使其具有能被分离的性质。2增加药物的稳定性。3提高对光学异构体的分离能力。 主要反应:1硅烷化:具有-OH,-COOH,-NHR 常用试剂:三甲基硅烷试剂(三甲基氯硅烷) 2酰化:具有OH,-NH,-NHR 常用试剂:三氟乙酸酐 2 3烷基化:具有-OH,-COOH,-NHR 常用试剂:叠氮甲烷 4生成非对映异构体:采用不对称试剂 含氟的衍生化试剂不仅可以提高药物挥发性，且电负性上升，对GC的ECD灵敏 HPLC中衍生化的目的:1提高灵敏度 2改善分离度 3进一步作结构鉴定 对衍生化反应的要求:1条件不苛刻，反应迅速定量 2产物单一或副反应不干扰测定 3衍生化试剂方便易得，通用好 柱前衍生化:先衍生化反应再经色谱柱分离测定。 优点:衍生化反应条件选择不受色谱限制;缺点:操作繁琐，准确性低 柱后衍生化:先注入色谱柱分离，流出物分别与衍生化试剂反应生成衍生物后进入检测器 优点:操作简单，可自动化，适用于大量样品分析 缺点:在色谱系统中反应没条件限制多(流动相选择严格，反应速率应很快等) 八、其他技术 1. 顶空气相色谱法:在封闭恒温系统中气相和凝聚相(液相或固相)存在着分配平衡，因 此 气相的组成能反应凝聚相的组成，用GC法来分析平衡体系中气体的方法。是一种特殊的样品采 集方式，大大减少样品基质对分析的干扰，主要用于复杂基质中挥发性残留物的分析。分为静态 顶空气相色谱法和动态顶空气相色谱法。 2. 制备HPLC法:HPLC法用于分离和制备纯样品组分的现代手段，具有快速高效等特点， 其 制备量可达克级。制备型色谱柱:内径20~40mm，柱长10~30cm，对检测器灵敏度不高，但不 能是破坏性的。 - 5 - 3.微透析技术:实质是一种膜分离技术，利用膜透析原理，微量地对细胞液进行流动性连续采样的采样和色谱样品制备技术。它可在基本不干扰生物体内正常生命过程的情况下进行在体、实时和在线的取样和检测。具有―活体、微创、实时、高效‖等特点 原理:以透析作为取样的基础,透析管内存在着浓度梯度,物质可沿浓度梯度扩散;一般透析膜外样品浓度高于膜内浓度,可透过膜的小分子物质穿过膜扩散进入透析管内,达到一种动态平衡,并可被透析管内连续流动的灌流液不断带出,达到对活体组织取样目的。 九、不稳定药物的预处理方式: 1易氧化药物:加抗氧剂1) Vc+EDTA 2)半胱氨酸(含巯基) 3)2-巯基乙醇 2将不稳定药物转化为稳定药物:1)衍生化 2)更换溶剂:如酯键在甲醇和水中容易水解，可换成乙腈。3)加酯酶抑制剂:如避免被血清酯酶酶解。4)沉淀蛋白:血清酯酶也是蛋白 专题二:体内药分方法的选择 一、常用分析方法和特点:考虑专属性 灵敏度 准确性 重现性 试验成本 1.光谱法:比色法、紫外分光光度法、荧光分析法、原子吸收分光光度法 2.色谱法3.免疫分析法:按标记物种类分为:放射~、酶免~、化学发光酶~、荧光~等。 按是否加入分离剂分为均相和非均相免疫分析法。 4.微生物法:它是利用药物对于微生物的抑制或杀灭作用，通过选择对药物敏感的试验菌，在适当的条件下，根据培养基上所产生的抑菌圈的大小来测定药物效价的方法。有稀释法、比浊法、扩散法三种测定方法。 二、分析方法选择依据:例1.例2.见笔记 专题三:体内药物分析现代方法与技术 一、高效毛细管电泳法:适用于可电离物质或带电荷物质，如生物碱，有机酸，核酸，蛋白 定义:以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品各组分之间淌度和(或)分配行为上的差异而实现分离的技术，是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。 基本原理:1.电泳:在电解质溶液中，带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象。 2.电渗流:在pH>3时，毛细管壁上的硅羟基负离子使毛细管壁内表面带负电，和溶液接触时相应的缓冲液带正电，形成双电层。在高电压作用下，双电层中水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动，该现象叫电渗流。具平面流型。 3迁移速度为电泳和电渗流的矢量和，故正离子先流出，中性粒子电泳速度为零，其迁移速度为电渗流速度;负离子电泳方向与电渗流方向相反，最后流出。这样，各种离子通过迁移速度不同而得到分离。 影响CE分离效果的因素:1电渗流 2焦耳热和梯度温度 3毛细管柱 4其他 - 6 - 减少CE峰展宽的因素:1增加电场强度以增加速度 ，但自热产生，此时减少缓冲液浓度而减低温差，减少自热 2高离子强度缓冲液有浓度聚焦作用减少峰展宽 3减小管径。 CE分离模式:毛细管区带电泳 (CZE)、胶束电动毛细管色谱 (MECC)、毛细管凝胶电泳 (CGE)、毛细管等电聚焦电泳 (CIEF)、毛细管等速电泳 (CITP)、环糊精电动毛细管色谱 (CDECC)。 胶束电动毛细管色谱 (MECC):体系中存在以胶束形式的准固定相和作为载体的液体流动相，各组分据其在水相和胶束相之间的分配差异及在电泳和电渗流驱动下出现淌度差异而分离。优点:常用于手性拆分，唯一一种还能分离中性物质的模式。 CE优点:(三高二少)1高灵敏度，激光诱导荧光检测器最灵敏。2高分辨率，理论塔板数可达几百万，甚至几千万。3高速度，电驱动加上泵驱动，双重驱动力。4样品少，只需pg级的进样量。5成本低，只需少量几毫升流动相和价格低廉的石英毛细管。 CE缺点:1灵敏度和线性范围不如HPLC ;2定量精密度低于HPLC;3仅实现微量制备 CE常见检测器:紫外检测器——最常用;激光诱导荧光检测器——最灵敏; 质谱检测器——通用型;电化学检测器;化学发光检测器; 二、毛细管电泳免疫分析法(CEIA):将毛细管电泳和免疫分析联合使用的一门新技术 定义:利用抗原抗体复合物与游离的抗原抗体在电泳行为上的差异，将毛细管电泳作为分离分析的手段，分为竞争性CEIA和非竞争性CEIA。 优点:样品用量少、速度快、分离效果好，解决免疫反应中―交叉反应‖造成的假阳性问题。 缺点:重现性差，灵敏度差，易吸附 解决蛋白质吸附的对策:1使用极端PH的缓冲液(<2.5或>9.0)以抑制吸附，但会导致蛋白质活性变化。2采用添加物:表面活性剂或高聚物电解质，但前者仍会导致蛋白质变性，后者可能对蛋白质迁移行为产生影响。 3对管壁进行修饰:常用化学键合相涂层，但复杂。 竞争性CEIA原理:2种。 第一种:已知数量的标记抗原和有限数量的抗体与待测物混合: Ag + Ag* + Ab(有限) = Ab-Ag + Ab-Ag* + Ag + Ag* [划线部分为两个峰，大小呈反比] 第二种:已知数量的标记抗体和有限数量的抗原与待测物混合: Ab + Ag* + Ag(有限) = Ab-Ag + Ab-Ag* + Ab + Ab* [划线部分为两个峰，大小呈反比] CEIA的检测方法:据分析物是否标记分为标记和非标记检测。手段主要是紫外检测和 激光诱导荧光检测(LIF); 三、LC-NMR技术: 定义:把HPLC高分离能力和NMR提供最大量结构信息能力相结合来鉴定化合物结构。 操作模式: - 7 - 1在流模式( on - flow mode):从色谱柱流出的洗脱液直接被输送到NMR, 在洗脱液流经核磁探头时得到核磁共振谱图 , 因此NMR 相当于LC 的检测器。优点:分析时间短，适宜分析高浓度样品;缺点:不适宜分析低浓度样品，只能检测出1H和9F的NMR谱，不适于采用梯度洗脱方式的HPLC。 2停流模式( stopped – flow mode): NMR通过不同的方式对样品中各组分进行单个的、较长时间的扫描。与在流模式相比有以下优点: a、对样品扫描时间长，得到的谱图精度高，结构信息较多; b、对于含量较少的成分可通过NMR 累加扫描得到结构信息，从而得到较高的灵敏度; c、可作COSY等二维谱，得到一维谱不易获得的结构信息。 HPLC-NMR局限:1.灵敏度低;2.HPLC使用氘代溶剂昂贵;3.溶剂信号对样品信号的干扰 趋势:NMR仪磁场强度的增高,灵敏度和化学位移的分辨率有很大提高以及溶剂峰抑制技术的发展,使得对氘代试剂的依赖性变小,使该技术用于生物样品的分离、检测成为可能。 四、色谱-质谱联用 1、GC-MS 主要的技术问题:1仪器接口:如何使GC的大气压工作条件和质谱的高真空条件相匹配。接口作用有:a.尽可能多地除去GC流出物中的载气 b.保留或浓缩待测物 c.将大气压下气流转化为粗真空d.协调色谱仪和质谱仪的工作流量。 2扫描速度:GC出峰快而窄，要求质谱能在短时间内完成多次全范围的质量扫描并能很快在不同的质量数之间切换。 定量分析两种途径:1、GC常规法:适用于色谱图中能够分开且含量较高的组分 2、MS的选择离子监测(SIM):适用于低浓度或色谱图上分不开组分 SIM特点:1灵敏度高:对少数特征离子的检测，提高了离子的有效接收率。 2特异性高:色谱图上分不开，可通过各自选择特征离子，在SIM图谱上分开。 2、LC-MS 特点:集LC的高分离能力与MS高灵敏度、高专属性于一体。是体内药分核心技术。 接口作用:1将洗脱剂及样品分子气化 2除去大量洗脱机分子 3完成对样品分子的离解 正离子模式:适用于碱性样品，用甲酸或乙酸对样品进行酸化，使PHPKa+ 2。 若样品含较多强负电性基团，如Cl,Br,-OH,时使用负离子模式。若酸碱性不明则要经过预试。 质量分析器分类:扇形磁场质谱仪，四级杆质谱仪、飞行时间质谱仪、离子阱质谱仪常用 四级杆质谱仪特点:1较低真空度下工作 2扫描速度快，有利于联用 3分辨率低 4质量歧视效应:m/z小于100时灵敏度高，在250~400时与扇形磁场质谱仪相当，在大于400时没有扇形磁场质谱仪高。 四极杆质量分析器——扫描类型:2种 - 8 - 1.全扫描(full scan，SCAN):在给定的时间内不间断地对设定荷质比范围内所有离子进行扫描。用于测定未知化合物中各组分的分子量及质谱图。 2.选择离子监测(selected ion monitoring，SIM):选择性地扫描某几个选定荷质比所对应的所有离子。用于目标化合物的检测和快速筛选目标化合物 飞行时间质谱仪:灵敏度最高，适用于微量样品分析。基质辅助激光解析质谱(MALDI-TOF-MS)是蛋白质组应用的最佳仪器。 柱后修饰:可是ESI-MS响应改善，柱后修饰的作用有: 1调节PH值以优化正或负离子检测;2添加异丙醇以利于水溶剂的去溶剂化和稀释缓冲盐以达到质谱正 +常工作可接受的程度;3添加乙酸钠以使缺乏或只有弱质子化位点的样品阳离子化(M+Na);4用TFX Fix改善灵敏度;5增加流速以达到稳定喷雾;6柱后分流，降低流速;7柱后衍生化，提高质谱响应。 系统背景的消除:LC-MS的系统背景远大于GC-MS，产生于大量的溶剂及其所含杂质直接进入离子化室造成的化学噪声及在高电场中的复杂行为所产生的电噪声，常会淹没信号。 纯化:LLE、SPE 3系统清洗 4氮气纯度 着手点:1有机溶剂和水 2样品 LC-MS中内标的选择原则:一个合适的内标物应在任何过程中都与待测物具有相同行为。 1.结构相似，化学性质相似，官能团一致。2样品中不存在，非内源性物质或非食物中所含物质。3在样品预处理的任何过程都与待测物行为一致。4与待测物色谱峰完全分开并具有相似的色谱保留。5在检测器上与待测物有相似的检测响应。6稳定性好，具较高纯度。 内标物作用:每步操作都有损失，用内标来校正误差。 五、手性色谱法 分类:1.直接法:引入手性识别或手性环境(手性固定相、手性流动相添加剂)至色谱系统，形成暂时对映体复合物，从而使药物对映体分离，分手性固定相法和手性流动相法。 2.间接法:又称手性试剂衍生化法，是药物对映体在分离前，先与高光学纯度衍生化试剂 (CDA)反应形成非对映体，再进行色谱分离测定。 专题四:体内药分方法设计与评价 一、分析方法的设计依据: 1待测物理化性质及体内存在状况:PKa,亲脂性，溶解性，分配系数，血浆蛋白结合率等。 2分析目的与要求:不必强调方法简便快速而要考虑整个测定范围内样品浓度变化较大。 二、分析方法建立的一般步骤: 1方法的选择:由生物样品中药物浓度决定 2方法的建立: a.检测条件筛选 b.分离条件筛选(空白溶剂试验，空白生物基质试验,模拟生物样品试验，试剂生物样品测试) - 9 - 三、分析方法验证内容与要求 1.特异性:又称专属性，指当有内源性物质存在时，方法准确测待测物的能力。通常表示所检测的信号(响应)应属于待测药物或特定的活性代谢产物所特有的。 内容:考察来自6个不同个体的空白生物基质，必须证明所测定物质是受试药品的原形药物或特定活性代谢物，样品中所含内源性物质或其他代谢物及其他药物不得干扰测定。 2

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曲线和定量范围: 使用与待测样品相同的生物介质，至少6个浓度建立标准曲线，浓度设计先等比再等差。定量范围要能覆盖全部待测的生物样品的浓度范围，不得外推法求算未知样品浓度。标曲各点的实测值与标示值之间的偏差范围一般规定为最低浓度点?20%以内，其余点?15%以内。标曲的最高浓度点一般选择Cmax的2~3倍。用加权的最小二乘法回归，要求r>0.99。 3定量下限(LLOQ): 表示待测样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。应满足测定3~5个半衰期时的浓度测定或为Cmax的1/20~1/10。 4精密度与准确度: 精密度:每一次测定结果与多次测定结果平均值的偏离程度，表示该方法的重复性。 准确度(绝对回收率):用该法测得的生物样品中的待测药物与真实浓度的接近程度。 内容:选取高，中，低三个浓度的质控样品同时进行精密度和准确度考察。低浓度在LLOQ的三倍以内，高浓度点接近标曲上限，中间选一个浓度。批内精密度每一浓度至少测5个样品。批间精密度应至少在不同天连续测定3个合格的而分析批，至少45个样品。一般RSD<15%,LLOQ附近<20%.准确度一般应85%~115%，LLOQ附近80~120%。 5样品稳定性: 考察室温(1~10h),反复冻融(至少3次，每次时间至少24h,12h,12h),长期冰冻条件下。还应考察储备液稳定性，样品处理后溶液中的稳定性及样品在自动进样器中的稳定性。 6提取回收率(相对回收率): 考察高，中，低3个浓度的提取回收率。高中低三浓度的回收率差别不能太大。注意三个浓度点的选择与标曲所选择的浓度不一样。1.低浓度点要小于3倍LLOQ。2.中浓度不是标曲的中间点，一般选绝大多数样品的浓度。3高浓度选择小于标曲最高浓度点的85%~90%。 7质控样品: 高，中，低3种浓度QC样品应以从高到低或从低到高的顺序以一定间隔均匀的穿插于整个分析批，与生物样品同时测定，并用随行标曲进行计算。每个分析批至少穿插5%质控样品(但至少6个指控样品)。质控样品测定结果的偏差一般小于15%，低浓度点<20%，最多允许1/3的质控样品结果超过上述限度，但不能出现在同一浓度中。 - 10 - 8若使用LC-MS，应做介质效用(详见以下专题) 专题五:代谢物的分离与结构鉴定 一、体内代谢的一般规律:药物的代谢一般分为两相:不可分割，一相为二相做准备 一相代谢或称生物转化:在药物的分子上引入新的基团或除去原有的小基团的官能团反应，生成可与二相反应的官能团:-OH,-COOH,-NH2,-SH等。是药物在体内代谢转化的关键性步骤，也是药物从体内消除的限速步骤，一相代谢主要包括的反应类型有氧化，还原和水解。 羟化反应 环氧化反应 脱烷基取代 去氨基化反 氧化反应 应 N-,C-,S-氧化 去卤素反应 醇的氧化 醛的氧化 硝基还原 偶氮还原 还原反应 醛的还原 水解反应 酯类的水解 酰胺类的水解 二相代谢或称结合反应:药物与一些内源性的物质(如葡萄糖醛酸、甘氨酸、硫酸等)结合或经甲基化、乙酰化后排出体外。生成的结合物极性增加，水溶性增强，加速药物从体内的排泄。?相代谢反应主要为结合反应，是药物排出体内的主要形式。 结合类型 酶 功能基团 葡萄糖醛酸结合 UDP-葡萄糖醛酸转移酶 -OH,-COOH,-NH2,-SH 硫酸化反应 硫酸转移酶 -NH2,-SO2NH2,-OH 甲基化反应 甲基转移酶 -OH,-NH2 乙酰化反应 乙酰基转移酶 -NH2,-SO2NH2,-OH,-COOH 氨基酸结合反应 -COOH 谷胱甘肽结合反应 谷胱甘肽-S-转移酶 环氧化物，有机卤化物 脂肪酸结合反应 -OH 缩合反应 各种功能基团 P450酶的生物学特性:1.P450酶是一个多功能的酶系.2.P450酶对底物的结构特异性3.P450酶存在有明显的种属、性别和年龄的差异.4.P450酶具有多型性和多态性.5.P450酶具有可诱导和可抑制性. 药物肝外代谢的主要部位:肠代谢，肾代谢，肺代谢，脑代谢，其他组织中代谢 影响药物代谢的因素:代谢相互作用，给药途径，给药剂量和剂型，病理状态，生理因素(种属，年龄，性别)，遗传变异性，药物的光学异构特性 体内药物代谢研究意义:1.了解药物体内过程预测体内代谢特征 2.研究体内药物相互作用机制 3.从代谢产物中发现寻找新药 4.研究药物体内代谢的立体选择性 - 11 - 二、制备代谢物的生物转化方法:体内方法和体外方法 1.体内方法:动物或人给予一定的剂量后，于不同时间段分别收集胆汁，尿液和粪便，然后采用HPLC、LC-MS和LC-MS/MS等方法从胆汁、尿液和粪便中寻找体内的代谢物，并对代谢产物进行初步的分析和鉴定，最终确定药物在体内的代谢途径。 优点:真实一致、可获重要的药动学参数 缺点:无法大规模筛选，价格高昂，费时费力 2.体外方法:采用体外肝代谢模型，干净，易鉴别，易分离。一般先做体外，在做体内验证 优点:排除体内干扰、便捷、经济，可高通量筛选 缺点:与体内代谢情况不完全一致 药物代谢的体内研究与体外研究是相辅相成的，因根据具体研究目的选择不同的研究方法 常用的体外方法:1. 肝微粒体体外温孵法2. 肝细胞体外温孵法3. 肝组织切片法4. 离体肝灌流法5. 肝匀浆法6. 重组P450酶体外温孵法7. 肠道菌群体外温孵法 1.肝微粒体体外温孵法:用制备的肝微粒体辅以氧化还原辅酶(NADPH再生系统)，在模拟生理条件下进行代谢反应，经一段反应时间后，采用HPLC、LC-MS和LC-MS/MS等方法对待测物进行初步分析和鉴定。 优点:耗时少 ,重现性好 ,易大量操作。适用于酶活性及体外代谢清除等方面的研究 缺点:需要的原材料较多 ,且与体内情况的一致性方面存在不足 肝微粒体的主要应用:1测定CYP450酶活性 ;2考察药物对肝药酶活性的影响; 3进行药物体外代谢途径研究;4考察手性药物的代谢立体选择性 2.肝细胞体外温孵法:与1相似，关键在用胶原酶灌注技术和制备肝细胞。适于研究蛋白及mRNA水平药物代谢酶诱导及酶活性，广泛用于评估药物相互作用。 优点:保存完整的氧化和结合酶、细胞膜结构适合于毒理和种属间代谢差异研究 缺点:肝细胞仅能存活4h左右，不利于贮存和反复研究、制备方法复杂 3.肝组织切片法:介于器官与细胞水平之间的实验手段，不需要胶原酶，切片技术相对简单，且能保持正常组织结构，与在体代谢模式很接近。此法可通过对中间及终代谢产物作定性定量分析，对代谢酶活性进行测定，或进行药物代谢动力学研究，获得体外实验数据，为药物的体内情况提供参考。 4.离体肝灌流法:在麻醉状态下用外科手术使肝脏形成体外循环。用含有低分子量葡聚糖并用O2和CO2和的Krebs-Henseleit溶液代替血液，以恒速进行灌流，使肝脏能在一段时间内维持其正常生理生化功能。 优点:最接近体内状态、可多次采样分析、可了解肝细胞损伤情况、可严格控制进入肝脏化学物的量 缺点:手术操作，试验设备要求比较高 5.肠道菌群体外温孵法:目前应用最广泛的体外肠道代谢研究方法，待厌氧菌达到代谢要求时，加入药物共孵育，一定时间后检测原型药物和可能的代谢物要其种类和数量。主要用于中药代谢物的研究。 - 12 - 6.基因重组P450酶系温孵法:利用基因

工程

路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理

及细胞工程，将调控P450酶系表达的基因整合到大肠杆菌或昆虫细胞，经细胞培养，表达高水平的P450酶系，纯化后可获得较纯的单一P450同工酶。在明确某些药物经特定酶代谢后，即以此酶进行单一代谢，更准确地观察代谢结果，避免受其他酶共同参与此代谢途径的干扰。 特点:可以运用纯度较高的单一的P450同工酶进行药物的体外代谢研究，通过比较基因重组的人和实验动物肝脏P450酶对药物的代谢情况，了解药物代谢的种属特异性。 三、代谢物的识别与结构鉴定 1联用技术: LC-MS、 LC-MS/MS，GC-MS、 GC-MS/MS、 LC-NMR 2.放射性示踪: HPLC-RD(放射性检测器)事先标记药物再给药 检出的峰每个都是代谢物 专题六:对药物代谢酶活性的影响的评价 诱导剂:苯巴比妥 、苯妥英钠、利福平等 结果:加速其自身及其它药物的代谢，减弱药效 抑制剂:氯丙嗪 、异烟肼、氯霉素等 结果:抑制其自身及其它药物的代谢，产生不良反应 CYP450酶诱导的机制: 1. 乙醇介导诱导型:稳定酶蛋白 2. 核受体介导诱导型:通过影响转录和翻译过程增加酶蛋白的表达量 肝药酶抑制的机制: 1.可逆性抑制:酶与抑制剂可逆结合，非共价键结合形成复合物 2.不可逆抑制:酶与抑制剂不可逆结合，共价键形成紧密的复合物 3.自杀性抑制:药物或其代谢物将酶灭火 评价药物对CYP450酶诱导或抑制的方法:体内试验和体外试验 利用药物体外代谢各种模型筛选: 原理:用特定亚型的CYP450酶的特异性底物作为探针，来测定在体外待测药物对该底物代谢的影响。 检测方法:1.色谱检测技术:液-质联用 2.放射性检测技术:底物用H3和C14标记 3.荧光检测技术:酶的底物经代谢后产生具有荧光性质的代谢产物 4.生物发光检测技术 酶诱导与抑制研究的意义:1.药物研发阶段: 研究药物相互作用，减少上市后被淘汰的风险。 2.上市后:指导临床合理用药。 特别专题:LC-MS中常见问题与对策 一、选择哪一种离子源, 1.电喷雾离子化(ESI): - 13 - 原理:通过电场使雾滴带电，然后通过离子蒸发等机制生成气相离子，再送入MS的过程。将离子由液相转至气相为强吸热过程，能量大于C-C键断裂能。但ESI可在相对低温下，逐步去溶剂化，是最软的质谱离子化方式。 ESI实质:在强电场影响下对高电带电液滴进行精细雾化。 三个步骤:1.雾滴形成过程;2.雾滴变小过程;3.气相离子形成过程。 2.大气压化学离子化(APCI) 原理:大气压条件下采用电晕放电使流动相离子化，然后流动相作为气相试剂使样品离子化的技术。离子化可通过质子化或电荷转移，去质子, 电子捕获及形成加合物等方式实现。 3.大气压光离子化(APPI): 原理:待测物在气相中吸收由真空-紫外灯发出的光子后放出电子从而离子化的过程，提高对非极性有机化合物的响应,作为一种新的API技术，是ESI和APCI应用的补充 三种离子化方式的比较:离子化方式不同，适用样品极性，稳定性，分子量不同 ESI:通过喷口与毛细管间高压离子化，适于中、强极性化合物，特别是在溶液中能预先形成离子化合物和可以获得多个质子的大分子，对流动相组成有要求。 APCI:通过电晕针放电离子化，流动相作为化学离子化反应气，适于非极性、中等极性小分子。不适于热不稳定、难于气化的极性和大分子化合物。离子化过程对流动相组成依赖小。 APPI: 通过吸收光子而离子化，适用于有共轭基团的非极性或弱极性物质。介质效应小，对磷酸盐有很好的耐受，较ESI有较小的离子抑制。 如何选择离子源呢,应综合考虑1灵敏度 2介质效应 3选择性 (具体例子见笔记) 二、待测物什么情况下需要采用衍生化, 如何选择合适的衍生化试剂, 有些类型的化合物不适合直接采用LC-MS 进行测定, 或达到灵敏度等要求，需衍生化。 优点:1增强离子化效率;2改变分子碎裂类型;3改善分离效果;4优化色谱行为 。 缺陷:1增加工作量、分析时间;2资源的浪费、错误率增大、信号抑制或低回收率;3生成的立体异构体或副产物干扰分析; 1. 小分子非极性化合物:小分子醛、酮类化合物. 对于这类化合物较难质子化。使用最多的衍生化试剂是硝基苯肼类化合物，通过引入易质子化的含氮基团和能促进雾化的疏水芳香基团来提高离子化效率。 2.小分子极性化合物:极性基团虽够有效促进待测物解离, 但是疏水结构特征对于一个待测物在离子源中的有效雾化也极其重要，并且可以使待测物在常用的反相色谱柱上得到适当保留，因此,往往需要通过衍生化的方法引入一些疏水基团以提高待测成分的离子化效率并且增加色谱保留。 a.氨基酸类:同时具有易质子化的基团(氨基)和易去质子化的基团(羧基), 在离子化过程中易发生反荷离子效应进而导致该类化合物的质谱响应极弱, 甚至没有质谱响应。 对策:通过简单的衍生化反应掩蔽羧基或氨基 - 14 - b.羧酸类:一些结构较小并且极性较大的羧酸，质谱响应和色谱保留行为均不理想。 对策:使用衍生化掩蔽羧基同时引入一些离子化能力较强的基团. c.嘌呤嘧啶拮抗物:极性很强, 且缺乏合适的离子化官能团。 注意:通常存在多个衍生化的反应位点(胺基), 因此在选择衍生化试剂及其反应条件优化时 需要重点考虑反应产物的单一性, 否则将使定量的重现性极差。 常用衍生化试剂:丹酰氯 重氮甲烷 对溴苯甲酰甲基溴 (具体例子见笔记 ) 3.痕量待测物:如激素类药物的检测, 衍生化也可以作为一种提高灵敏度的重要手段。 4. 蛋白质以及多肽: 5. 不稳定化合物:如易氧化化合物 三、如何有效地对体内多组分样品进行同时测定, 问题:当存在两种或多种药物的剂量相差悬殊时, 导致各待测物在生物体液中的浓度相差巨大, 因而符合它们各自药代动力学研究的药物浓度的线性范围也相差甚远。为了提高检测灵敏度通常需要对血浆样品中的待测物进行浓缩富集, 这样所有待测成分的质谱响应均会提高, 但测定的线性范围在某种程度上受限于质谱仪器的种类和性能, 过度的浓缩也可能导致含药浓度高成分的质谱响应产生饱和现象而脱离线性。 要求: 在复方制剂中多种成分的同时定量分析既要兼顾到血药浓度较低成分的定量下限能否满足药代动力学研究的要求, 又要考虑血药浓度过高成分可能产生的质谱响应饱和, 会导致标准曲线高浓度点脱离线性的问题。需要对各个待测物的质谱响应、线性范围和灵敏度三者进行综合考虑. 对策:1采用更高级的仪器，线性范围和灵敏度得以提高，但不实际。 2优化试验条件:改变溶样体积大小， 改变进样量大小等 实例:人血浆中曲马多和对乙酰氨基酚的 LC-MS 同时测定。(见笔记) 四、如何正确地认识并且科学地评价基质效应, 基质效应(Matrix effect, ME):由生物基质引起的待测物质谱响应与浓度之间的非线性问题，破坏了相应的稳定性以及结果的重现性，是LC-MS技术最大的软肋。生物基质中磷脂类化合物是此效应产生的主要来源。 消除方法: (1)改善样品前处理方法，如采用合理的固相萃取方法能够最大程度消除基质效应。 (2)改善色谱条件: 1.调节色谱保留:可使待测物与引起基质效应的内源性物质分开, 并使大多数内源性基质都在死时间附近被洗脱,不进入质谱系统。 2.改善峰形:良好的色谱峰形可以保证待测物流出色谱柱时尽可能得到富集和浓缩 3.梯度洗脱:增强洗脱力将内源性物质全部洗脱下来，但很费时，是迫不得已的选择。 4.加入添加剂:流动相中加入少量添加剂，如甲酸、醋酸铵，能降低基质带来的背景干扰 - 15 - (3)改变离子化方式, 抗基质干扰能力依次为: APPI,APCI,ESI (4)减小进样量或稀释样品。 (5)用某一物质为基准补偿基质效应以适应多组分分析的需求。 (6)采用同位素内标, 但成本较高, 且不一定完全可靠。 评价方法: 直接比较质谱响应法:5个不同来源的高、中、低浓度的模拟生物样品与流动相为溶剂配成的质谱响应之间的比较，偏差应该在?15%之间。 相对基质效应(Relative ME):判断由基质引起的信号抑制或增强作用是否存在较大变异，应实际上是一种对待测物在不同来源(n?5)生物基质中质谱响应值变异程度的度量, 常用变异系数表示，评价更具现实意义 五、如何正确地认识并且科学地评价残留效应, 残留效应(carry-over effect，COE) :指在高浓度的样品进样分析后, 在进样系统中残留了一定量的待测物, 从而影响了下一次进样时低浓度样品测定结果的准确度。 产生原因:清洗自动进样针的溶剂选择不当、洗针和进样程序设计不合理或者是进样针座吸附了待测物. (50:50)组成的洗针液能有效清除进样针上的残留待测物。但对疏水性极强的化合对策:1.采用甲醇-水 物, 采用更高比例的甲醇能更有效地消除残留效应。 2. 在自动进样器中产生残留的主要部位是进样阀,通过改变进样模式消除。 评价方法:观察连续分析高浓度样品后空白溶剂或空白样品的待测物位处有无信号。若无响应信号，则判为无残留效应。若有信号且大于10%LLOQ的响应，则判断为有残留效应干扰，需改进方法;若小于10%LLOQ的响应，则判断为残留效应可忽略。 六、如何正确处理高通量分析和专属性之间的关系, 高通量 LC-MS 分析有时会导致假阳性结果, 进而降低测定结果的可靠性。 原因1:二相代谢物容易在离子源内发生中性丢失反应形成与母体药物相同的离子, 从而影响对后者的准确定量. 对策:调节色谱保留使其在LC中分开后再进入MS。 原因2:质谱的专属性有时还受到其自身分辨力的限制, 尤其单个离子或是伪离子对检测时 对策:在选择检测离子/离子对时, 不仅要考虑检测对象在质谱中的绝对响应, 还应注意选择受生物基质干扰较少的监测离子或离子对,如一些小分子的中性丢失反应(如脱水反应)就不适合作为监测对象 一、LC-MS常见问题以及解决办法 A何时需要衍生化:a离子化能力差的，让其带上酸、碱性基团;b极性小分子化合物，如氨基酸(分子键作用了强，雾化难以打散);c生物体液中痕量化合物;e蛋白质多肽类的药物分析;环肽类药物用LC-MS方便，直链肽需要衍生化;f不稳定药物 - 16 - B多组分同时测定中的问题:同时测定两种或者多种含量差异悬殊的组分时，为使低浓度组分响应增强，常需将样品浓缩，有时血浆样品被浓缩后，含量高的组分检测响应会明显偏低偏离线性，即ESI/MS响应饱和现象。因此需要对待测物的质谱响应线性范围、灵敏度综合进行考虑，因此在血浆样品制备过程中，经纯化富集后的血浆样品在复溶时，所用的溶解样品的流动相体积需要合理考察，使其既能使血药浓度高的制剂组分的标准曲线线性良好，又能使血药浓度低的组分达到满意的灵敏度。 C专属性误判:在检测过程中可能出现假阳性现象，降低结果的可靠性。因而洗脱不需太快，应避免与代谢物相重叠。 D残留效应:高浓度样品进样后，系统中残留痕量对后继低浓度样品的影响。解决办法:a洗针液的选择，更换洗针液;b观察carry over effect在第几针空白后消除，则高浓度后进相应次数的空白溶剂或空白生物基质;c若仍不能，则选择其他监测离子 E基质效应:见下一题 二、何为LC-MS的介质效应,建立生物样品中药物的LC-MS测定方法时如何进行介质效应的考察,其评判标准是什么, 介质效应(ME)是指样品基质中其他成分对待测物响应值的影响。 如何避免:a优化改进样品提取制备方法;b优化色谱条件;c减少进样体积;d根据被测药物离子化机理选择合适的质谱接口，并优化质谱分析条件;e选择合适的内标 如何考察:标准曲线法:本法需配制2组不同的标准曲线，每组包括5条标准曲线。第1组用流动相配制，制成含系列浓度待测组分的标准曲线。第2组标准曲线是将5种不同来源的空白生物样品(如:血浆)经提取后分别加入与第1组相同系列浓度的待测组分后制得。通过比较两组标准曲线的斜率，可以确定基质效应对定量的影响。分别求得第1组和第2组标准曲线斜率的平均值:S1和S2。 ME,?S1,S2?/S1×100, 若ME?15,，则表示无介质效应或介质效应可以忽略。 ME,S2/ S1×100%，若85%?ME?115,，则表示无介质效应或可以忽略。 三、在体内药物分析方法的建立与评价时应考虑哪些因素,考察哪些指标(内容),这些指标的考察方法和结果的可接受范围是什么? 考虑因素:待测药物的理化性质及体内存在状况，分析测定的目的与要求，生物样品的类型与样品制备方法，实验室条件。 ?特异性:考察来自6个不同个体的空白生物基质，必须证明所测定物质是受试药品的原形药物或特定活性代谢物，生物样品所含内源性物质或其他代谢物及替他药物不得干扰对样品的测定。 ?标准曲线和定量范围:配制标准样品应使用与待测样品相同生物介质，至少用6 个浓度建立标准曲线。定量范围要能覆盖全部待测的生物样品浓度范围，不得用定量范围外推的方法求算未知样品的浓度。标准曲线各浓度点的实测值与标示值之间的偏差可接受范围一般规定为最低浓度点的偏差在?20%以内，其余浓度点的偏差在?15%以内。 ?定量下限:标准曲线上的最低浓度点，表示测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。LLOQ 应能满足测定3,5 个消除半衰期时样品中的药物浓度或能检测出Cmax 的1,10,1,20 时的药物浓度。其准确度应在真实浓度的80%,120%范围内，相对标准差(RSD)应小于20%。 ?精密度与准确度:一般要求选择高、中、低3 个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和准确度考察。低浓度选择在LLOQ 的3 倍以内，高浓度接近于标准曲线的上限，中间选一个浓度。批内精密度，每一浓度至少制备并测定5 个样品。批间精密度应至少在不同天连续制备并测定3 个合格的分析批，至少45 个样品。通常用质控样品的批内和批间RSD 来考察方法的精密度。一般RSD 应小于15,，在 - 17 - LLOQ 附近RSD 应小于20,。准确度一般应85,,115,范围内，在LLOQ 附近应在80,,120,范围内。 ?样品稳定性:根据具体情况，对含药生物样品在室温(1~10h)、反复冻融(至少三次，每次时间至少24h,12h,12h)或长期冰冻条件下进行稳定性考察。还应考察储备液的稳定性以及样品处理后的溶液中分析物的稳定性。 ?提取回收率:应考察高、中、低3 个浓度的提取回收率，其结果应当精密和可重现。 ?质控样品:高、中、低3种浓度，双质控，每个分析批至少插5,质控样品(但至少6个质控样品)。质控样品测定结果的偏差一般应小于15%，低浓度点偏差一般应小于20%，最多允许1/3 的质控样品结果超过上述限度，但不能出现在同一浓度中。 五、固相萃取法中，C18填料比较常用，请说明适用于C18填料SPE法测定的药物类型，并简述使用C18填料SPE法测定时的一般操作步骤以及各步的目的或注意事项。 A使用甲醇润湿小柱，活化填料。目的:使固相表面易于和被分析物发生分子间相互作用，并可除去填料中可能存在的杂质。注意:甲醇含量大于8%，否则将导致回收率降低。 B用水或适当的缓冲液冲洗小柱，转移过多的甲醇。目的:以便样品适当的与固相表面发生作用。注意:但清洗不宜过分，否则会使甲醇含量过低，从而导致湿润度不足，回收率降低。 C加样，使样品经过经过小柱，弃去废液。 D用水或适当的缓冲液冲洗小柱，转移样品中的内源性杂质和其他相关杂质。 E选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱液，挥干溶剂以备后用或直接进行在线分析。 注意:清洗液及洗脱液强度、用量都要适当，否则会导致药物的损失、洗脱选择性下降等，通常选用与水混容的洗脱剂。萃取碱性药物时，由于其残存的硅羟基与药物之间的静电作用，很难用甲醇、乙腈等洗脱，通常加酸、有机胺或氨水、醋酸铵或离子对试剂。 六、简述常见生物样品的种类、特点及其前处理方式, (1) 血液:分为血浆/血清或全血。测定血浆或血清中的药物浓度能较好反映体内药物浓度变化;若专门测定平均分布于血细胞内、外的药物浓度，则用全血;血浆采集应加入抗凝剂，离心,取上清液;血清静置，挑走血饼，离心，去上清液。处理方法有沉淀蛋白法、液液萃取法、固相萃取法。 (2) 尿样:用于药物剂量回收研究、药物尿清除率、生物利用度研究。易收集，但易受生理情况情况影响。方法:酸解或酶解可使药物从缀合物中游离出来。 (3) 唾液:易收集，采集后应立即测定除去泡沫部分的体积，放置后易分层，离心，取上清液。 (4) 组织:为药物的吸收、分布、代谢、排泄等体内过程提供重要信息。组织处理方法:匀浆化法、蛋白沉淀法，酸(碱)水解、酶水解。 (5) 头发:取样方便，无伤害，检样的掺伪可能性低，可测微量元素。头发采集后需洗涤，处理方法有提取法、有机破坏法。 (6) 其他:乳汁、精液。 七、请描述各种生物样品前处理技术的操作方式，适用范围，需要注意的问题及优缺点。 有机破坏法:一般包括湿法破坏、干法破坏及氧瓶燃烧法三种方法，适合于人发样品的破坏。破坏能力强，反应比较激烈。 - 18 - 直接沉淀法:将一定量生物样品加蛋白沉淀剂，涡旋，离心，取上清夜进样。当样品中待测物浓度较高，所用方法的特异性和灵敏度达到检测要求时可以考虑用直接沉淀法来处理样品。注意沉淀剂体积、沉淀剂的选择及对药物稳定性的影响(氧化、对酸不稳定)。直接沉淀法可使结合型的药物释放出来，但缺点在于容易发生乳化现象。 液液萃取法:取一定量生物样品加有机提取溶剂，涡旋，离心，取有机层，氮气吹干，流动相溶样进样。多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度，而血样或尿样中的含有的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质。用液液萃取可除去大部分杂质，从大量的样品中提取药物经浓集后用于分析。注意?水相pH值，?提取溶剂选择，?有机相和水相的体积。优点在于它的选择性，这依赖于有机溶剂的选择;药物能与多数内源性物质分离。缺点在于乳化现象的产生;有机溶剂易挥散、有毒性、对环保不利及不能自动化也是该法的不足之处。 固相萃取法:将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到―吸附‖或―分配‖或―离子交换‖或其它亲和力作用时，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂洗除杂质，再用适当溶剂洗脱药物。注意?流速，?装样量，?缓冲液pH及用量。SPE中萃取剂与样品有很大的接触面，因此可以在短时间内达到有效的萃取，可以采用动态的柱操作，可自动化;可以避免乳化的形成;柱子可弃，无污染。缺点在于价格昂贵，技术要求高，批与批之间有差异，柱子易阻塞，影响分离效果。 膜萃取:将膜看成―两相间的选择性屏障‖，在膜两侧施加一驱动力时，药物就会从一侧(供给相)迁移到另一相(接受相)。供给相的流速对萃取效率有很大的影响。它不仅可以实现样品分离，由于膜材料相当多，还具有很高的选择性，而且易于实现自动化。 八、试述各种色谱-光谱联用技术在药物代谢物结构鉴定(确证)方面各有何特点, (1) HPLC-DAD (2) GC/MS:灵敏度高，分析快，鉴别能力强，可同时完成待测组分的分离和鉴定，适于多组分混合物中未知组分的定性定量分析。对挥发性成分可直接分析;对不挥发性热不稳定的物质，可做成适宜的挥发性衍生物再分析。 (3) LC/MS:可获得复杂混合体中单一成分的质谱图，有利于药物、药物代谢物和内源性化合物的分离和鉴定。药物代谢反应一般在母体药物结构上进行部分结构修饰，据此可对代谢物进行识别，结合其他碎片特征，对结构作合理推断。 (4) LC/NMR:将分离和结构鉴定连为一体，能提供最大量的分子结构信息。在体内药物分析中的应用主要是药物代谢产物的结构与构型研究、药物在体液中的毒性与药代动力学研究以及微生物代谢物研究。 九、试述衍生化技术在体内药物分析中的应用特点, 答:(1) 衍生化GC:极性大、挥发性低，对热不稳定的药物。 目的:使极性药物变成非极性的、易于挥发的药物，使具有被分离的性质;增加药物的稳定性;提高对光学异构体的分离能力。 (2) 衍生化HPLC:对检测器不够敏感或化学不稳定的药物。 目的:提高对样品检测的选择性和灵敏度、改善样品混合物的分离度、适合于进一步做结构鉴定。 (3) 衍生化LC-MS: a提高响应值，通过将易检测基团加到不检测的被测物上，增加离子化效率提高检测器的响应值;b易于结构鉴定，通过衍生化改变碰撞离子的裂解形式，得到更明确或不同的结构信息 十、请简述竞争性毛细管电泳免疫分析方法的原理。 - 19 - 当待测物为抗原(Ag)时，抗体(Ab)的量是有限制的，将待测物，标记抗原(有限量)和抗体(有限量)混合，标记抗原和待测物就会竞争与抗体结合，反应为:Ag+Ag(标记)+Ab=Ab-Ag+Ab-Ag(标记)+Ag+Ag(标记)。检测时混合物产生两个峰，分别是Ag(标记)，和Ab-Ag(标记)，样品中Ag越多则游离的Ag(标记)越多，形成的Ab-Ag(标记)越少。采用一定的方法将游离抗原和抗原-抗体复合物分离，测定Ab-Ag(标记)强度，即可知道待测的浓度 十一、在体内药物分析中，常用内标法来实现定量，若现有一药物待测，需要寻找一个内标，请简述其内标的选择原则。 理想的内标化合物应与待测组分在样品制备、色谱分离和质谱检测的全过程中具有相似的行为并且对待测组分的提取、测定无任何干扰。在样品制备过程中，内标应能追踪待测组分，以校正待测物在移液、吹干、复溶等过程中的损失。在色谱分离和质谱检测过程中，内标应与待测组分的色谱和质谱行为相似，以校正待测组分由于基质效应影响所引起的响应信号的改变。 选择原则:A 与待测物仅差一个元素 B 与待测物为同系物 C 与待测物结构相似，化学性质相似 十二、比较LC-MS仪中的ESI和APCI两种离子化方式的工作原理及适用范围。 APCI工作原理是在大气压条件下采用电晕放电方式使流动相离子化，然后流动相作为化学离子化反应气使样品离子化。样品分子的离子化通过质子化或电荷转移来实现，还可以通过去质子，电子捕获及形成加和物的方式来实现。 ESI工作原理是样品溶液通过毛细管导入大气压电离源内，在气化气的帮助下和源内毛细管终端与反电极之间强电场的作用下，样品溶液形成带电荷的雾，即电喷雾。这些雾滴在热氮气流下蒸发，半径逐渐缩小，雾滴表面的电场不断增强到某一临界点时发生离子的场发射，或溶剂完全蒸发。生成的样品气相离子经质量分析器分析，测得它们的质荷比。 APCI适合于挥发性的热稳定性药物，适合非极性、中等极性的药物，适合于小分子药物的分析。 ESI适合于热不稳定性药物，适合于极性、中等极性的药物，可用于大分子药物、蛋白质、多肽的分子。 十三、试述现在液质联用仪中主要有哪几种扫描方式，特点如何，在体内药分中有何应用, 四极杆质量分析器扫描方式: 全扫描(full scan，SCAN)在给定的时间内不断地对设定荷质比(m/z)范围内所有离子进行扫描。应用:未知化合物的定性分析，测定未知混合物中各组分的分子量和质谱图。进行SIM之前，用SCAN确定扫描的目标离子及其最佳电离参数。 选择离子监测(selected ion monitoring，SIM)在给定的时间内选择性的扫描某一个或几个选定荷质比的离子，得到的不是化合物全谱。 应用:定量分析用于目标化合物的检测和在数量众多的样品中快速帅选目标化合物。优点:扫描更低的检测限，更快的速度，更好的灵敏度，更短的分析时间，适于定量。缺点:不适于定性。专属性差，可能是假阳性。故检测离子的选择很重要。 三级四极杆质量分析器扫描方式:1 SCAN和SIM 2产物离子扫描 3前体离子扫描 4中性丢失扫描(NLS) 5选择反应检测(SRM) 应用:定量分析，优点:比单级杆的SIM方式有更高的专属性(经历了两次选择)和抗干扰能力，信噪比更高，更低的检测限。 离子阱质量分析器扫描方式:全扫描，扫描离子监测，多级质谱扫描(获得结构信息的手段之一) - 20 - 十四、生物样品预处理的目的 A使药物从缀合物及结合物中释放出来，以测定药物的总浓度 B生物样品介质组成复杂，干扰多，而药物组分是微量的，必须先经预处理，使纯化富集 C为了适应符合测定方法所要求的灵敏度 D为了防止分析仪器的污染、劣化，提高检测灵敏度、准确度、精密度和选择性等 十五、不稳定药物的样品前处理 A易被酶水解的药物，如蛋白质多肽类:蛋白变性、酶抑制，如重金属离子、EDTA等 B易氧化的药物:加入抗氧剂，如VC、l-半胱氨酸;衍生化 C易水解的药物:选择适当的溶剂;调节PH D对光不稳定的药物，避光操作 十六、药时曲线中的双峰现象 A服药后3-4h出现，双峰多与肝肠循环有关 B服药后7-9h出现，与大肠吸收有关，是分段吸收或是胆汁中代谢物在大肠中降解后吸收 十七、药物组织分布 药物在脏器的贮存情况可为药物的吸收、分布、代谢、排泄等体内过程提供重要信息，常常需要采集肝肾肺胃脑等脏器以及其他组织进行药物检测。这些检材在测定之前，首先将检材均匀化，制成水基质溶液，然后再用适当方法萃取药物。组织处理方法: 1.匀浆化法:组织检材中加入一定量的水或缓冲液，在刀片式匀浆机中匀浆，使被测药物溶解，取上清液。该法最简单，但对大多数药物和毒物回收率低。 2.沉淀蛋白法:在组织匀浆中加入蛋白沉淀剂，沉淀蛋白质后去上清液。该法操作简单,但对有些药物和毒物回收率低。 组织匀浆化加水混匀后取上清液和组织匀浆化加蛋白沉淀剂混匀后取上清液是两种操作极为相似的简便快速方法。加蛋白沉淀剂所得上清液清澈透明，萃取后制得供试液杂质较少，因此常被采用. 3.酸水解或碱水解:组织匀浆中加入一定量酸或碱，置水浴中加热，待组织液化后，过滤或离心，取上清液。.酸或碱水解分别适合在热酸或热碱条件下稳定的少数药物和毒物。 4.酶水解:组织匀浆中加入一定量酶和缓冲液，置水浴上水解一段时间，待组织液化后，过滤或离心，取上清液。 最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。酶解法操作简便。优点:可避免某些药物在酸及高温下降解;对与蛋白质结合紧密的药物可显著改善回收率’可用有机溶剂直接提取酶解液而无乳化现象生成;当采用hplc检测时，无需进行过多净化操作。缺点:不适合碱性下易水解的药物。 - 21 -