皱皮木瓜总黄酮镇痛作用的机制分析-药学论文

皱皮木瓜总黄酮镇痛作用的机制分析-药学论文 【摘要】目的探讨皱皮木瓜总黄酮(FLC)的镇痛作用及其镇痛机制。方法利用小鼠热板、扭体法模型和兔耳皮下K+渗透外周致痛模型，观察FLC的镇痛作用，并分析与Ca2+的关系。结果FLC不仅具有全身镇痛作用，还具有外周镇痛作用;其全身及外周镇痛作用可被CaCl2拮抗，被EGTA所加强。5%，10%和20%FLC呈浓度依赖性抑制50mmol?L-1K+诱导蟾酥坐骨神经Ca2+含量增加;10%FLC抑制10-5mmol?L-1NE诱导蟾酥坐骨神经Ca2+含量增加。结论FLC的镇痛作用机理可能与其抑制神经组织钙通道和非神经组织钙通道，减少致痛介质释放等因素有关。 【关键词】皱皮木瓜总黄酮钙离子坐骨神经镇痛作用 植物中的黄酮类化合物具有多种药理活性。近年来发现芦丁、银杏叶总黄酮、金丝桃苷和黄芩苷等生物黄酮类化合物均有较强的镇痛作用,1,5,。本实验室以前的研究发现皱皮木瓜的乙醇提取物具有镇痛作用,6,。为了进一步寻找其中的有效部位，本文利用皱皮木瓜总黄酮组分，对其镇痛作用进行了深入的实验研究。 1 颅痛定(Rotundine，Rot)，山西云鹏制药有限公司出品，批号20060402;CaCl2，武汉化工试剂有限公司产品;乙二醇双醚四乙酸(EGTA)，华中科技大学提供;硝苯地平(Nifedipine，Nif)，湖北华中药业有限公司出品，批号20070122;皱皮木瓜总黄酮(FLC)由三峡大学天然产物研究与利用实验室提供，经酒精回流、大孔吸附树 脂分离纯化，临用时配成相应浓度备用。其他试剂均为市售产品。 2方法 2.1小鼠热板法取雌性昆明种小鼠50只，普通清洁级，体重18,22g，选择其基础痛阈在10,25s之间，随机分为5组，每组10只，腹腔注射给药。分组及用药剂量见1。调节热板仪温度至55?，以雌性小鼠接触热板至开始舔后足的潜伏期为基础痛阈指标，分别测得小鼠给药后30，60，90min痛阈值。 2.2小鼠扭体法取昆明种小鼠50只，普通清洁级，雌雄不拘，体重18,22g，随机分为5组，每组10只。分组及用药剂量见表2。各组小鼠给药40min后，腹腔注射0.6%冰醋酸0.2ml/只，观察注射醋酸后30min内扭体反应(后肢伸直，背部抬高，腹部凹陷)次数作为致痛的指标。 2.3家兔耳皮下K+渗透外周致痛模型实验取家兔30只，体重1.5,2.0kg，随机分5组，分组及用药剂量见表3。置家兔于兔盒中，在耳根部中央动脉顺血流方向用7#针头刺入后，立即注入0.5ml肝素进行局部抗凝处理并固定;将耳背部内、外两侧耳缘静脉近心端分别用7#注射针头沿静脉血流方向逆向刺入并引流至体外，用蛙心夹夹住静脉以阻断其回流。在耳尖部固定一金属圈，直径约0.8cm，充以饱和氯化钾溶液棉球，作为刺激电极正极，在耳根部固定一相同金属圈，充以生理盐水棉球，作为参考电极，两电极连上BL-420E+生物机能实验系统，逐步加大刺激电流，以引起家兔挣扎时的最小刺激电流为痛阈指标,制成兔耳皮下K+渗透外周致痛模型，分别测定并 给药前后痛阈，按以下公式，求出镇痛效应。 镇痛效应(%)=(给药后痛阈,给药前痛阈)/给药前痛阈×100% 同法测得给药前后对侧兔耳痛阈值的变化，以排除药物从侧枝循环回流至全身产生的全身镇痛效应。 2.4坐骨神经钙含量的测定按文献方法制备蟾蜍坐骨神经标本。标本称重，随即将神经标本浸在4?的任氏液中1h，分别加入50mmol?L-1KCl和10-5mol?L-1NA，刺激钙通道开放，以增加钙离子内流，继续在4?任氏液中保存1h后取出标本，用无钙任氏液冲洗2次，以冲去标本表面上的钙离子，滤纸吸干，放入去离子水清洗的坩锅内待消化。FLC组则在未使用激动剂前将标本浸在不同浓度的FLC中30min，再分别放入上述相同的激动剂中，后续处理相同。所有标本分别加入混合酸(硝酸0.9，高氯酸0.1)1.0ml在电热板上徐徐加热，消化至无色，待高氯酸冒烟时取下，加入2%HCl溶解，再加入500ppm镧盐(促钙释放剂)，定溶后待测。采用HITACHIZ-2000型原子吸收分光光度计测定(测定波长42207nm，灯电流10mA，狭缝0.7nm)。见图1,2。 2.5统计学处理所有数据依据SPSS10.0版统计软件进行t检验分析处理。 3结果 3.1FLC对热板法致痛实验小鼠痛阈的影响结果见表1。 表1FLC对实验小鼠痛阈的影响(略) 与NS比较,,P<0.05;与20%FLC比较，?P<0.05;n=10 实验结果表明，2.0g?kg-1FLC明显延长小鼠舔足潜伏期，其延长效应能被EGTA增强，被CaCl2所拮抗。 3.2FLC对扭体法致痛实验小鼠扭体次数的影响结果见表2。 表2FLC对小鼠扭体次数的影响(略) 与NS比较,,P<0.05,,,P<0.01 结果表明，FLC明显降低小鼠扭体反应次数，表明对化学致痛模型也具镇痛作用，且镇痛作用与FLC剂量存在依赖关系。 3.3FLC对家兔耳皮下K+渗透外周致痛模型的影响见表3。 表3FLC对实验家兔的镇痛效应(略) 与NS比较,,P<0.05;与8%FLC比较，,,P<0.05 由表3可见FLC对兔耳皮下K+渗透致镇痛模型可显著提高痛阈，其镇痛作用能被EGTA增强，被CaCl2所拮抗。表明FLC也有很强的外周镇痛作用，且镇痛作用与钙离子有关。经测给药前后对侧兔耳痛阈值无明显改变。 3.4FLC对坐骨神经钙含量的影响见图1,2。 图1FLC对蟾蜍坐骨神经钙含量的影响(略) 图2FLC对蟾蜍坐骨神经钙含量的影响(略) 由图1可见，10-5molNA+10%FLC与10-5molNA组钙离子比较明显降低(P,0.05)，而NA+10-4molNif组降低并不显著。5%、10%和20%的FLC可浓度依赖性降低由50mmolK+所诱发的坐骨神经钙含量降低(P,0.05)。见图2。说明FLC对电压依赖性的钙通道的阻滞作用大于受体操纵性钙通道。 4讨论 皱皮木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠 Chaenomelesspeciosa(Sweet)Nakai的成熟果实，主产于安徽、湖北、四川、浙江等地，经植化研究分析，皱皮木瓜的主要化学成分为有机酸、皂苷及黄酮类,7,。皱皮木瓜作为一种常用中药,味酸、温,入肝、脾经,有舒肝止痛、祛风除湿之功效，可用于预防和治疗风湿病、痢疾和肠炎等。木瓜成分复杂，药理学作用广泛。本实验将皱皮木瓜黄酮作为研究有效部位。 实验表明，FLC具有全身和外周镇痛作用。研究发现无论对小鼠热板模型，还是对兔耳皮下K+渗透外周致痛模型，均能清楚表明CaCl2可拮抗而EGTA可加强FLC的镇痛作用，这就提示FLC镇痛作用的机理可能与Ca2+有联系。Kavaliers等发现钙通道阻滞剂维拉帕米有一定的镇痛作用，而钙通道激动剂BAYK8644具有显著的痛 敏作用。通过调节Ca2+内流而调控痛觉产生将是寻找有效镇痛药的新的途径。 本研究采用热板法(热刺激)和扭体法(化学刺激)不同动物模型观察了FLC的镇痛作用。热板法反映的是躯体体表痛，而扭体法代表的是内脏痛。热板法引起的是时相性急性痛，而扭体法引起的是紧张性的病理性疼痛,8,。本实验中，FLC无论对醋酸所致雌性小鼠扭体反应的内脏痛、还是对热板法所致躯体体表痛均具镇痛作用。提示FLC在镇痛作用上无特异性，即对紧张的病理性疼痛(内脏痛)和对时相性急性痛(体表痛)无明显差异。 CaCl2部分拮抗FLC的镇痛作用提示:Ca2+对FLC的镇痛作用的拮抗可能与钙离子内流有关。钙通道有L、N、T三个亚型，维拉帕米等经典的抗钙剂虽可阻断经L型通道钙离子内流，但不能阻断N、T型通道的钙内流，结果神经细胞钙离子水平仍然较高，所以维拉帕米本身无明显的镇痛作用，而FLC的镇痛效应可能与其非选择性的阻断钙通道有关。 文献报道神经组织中也存在钙通道，其调节着神经递质的释放、树突神经元的动作电位、行为及节律活动。神经末梢可能存在着多种痛介质的受体或作用位点，而这些受体或位点偶联着钙通道，当痛介质兴奋其相应受体或作用位点时，钙通道开放，Ca2+内流增加，当 细胞内钙离子浓度增高到一定程度时，兴奋了痛感受器，产生痛感受器电位，形成痛冲动传入中枢，而FLC可能与阻滞钙通道的多个亚型，影响钙离子内流，因而使痛感受器不能兴奋和通过阻滞钙离子内流，减少神经组织和/或非神经组织致痛介质的释放而产生镇痛作用有关。 【参考文献】 ,1,张晨峥，毛甜甜，姜鸣，等.曲克芦丁的镇痛作用研究,J,.医学新知杂志，2005，15(3):31. ,2,张黎，赵春晖，陈志武，等.银杏叶总黄酮的镇痛作用及机制探讨,J,.安徽医科大学，2001，36(4):263. ,3,章家胜，陈志武，王瑜，等.金丝桃甙脊髓镇痛作用及机制研究,J,.安徽医学，1998，19(5):3. ,4,左亮.黄芩提取物抗炎镇痛耐氧及抗疲劳作用的研究,J,.时珍国医国药，2007，18(9):2157. ,5,宋小平，陈志武，张建华.映山红总黄酮的镇痛作用,J,.安徽医科大学学报，2006，41(4):427. ,6,柳蔚，杨兴海，等.资木瓜乙醇提取物镇痛抗炎作用的实验 研究,J,.四川中医，2004，22(8):7. ,7,吴虹,魏伟,吴成义.木瓜化学成分及药理活性的研究,J,.安徽中医学院学报，2004，23(2):62. ,8,Cull-CandyS，BrickleyS，FarrantM.NMDAreceptorsubunits:diversity，developmentanddisease,J,.CurrOpNeurobiol，2001，11(3):327.