嗅鞘细胞条件培养液和星形胶质细胞条件培养液对受损海马神经元保护作用的对比研究

嗅鞘细胞条件培养液和星形胶质细胞条件培养液对受损海马神经元保护作用的对比研究 嗅鞘细胞条件培养液和星形胶质细胞条件培养液对受损海马神经元保护作用的对比 研究 神经损伤与功能重建?2010年9月?第5卷?第5期 [DOll10.3870/sjsscj.2010.05.003 325 ? 论着? 嗅鞘细胞条件培养液和星形胶质细胞条件培养液 对受损海马神经元保护作用的对比研究 张华军,徐格林 1.南京大学医学院附属鼓楼医院中西医结 医院神经内科,南京210002 ? 刘新峰# 合科,南京210008;2.南京军区南京总 【摘要】目的:观察嗅鞘细胞条件培养液(OECCM)和星形胶质细胞条件培养液(ACM)对受 损海马神经元的保护作用.方法:分别采用2种胶质细胞条件培养液预处理受损海马神经元(谷氨 酸诱导损伤),对比其对受损海马神经元活力,凋亡率和胞浆内游离钙离子浓度的影响.结果:与谷 氨酸组相比,OECCM组神经元活力明显增高(P<0.01),ACM组神经元活力增高(P<O.05);与 OECCM组相比,ACM组神经元活力降低(P%0.05).与谷氨酸组相比,ACM组神经元凋亡率和 胞内游离钙浓度降低(P<O.05),OECCM组明显降低(P<0.01);OECCM组神经 元凋亡率和胞 内游离钙浓度低于ACM组(P%0.05).结论:OECCM和ACM均可明显提高受损海 马神经元活 力,降低凋亡率和胞浆内游离钙离子浓度,OECCM的保护作用优于ACM. 【关键词】嗅鞘细胞;星形胶质细胞;条件培养液;神经保护 【中图分类号】R741;R741.02【文献标识码】A【文章编号】1001117X(2010)05 —032505 AComparativeStudyofNeuroprotecti0nEffectsofOlfactoryEnsheathingCellsConditionedMedium andAstrocytesConditionedMediumonHippocampaiNeuronalInjuryZHANGHua—Hn ?,XU Ge—lin,LIUXin— feng.'DepartmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMeaicine. NanjingDrumTowerHospital,Nanjing210008,China [Abstract]Objective:Toevaluatetheneuroprotectioneffectsofolfactoryensheathingce11s conditionedmediumfOECCM)andastrocytesconditionedmedium(ACM)oninjuredhippocam— palneurons.Methods:HippocampalneuronswhichwereindividuallypretreatedbyACMor OECCMhavebeeninjuredbyglutamate.Neuronalviability,apoptosisrateandintracellu1arfree calciumconcentrationhavebeenmeasured.Results:Comparedwiththatintheglutamategroup, theneuronalviabilityofneuronspretreatedeitherbyOECCMorbyACM,waSincreasedandthe apoptosisrateandintracellularfreecalciumconcentrationwerereduced.However,theneuronvi— abilityinOECCMgroupwashigherthanthatinACMgroupandtheapoptosisrateandintrace1 lularfreecalciumconcentrationwere1owerthanthatinACMgroup.Conclusion:OECCMand ACMpretreatmentcouldremarkablyincreasetheviabilityandredUcetheapoptosisrateandt he intracellularfreecalciumconcentrationofinjuredhippocampalneuronsandOECCMcould Dr.vide amorepromisingconditionforneurons. [Keywords]olfactoryensheathingcells;astrocytes;conditionedmedium;neuroprotection 神经元是中枢神经系统(centralnetvous作为另一种细胞类型,在神经元的生长发育 system,CNS)基本结构单位,神经胶质细胞和修复过程中发挥重要作用.星形胶质细胞 【收稿日期】2OlOO322 【通讯作者】刘新峰,Tel:8625—80860454,E—mail:xfliu2@y hoo.coin.cn. (astrocytes,ACs)是哺乳动物CNS内分布最 广泛的胶质细胞之一,主要功能是为神经元 326 促进神经元生长,发育 提供营养和能量物质, 和修复.ACs可通过分泌可溶性因子介导 神经保护功能__l. 嗅鞘细胞(olfactoryensheathingcells, OECs)是存在于嗅觉系统的特殊类型胶质细 胞,可促进成年哺乳动物嗅感觉神经元不断 更新,促进多种CNS神经元存活和轴突生 长l_4].OECs这些功能部分源于OECs分 泌的多种营养物质_7]. 本研究分别采用嗅鞘细胞条件培养液 (olfactoryensheathingcellsconditionedme— dium,OECCM)和星形胶质细胞条件培养液 (astrocytesconditionedmedium,ACM)预处 理受损的海马神经元,对比2种条件培养液 对受损海马神经元活力,凋亡率和胞浆内游 离钙离子浓度的影响,旨在从胶质细胞分泌 的角度研究嗅鞘细胞和星形胶质细胞对受损 海马神经元的保护作用. 1材料与方法 1.1材料?动物:成年SD大鼠80只,雌 雄不限,体质量180,220g,出生24h内的 SD大鼠80只,雌雄不限,由南京军区总院实 验动物中心提供.?主要试剂与材料: DMEM/F12培养基,胎牛血清,Neurobasal 培养基,50×B27添加剂(购于Gibco公司); 四氮甲唑蓝(MTT),神经元特异性烯醇化酶 (neuronspecificenolase,NSE),4,6一联脒一2一 苯基吲哚(4,6一Diamidino一2一Phenylindole, DAPI)和Fluo一3/AM(购于Sigma公司);磷 脂结合蛋白AnnexinV—FITC/PI凋亡试剂 盒(购于Biovision公司);胶质纤维酸性蛋白 (gliafibrillaryacidicprotein,GFAP)(购于 Chemicon公司);截留分子量为5KD的超滤 离心管(购于Millipore公司);兔抗神经生长 因子低亲和力受体(1owaffinitynerve growthfactorreceptor,p75NTR)抗体(购于 Abcam公司). 1.2方法 1.2.1嗅鞘细胞培养与鉴定成年健康SD 大鼠,常规消毒,无菌环境下迅速完整取出双 侧嗅球,解剖显微镜下轻轻剥去嗅球外包被 的血管膜,分离出外2层(嗅神经层及颗粒 层)置于冰浴解剖液中,剪碎组织块,加入胰 酶消化.加入等体积的含胎牛血清的 DMEM/F12培养基终止消化,轻轻吹打,制 成细胞悬液,按细胞密度为1×10./mL接种 于无菌培养瓶中,移人37^C,5CO.培养箱 中培养.差速贴壁法l_l..纯化嗅鞘细胞,培养 10d,经p75NTR和DAPI免疫细胞化学双 染,鉴定嗅鞘细胞纯度. 1.2.2海马星形胶质细胞培养与鉴定取 成年健康SD大鼠,参照Iin等?2的方法培养 星形胶质细胞10d,经GFAP和DAPI免疫 细胞化学双染鉴定星形胶质细胞纯度. 1.2.3海马神经元的培养和谷氨酸损伤模 型制作取出生24h内的SD大鼠,参照 Brewer等l11]的方法,采用海马专用无血清培 养基(添加B27的Neurobasal培养基)培养 取培养7d的细胞,经NSE和 海马神经元, DAPI免疫细胞化学双染鉴定神经元.根据 本课题组预试验结果,选取0.5mM的谷氨 酸浓度制作神经元损伤模型. 1.2.4ACM和OECCM的收集和浓缩 ACM和OECCM的收集均取自生长状态良 好,培养第10天的嗅鞘细胞和星形胶质细 胞,按照1×10/mL重新接种细胞,经12h 细胞贴壁后,Hanks液清洗2次,加入添加 B27的Neurobasal培养基3mI培养48h, 收集上清液,一80?保存.收集完毕后,统 一 采用超滤离心管,低温离心,浓缩OECCM 和ACM,一80.C保存.' 1.2.5分组?正常组:培养第8天的海马 神经元经Hanks液清洗2次后,换为海马专 用无血清培养基培养24h.?谷氨酸组:培 养第8天的海马神经元用终浓度为0.5mM 的谷氨酸作用0.5h后,换为海马专用无血 清培养基培养23.5h.?OECCM组:培养 第7.5天的海马神经元用OECCM预先孵育 12h,加人终浓度为0.5mM的谷氨酸作用 0.5h,Hanks液清洗2次,换为海马专用无 血清培养基培养23.5h.?ACM组:培养 神经损伤q-功能重建?2010年9月?第5卷?第5期 第7.5天的海马神经元用ACM预先孵育 12h,加入终浓度为0.5mM的谷氨酸作用 0.5h,Hanks液清洗2次,换为海马专用无 血清培养基培养23.5h. 1.2.6海马神经元活力检测预先接种在 每孑L 96孑L板中的海马神经元,经以上干预后,加入MTT溶液20I,37|C继续孵育4h,弃 孑L内培养液,每孔加DMSO150L,震荡 10min,上酶标仪,选择490/1//'1波长测各孔 OD值.每组取5个样本,重复检测3次.检 测得到的oD值与细胞活力呈正相关. 1.2.7Annexin—V/PI双染流式细胞仪检测 凋亡率消化以上各组海马神经元,调整细 胞密度到1×10./mI,移人无菌离心管中, 1500rpm离心5min,弃上清;用0.01MPBS 1mL洗涤离心,弃上清;再次加入500肚L缓 冲液,振荡后,加入Annexin—V和P1溶液各 2L,避光,孵育10min,上流式细胞仪检测. 每组取5个样本,重复检测3次. 1.2.8神经元胞浆内游离钙离子浓度检测 消化各组海马神经元,将细胞密度调整到 1×10./mL,移入无菌离心管中,1500rpm 离心5min,弃上清;加入含钙镁的PBS液和 终浓度为5mmol/L的Fluo一3/AM,避光 37.C,5CO2孵育30min,洗涤离心,弃上 清;再次加入含钙镁的PBS缓冲液500肚I 振荡后,上机检测.另设2组细胞悬液,1组 加入荧光淬灭剂MnCL,检测结果为Fmin; 1组加入CaCI检测结果为Fmax.按下列 公式计算细胞内游离钙离子浓度:Eta+].一 Kd×l(F—Fmin)/(Fmax—F)l.Kd一 450nmol/I,为Fluo-3与Ca+的解离常数, 以nmol/I为单位表示.每组取5个样本, 重复检测3次~1214]. 1.3统计学处理SPSS软件处理数据,计 量资料以(?s)表示,组问比较采用单因素 方差,两两比较采用SNK检验,P< 0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1培养细胞纯度鉴定结果培养的嗅鞘 327 细胞,海马星形胶质细胞及神经元纯度均达 到95%. 2.2海马神经元活力测定结果与正常组 相比,OECCM组神经元活力降低(P< 0.05),谷氨酸组,ACM组神经元活力均明 显降低(P<0.01);与谷氨酸组相比,OEC— CM组神经元活力明显增高(P<0.01), ACM组神经元活力增高(P<0.05);与 OECCM组相比,ACM组神经元活力降低 (P<0.05),见图1. 正常组谷氨酸组OECCM组ACM组 图1不同条件培养液对海马神经元活力的 影响与正常组比较,P<0.05,一P<0.01;与 谷氨酸组比较,?P%0.05,?八P%0.01;与OECCM 组比较,P%0.05 2.3神经元凋亡检测结果与正常组相比, OECCM组神经元的凋亡率升高(P< 0.05),谷氨酸组,ACM组神经元的凋亡率 明显升高(P<0.01);与谷氨酸组相比,AcM 组神经元的凋亡率降低(P<0.05),OECCM 组明显降低(P<0.01);OECCM组神经元 的凋亡率低于ACM组(P<0.05),见表1. 2.4细胞内游离钙离子浓度检测结果与 正常组相比,OECCM组神经元的胞内游离 钙离子浓度升高(P<0.05),谷氨酸组,ACM 组神经元的胞内游离钙离子浓度明显升高 (P<0.01);与谷氨酸组相比,ACM组的胞 内游离钙离子浓度降低(P%0.05),OECCM 组神经元的胞内游离钙离子浓度明显降低 (P<0.01);OECCM组神经元的胞内游离 钙浓度低于ACM组(P<0.05),见表1. 8765432,0? ooS嚣.L苫 328 表1不同条件培养液对海马神经元的凋亡率 和胞内游离钙离子浓度的影响(?s) 与正常组比较,0P<0.05,0P<0.01;与谷氨酸组比 较,.P<0.05,0P<0.01;与OECCM组比较,P<0.05 3讨论 神经元的生长发育受各种因子调节,多 种神经营养因子对受损神经元起保护作用, 如神经生长因子(nervegrowth{actor, NGF),脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic{actor,BDNF),胰岛素样生长 因子等.尽管胶质细胞条件培养液中成分不 十分明确,但研究发现胶质细胞分泌的可溶 性因子介导神经保护作用.作为2种不同的 胶质细胞,研究证实嗅鞘细胞和星形胶质细 胞均通过分泌方式发挥神经保护作用. 本研究通过对细胞活力,神经元凋亡率 和细胞内游离钙离子浓度的研究发现:2种 胶质细胞培养液中存在活性成分,可以减轻 谷氨酸对神经元的损伤,延缓其损伤发展,保 护受损神经细胞;与ACM相比,OECCM的 神经保护作用更佳.Feng等l1-l研究发现:6一 羟基多巴胺致PC12细胞的凋亡可被OEC— CM阻断,可能是OECCM通过上调Bcl一2, 下调Bax的通路发挥作用.近期研究发现 OECCM刺激海马神经元的存活,并提高轴 突密度,并发现OECCM作为神经因子的来 源与添加胶质细胞源性神经营养因子和 NGF等有所不同?].以上结果也证实本研 究的结论,即嗅鞘细胞分泌的因子在神经功 能修复和神经重塑方面具有优势. 目前有许多OECCM和ACM神经保护 作用的报道口",但关于嗅鞘细胞和星 形胶质细胞对神经元保护作用的对比研究尚 未见报道,本研究有助于进一步评价不同胶 质细胞通过外分泌产生的神经保护作用.本 研究认为OECCM可能分泌更适合神经元 存活的物质,结合前期的研究发现_2,本课 题组将会进行进一步的研究,以明确ACM 和OECCM中的具体营养成分,以及产生这 种差别的原因.推测ACM和OECCM神经 保护的原因可能通过促进神经元内钙结合蛋 白Calbindin—D28k的表达而拮抗钙超载. Iin等l2的研究发现星形胶质细胞对于缺血 脑细胞的保护作用不仅依赖于星形胶质细胞 释放的各种因子,而且与受损细胞表面受体 的变化相关,如缺血神经元表面的神经营养 因子一3受体增加,缺血星形胶质细胞的胶质 细胞源性神经营养因子受体增加.这些研究 结果也提供新思路,即细胞表面受体的变化 是否也会影响神经保护作用,同时也有助于 进一步开展对胶质细胞的神经保护研究. 【参考文献】 [1]TrendelenburgG,DirnaglU.Neuroprotec— tiveRoleofAstrocytesinCerebra1Ischemia: FocusonIschemiePreconditioning[J].Glia (S0894—1491),2005,50(4):307—320. [2]LinCH,ChengFC,LuYz,eta1.Protec tionofIsehemicBrainCellsIsDependenton Astrocyte—derivedGrowthFactorsandTheir Receptros_J].ExpNeurol(SOO14,4886), 2006,201(1):225—233. [3]ZhuZH,YangR,Fux,eta1.Astrocyte— conditionedMediumProtectingHippocampal NeuronsinPrimaryCulturesAgainstCorti— costerone——inducedDamagesviaPI3——K/Akt SignalPathway[J].BrainRes(S0006— 8993),2006,1114(1):1—1O. F4]JohanssonS,Lee1H,OlsonL,eta1.Olfac— toryEnsheathingGlialCo—graftsImprove FunctionalRecoveryinRatswith6-OHDA Lesions[J].Brain($1460—2156),2005,128 (pt12):2961—2976. Es]PellitteriR,SpatuzzaM,RussoA,eta1. 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