大垫尖翅蝗配子发生过程中c_kit蛋白特异性表达

大垫尖翅蝗配子发生过程中c_kit蛋白特异性表达 大垫尖翅蝗配子发生过程中 c2k it蛋白特异性表达 1 2 2赵卓 ,吕淑敏 ,奚耕思 ( )11吉林师范大学生命科学学院 ,吉林四平 136000; 21陕西师范大学生命科学学院 ( )摘要 :应用免疫组织化学和生物统计分析相结合的方法 ,对大垫尖翅蝗 Epacrom ius coeru lipes Ivan. 配子发生 ( )过程中 c2k it蛋白特异表达特点和动态进行研究 。结果表明 : 1精子发生过程中 ,精原细胞 、初级精母细胞 、次级精 ( )母细胞和成熟精子中均有不同程度的 c2k it蛋白表达 ,精巢末端还有较粗大的阳性颗粒分布 ; 2 卵子发生过程中 , ( )第 1,6阶段卵母细胞中有不同程度的 c2k it蛋白特异性表达 ,但随着卵黄发生的开始逐渐消失 ; 3 滤泡细胞 、输卵 管和受精囊的腺细胞中有 c2k it蛋白颗粒的存在 。 关键词 : 大垫尖翅蝗 ; 配子发生 ; c2k it; 特异性表达 ( ) 文章编号 : 1000 - 7083 200801 - 0065 - 04 中图分类号 : Q969. 26; R392 文献标识码 : A Spec ia l Expre ss ion of c 2k it Pro te in in Gam e togen e s is of E pa c rom iu s coe ru lipes( Ivan. ) 1 2 2ZHAO Zhuo, L Β Shu2m in, X I Geng2si ( 1. Schoo l of L ife Sc ience, J ilin No rm a l U n ive rsity, Sip ing, J ilin P rovince 136000; )21Schoo l of L ife Sc ience, Shaanxi No rm a l U n ive rsity A b stra c t:B y u sing imm unoh istochem istry and b io sta tistic s m e thod s, the sp ec ia l exp re ssion of c2k it p ro te in in gam e togene2 ( ) ( ) sis wa s stud ied th rough rea ring Epacrom ius coeru lipes Ivan. in na tu ra l cond ition s. The re su lts showed tha t: 1 In sp e r2 m a togene sis, the re we re d iffe ren t exp re ssion leve ls of c2k it p ro te in in sp e rm a togon ia, p rim a ry sp e rm a tocyte s, second sp e r2 ( ) m a tocyte s and m a tu re sp e rm s. The b igge st po sitive granu le s we re found a t the end of the sp e rm a ry; 2 In oogene sis, the re we re d iffe ren t exp re ssion leve ls of c2k it p ro te in from the 1 st to 6 th stage of oocyte s, bu t the po sitive granu le s d isapp ea red af2 ( ) te r vite llogene sis; 3 The c2k it po sitive granu le s we re a lso found in fo llicu la r ce lls and the gland ce lls of the oviduc t and sp e rm a thecae. ( ) c2k it; sp ec ia l exp re ssion Key s: Epacrom ius coeru lipes Ivan. ; gam e togene sis; ( ) 作者于 2003 年夏季于吉林省四平地区随机捕大垫 尖翅 蝗 Epacrom ius coeru lipes Ivan. 隶属 直翅目 O rthop te ra 斑翅 蝗 科 O de ipod idae, 在 吉 林 省 捉大垫尖翅蝗健康成虫活体 20 只 ,带回实验室后迅 四平地区发生时间为 7月下旬 ,在 9 月下旬消亡 ,为 速将精巢和卵巢在昆虫生理盐水中取出并立即臵于 [ 1 ] Bou in’s液中 4 ?冰箱固定过 夜 , 石 蜡包 埋 。臵 备 6 该地区的 优势 蝗 虫种 群之 一 。现 有 研 究 资 料 证 μ 明 ,原癌基因 c2k it在生殖细胞增殖 、分化 、减数分裂 m 厚连续切片 。 和细胞 凋 亡 等 过 程 中 起 着 重 要 的 旁 分 泌 调 控 作 112 免疫组织化学方法[ 2,11 ] 用 。 c2k it基因的点突变 ,在雄性可导致不育及 切片常规脱蜡后 ,用 3 %甲醇 2H O 孵育 10 m in 2 2 分化型 A 1 2A 2精原细胞 DNA 合成停止 ,从而导致减 以封闭内源性过氧化物酶 ,将切片浸入 0101 mo l /L ( ) 数分裂时 c2k it蛋白不表达 ,最终引起正常精子发生 枸橼酸盐缓冲液 pH610 ,加热至 95 ?, 10 m in后重 [ 12 ] 受阻和 不 育 。在 雌 性 中 , 会 引 起 卵 泡 发 育 受 损 复 1 次 ,自然冷却后 ,经 5 % B SA 室温封闭 20 m in,甩 伤 ,卵母细胞和卵巢小管发育异常 ,最终引起生殖能 去多余液体不洗 ,采用武汉博士得生物工程有限公 [ 13 ] 力下降 。本文研究大垫尖翅蝗配子发生过程中 司的兔抗小鼠 c2k it基因蛋白 、免疫组织化学 SABC (试剂盒和 DAB 显色试剂盒进行染色 。加入一抗 兔 原癌基因 c2k it产物特异性表达的特点 ,旨在探索其 )IgG1 ?100 后臵于 4 ?冰箱过夜 ,再加入生物素标记 基因水平调控机制 ,以期为蝗虫的生物防制工作提 () 供生殖生态学方面的参考依据 。 的二 抗 山 羊 抗 兔 IgG , 37 ?处 理 20 m in, 滴 加 SABC 复合物 37 ?处理 20 m in,经 DAB 2HO室温显 2 2 1 材料与方法 色 3 m in终止反应 ,以上各步间均用 011 mo l /L PB S 111 实验材料 ( )pH712,716 洗 3 次 ,每次 5 m in,阴性对照用 011 ( )基金项目 :陕西省自然科学基金项目 2004C107 收稿日期 : 2007 - 04 - 19 ( ) 作者简介 :赵卓 1973 ,,女 ,博士 ,副教授 ,主要从事昆虫生理研究 , E2m ail: zhaozhuo8933 @ 163. com mo l /L PB S代替一抗进行孵育 , 其余步骤 、条件均相大垫尖翅蝗精子发生过程中 ,在精原细胞时期 同 。梯度酒精脱水 ,透明 ,中性树胶封片 。显微镜观 开始出现微弱 的 c2k it阳 性表 达 , 颗 粒细 小 , c2k it阳 () 察 、测量与拍照 。 性表达强度微弱 如图 1 2A ,说明 c2k it蛋白开始参 与启动精原细胞分化 ; 在初级精母细胞时期 c2k it阳 113 图象统计分析 (利用 Mo tic Im age s A dvanced 312 图象分析系统 性颗粒显著增大 , c2k it阳性表达强度显著增加 如图 ) 采集图象 ,每张切片选取 10 个视野 ,测量 400 视野 1 2B , c2k it蛋白在减数分裂的中期 ?至后期 ?的持 [ 14,16 ] [ 17 ]下卵子发生 8 个阶段 和精子发生 4 个阶段 续表达 ,推测对维持减数分裂 ,确保同源染色体准确 中 c2k it蛋白阳性颗粒面积百分比及阳性颗粒平均 地分别移向两个次级精母细胞 ,促进姐妹染色单体 面积 ,以代表 c2k it蛋白表达强弱和 阳 性颗 粒大 小 。 分离 ,最终形成 4个精子细胞有作用 ;在次级精母细 将测得数据经 SPSS1210软件进行处理 ,所有数据经 胞时期 c2k it阳性颗粒显著变小 , c2k it阳性表达强度 () ANOVA 分析及 S2N 2K和 L SD 进行 组 间两 两比 较 , 继续显著增加 如图 1 2C ,推测 c2k it蛋白在次级精 文中描述性统计值用平均值 ?误差表示 ,显著 母细胞的第二次减数分裂中起着积极的调控作用 ; 性水平设臵为 P < 0105 为差异显著 。 2 结果与分析 211 大垫尖翅蝗精子发生时 c2k it蛋白特异性表达 ()()图 1 大垫尖翅蝗精子发生过程中 c2k it蛋白特异性表达图 左 和统计分析 右 () ( ) ( ) F ig. 1 The p ic tu re s of sp ec ia l exp ression of c2k it p ro te in L eftand sta tistic ana lysis R igh tin sp e rm a togene sis of E. coe ru lip e s Ivan. A:精原细胞 ; B: 初级精母细胞 ; C:次级精母细胞 ; D:成熟精子 ; E:精巢末端颗粒 ; F:阴性对照 ; 数据为平均值 ?标准误 ,单因子方差分析 , S2 ( ( ) ) N 2K和 L SD 检测 ,样本量 : n = 20 ,每组数据上的不同字母表示具有显著性差异 P < 0. 05 ,相同字母表示不具有显著性差异 P > 0. 05 ,其中小 写字母代表百分比组 ,大写字母代表平均面积组 (在成熟精子时期 c2k it阳性颗粒细小 ,在精子头部和 ,在卵原细胞中 图 2 2 大垫尖翅蝗卵子发生过程 ) 尾丝处都有均匀分布 , c2k it阳性表达强度继续显著 A ,就已经开始出现强的 c2k it阳性表达 ,阳性颗粒 () 增加但是颗粒细小 如图 1 2D ,推测在成熟精子出 粗大 ,此时处于第一次减数分裂各个时期的卵原细 胞中具有 c2k it蛋白大量合成与分布 ,说明 c2k it / SCF 现后 c2k it蛋白可能参与精子生理活性维系和运动 能力的维持 ,甚至参与顶体形成 ;在精巢小管末端出 信号转导系统可能直接参与启动卵原细胞发育中的 (现大量成团存在 c2k it阳性颗粒 ,散布于成束的精子 第一次减数分裂进程 ; 在第 2 阶段卵母细胞中 图 ) () 2 2B , c2k it阳性颗粒和 c2k it阳性表达强度变化差异 群中 如图 1 2E,成熟精子在受精未发生之前 ,不能 过长时间存 活 , 而且 成熟 精 子经 过 鞭 毛 生 长 、核 凝 不显著 ,此时卵母细胞合成 c2k it蛋白速度远不及细 缩 、细胞质外排和顶体泡形成的系列变化后 ,外部形 胞体积迅速增长 ,虽然出现表达增长不显著现象 ,但 态是极为简单的结构 ,精子活性生理水平维系主要 事实上细胞合成 c2k it蛋白也在积极的进行当中 ,蛋 依赖于外界微环境提供 ,因此 ,精巢小管末端强阳性 白颗粒首先出现在细胞核附近 ,并逐渐向细胞质中 () 颗粒可能起着维持成熟精子的活性生理作用 。 扩散 ; 在第 3阶段卵母细胞中 图 2 2C , c2k it阳性颗 粒和 c2k it阳性表达强度显著增加 ,随着 c2k it蛋白合 212 大垫尖翅蝗卵子发生过程中 c 2k it特异性表达 外周进行运输 ,细胞膜也开始出现阳性颗粒表达 ,推,通过对滤泡细胞周期性变化观察 ,发现滤泡速发育 测卵母细胞中 c2k it蛋白可能参与抑制成熟分裂以 细胞也具有分泌 c2k it蛋白功能 ,并且随着滤泡细胞 (() ) 调控发育进程 ;在第 4 阶段卵母细胞中 图 2 2D ,阳 周期性变化呈现出规律性变化 图 2 C2H 。免疫组 性颗粒和阳性强度均显著下降 ; 在第 5 阶段卵母细 织化学结果显示 ,在立方形滤泡细胞出现前期 ,未见 () 有 c2k it蛋白出现 , 而柱状滤泡细胞出现后 , 随着卵 胞中 图 2 2E,阳性颗粒和阳性强度开始显著下降 ; () 在第 6阶段卵母细胞中 图 2 2F , 阳性强度均继续 黄积累开始出现大量 c2k it蛋白合成并分泌到滤泡 下降 ,阳性颗粒大小变化差异不显著 ; 在第 7 和第 8 细胞顶端 ,而且滤泡细胞分泌合成的 c2k it蛋白并不 () 阶段卵母细胞中 图 2 2G、H ,未见有阳性颗粒出现 。 向卵母细胞中移动 ,只停留并分布在滤泡细胞周围 , 可见 c2k it蛋白在大垫尖翅蝗卵子发生过程中呈现 未见有向卵母细胞内迁移迹象 ,最后在第 7 阶段和 特异性表达 ,说明在卵子发生的不同阶段发挥和执 第 8阶段滤泡细胞开始分泌形成卵壳 ,大量 c2k it蛋 行其特有的生理功能 。 白分布在卵壳表面 ,推测滤泡细胞分泌合成的 c2k it c 2k it 213 大垫尖翅蝗卵子发生过程中滤泡细胞中 蛋白参与卵壳合成 、卵子成熟和维系成熟卵子生理 活性等生理功能 ,可能还具有识别精子等生理作用 。 特异性表达 ()()图 2 大垫尖翅蝗卵子发生过程中 c2k it蛋白特异性表达图 左 和统计分析 右 ( )() ( ) F ig. 2 The p ictu re s of sp ec ia l exp re ssion of c2k it p ro te in L eftand statistic ana lysis R igh tin oogene sis of E. coeru lipes Ivan. A ,H:分别为第 1 阶段至第 8 阶段卵母细胞. I:卵母细胞阴性对照. J. 输卵管管壁细胞. K. 输卵管管壁细胞阴性对照. L. 受精囊壁细胞. M. 受精囊壁细胞阴性对照. . 数据为平均值 ?标准误 ,单因子方差分析 , S2N 2K和 L SD 检测 ,样本量 : n = 20 ,每组数据上的不同字母表示具有显著 ( ( ) ) 性差异 P < 0105 ,相同字母表示差异不显著 P > 0105 ,其中小写字母代表百分比组 ,大写字母代表平均面积组 214 大垫尖翅蝗输卵管中 c 2k it特异性表达 工 ;另一方面成熟卵母细胞生理活性维系需要有 c2 大垫尖翅蝗卵子发生过程中输卵管出现明显形 k it蛋白存在 ,所以推测 c2k it蛋白在输卵管中有大量 态变化 ,最终发育成运送卵子的通道 。卵母细胞发 的分泌合成对卵子后期成熟具有重要的润饰作用 。 育初期输卵管开始膨大 ,褶皱明显 ,随着卵母细胞的 215 大垫尖翅蝗受精囊中 c 2k it特异性表达发育 ,中输卵管和侧输卵管继续膨大 ,到产卵期时 , 受精囊是雌性蝗虫贮存精子的器官 ,免疫组织 成熟卵子进入输卵管 ,此时中输卵管和侧输卵管光 化学结果显示 ,在大垫尖翅蝗受精囊壁腺细胞内存 () 在大量的 c2k it阳性颗粒 图 2 2L ,说明受精囊壁内 滑 ,无褶皱 。免疫组织化学结果显示 ,输卵管管壁腺 () 细胞内存在大量的 c2k it阳性颗粒 图 2 2J , 说明大 腺细胞具有合成和分泌 c2k it蛋 白的 能力 。受 精囊 垫尖翅蝗输卵管管壁腺细胞也具有分泌 c2k it蛋白 壁腺细胞在基部合成 c2k it蛋白 ,然后以小泡形式运 功能 ,而且分泌量较大 , c2k it蛋白以颗粒状或弥散状 输到腺细胞顶端并分泌到受精囊腔内 , c2k it蛋白以 分布在输卵管管壁内侧 。输卵管是成熟卵子必经之 颗粒状或弥散状分布在受精囊的囊腔内和壁上 。受 路 ,成熟卵子进入并在输卵管中运行过程中 ,一方面 精囊是雌性蝗虫受精后暂时贮存精子的场所 ,蝗虫 受精后并不立即完成受精活动 c2k it蛋白可能参与成熟卵母细胞表面活性的后期加 ,而在交配和受精完 ( ) The Jou rna l of B io logica l Chem istry, 2000 , 275 33 : 25572 , 成的这段时间差内 ,受精囊为期内贮存的大量精子 25576. 提供保持生理活性的微环境 ,推测 c2k it蛋白在受精 [ 7 ]O h ta H , Tohda A , N ish im une Y. P ro life ra tion and d iffe ren tiation of 囊内具有维系精子活性等生理功能 。 sp e rm atogon ia l stem ce lls in the w /wv m u tan t mou se te stis[ J ]. B io lo2 ( ) gy of R ep roduction, 2003 , 69 6 : 1815 ,1821. 3 讨论 [ 8 ] C la rk D E, Tisda ll DJ , F id ler A E, et a l. Localiza tion of mRNA enco2 从免疫组织化学结果来看 ,原癌基因 c2k it及其 d ing c2k it du ring the in itia tion of fo llicu logene sis in ovine fe ta l ova rie s ( ) 产物不仅在哺乳动物的配子发生过程中起着重要的 [ J ]. J R ep roduc tion and Fe rtility, 1996 , 106 2 : 329 ,335. [ 9 ] Ho rie K, Takaku ra K, Ta ii S, et a l. The exp re ssion of c2k it p ro te in 调控作用 ,而且在无脊椎动物的直翅目昆虫配子发 du ring oogene sis and early em b ryon ic deve lopm en t [ J ]. B io logy of 生过程中也呈现出特异性表达亦其表达和调控 ( ) R ep roduc tion, 1991 , 45 4 : 547 ,552. 机制是非常保守的 。此外 ,在输卵管 、受精囊和精巢 [ 10 ]Mo tro B , B ern ste in A. D ynam ic change s in ova rian c2k it and Stee l 小管末端大量存在的 c2k it蛋白 ,暗示该蛋白具参与 exp re ssion du ring the estrou s rep roduc tive cyc le [ J ]. D evelopm en ta l 对配子成熟的修饰 、生理活性维系等作用 。 ( ) D ynam ic s, 1993 , 197 1 : 69 ,79. [ 11 ]赵卓 , 孙晓玲 , 奚耕思. c2k it / SCF信号系统在卵子发生中表达 () 与调控的研 究 进 展 [ J ]. 吉 林 师 范 大 学 学 报 自 然 科 学 版 ,4 参考文献 ( ) 2005 , 26 1 : 15 ,17. [ 1 ]赵卓 , 于艳萍 , 任炳忠. 吉林省四平郊区蝗虫群落组成及其时间 [ 12 ] Ro ssi P, Se tte C, Do lc i S, et a l. Ro le of c2k it in m amm alian sp e r2 ( ) 动态研究 [ J ]. 吉林农业大学学报 , 2004 , 26 3 : 267 ,271. ( ) m a togene sis[ J ]. J Endoc rino logica l Inve stiga tion, 2000 , 23 9 : ( ) [ 2 ] Ko sh im izu U , W a tanabe D , Ta jim a Y, et a l. Effec ts of W c2k it 609 ,615. gene m u tation on gam e togene sis in m a le m ice, agam e tic tubu la r seg2 [ 13 ] Kisse l H , Timokh ina I, H a rdy M P, et a l. Po in t m u tation in k it re2 ( ) m en ts in W f /W f te ste s [ J ]. D eve lopm en t, 1992 , 114 4 : 861 , cep to r tyro sine k ina se reveals e ssen tia l ro le s fo r k it signa ling in sp e r2 867. m a togene sis and oogene sis w ithou t affec ting o the r k it re spon se s [ J ]. [ 3 ]L am b DJ. 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