熟地黄药材质量标准的研究

药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2007，27(9) -k论 著 ★ 熟地黄药材质量标准的研究 刘明 ，李更生 ，王慧森 (1．河南省中医药研究院中药研究所，郑州 450004；2．北京中医药大学中药学院，北京 100102) 摘要 目的：建立熟地黄药材的质量标准。方法：采用TLC法对熟地黄药材进行定性鉴别；用高效液相色谱法测定地黄苷A 和地黄苷D的含量。薄层色谱使用硅胶G薄层板，以三氯甲烷 一甲醇 一水(12：8：1)为展开剂，以5％香草醛浓硫酸溶液为显 色剂；液相色谱采用Inertsil NH2色谱柱(250 mm×4．6 mm，5 m)，流动相为乙腈一水(75：25)，流速 1 mL·min～，检测波长 203 nm，柱温40℃。结果：TLC色谱系统中，地黄苷A和地黄苷D分离效果良好，可以用于熟地黄药材的鉴别；HPLC中地黄 苷A和地黄苷 D进样浓度分别在0．064～0．320 mg·mL 和0．044～0．220 mg·mL 范围内线性关系良好，r值分别为 0．9999和0．9995，平均加样回收率(n=6)分别为97．3％和98．0％。结论：所建立的方法可准确地进行定性、定量分析，可用 于熟地黄药材的质量控制。 关键词：熟地黄；地黄苷A；地黄苷D；薄层色谱；高效液相色谱 中图分类号：R917 文献标识码 ：A 文章编号：0254—1793(2007)09—1311—03 Study on quality standard of Radix Rehmanniae Praeparata LIU Ming ，LI Geng—sheng ， ，WANG Hui—sen (1．Institute of Chinese Materia Mediea，Henan Academy of TCM，Zhengzhou 450004，China； 2．College of Chinese Mediea，Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100102，China) Abstract Objective：To establish the quality standard of Radix Rehmanniae Praeparata．Methods：111e rI'LC and HPLC methods were used for qualitmive identification and quan titmive determination of rehmannioside A and D．rI'LC condition：Developer of selection was chloroform—methanOl—water(12：8：1)．5％ vanillin sulfuric acid solution as coloration using silica gel G；HPLC：111e separation Was performed on a Inertsil NH2column(250 mm×4．6 mill，5 pan)，using the mobile phase of acetonitrile—water(75：25)with a flow rate at 1．0 mL·min～，the detection wave． 1ength Was set at 203 nm an d column temperature Was 40℃ ．Results：The identified characteristics of rehmannioside A an d D were distinct an d Ra dix Rehman niae Praeparata could be identified by TLC；In the system of HPLC．the cali． bration curves of rehmannioside A and D had a good linear relation respectively in the ranges of 0．064-0．320 mg· mLI1(r=O．9999)and 0．044—0．220 lng·mLI1(r=0．9995)．111e average recoveries(n=6)were 97．3％ and 98．O％ respectively．Conclusion：Th e methods Can be used for the quality control of Radix Rehman niae Praeparata． Key words：Radix Rehmanniae Praeparata；rehmannioside A；rehmannioside D；rI'LC；HPLC 熟地黄为玄参科植物地黄 Rehmannia glutinosa Libosch．的炮制加工品，具有滋阴补血、益精填髓之 功效⋯。2005年版中国药典收载的熟地黄药材标 准未建立含量测定项，仅作了5一羟甲基糠醛(5一 HMF)薄层鉴别，而5一HMF为糖的降解产物，它在 多种单味中药及复方中普遍存在，并且能与人体蛋 白质结合产生蓄积中毒，具有一定神经毒性 j。 地黄中环烯醚萜苷类成分结构近似，极性普遍 较大易溶于水，热稳定性较差。我们曾对梓醇成分 进行分离制备 ，研究发现从鲜品加工成生地黄及 熟地黄，梓醇的含量降低至原来的1／10，而地黄苷 A和地黄苷D相对稳定并且含量较高，药理实验表 明地黄苷 D具有滋阴补血和降血糖作用，而地黄苷 A对“阴虚”及免疫功能低下的小 鼠具有一定作 } 国家中医药局青年基金项目(95Y3411／95C018)；河南省自然科学基金项 目(0511043800) }} 通讯作者 Tel：(0371)66336574，13663838889；E—mail：Lgshn@sohu．com 维普资讯 http://www.cqvip.com 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2007，27(9) 用 J。本文以熟地黄中地黄苷 A和地黄苷 D为标 准对照物质，采用大孔吸附树脂法进行除杂、富集， 进行定性、定量质量分析，建立熟地黄药材中2种环 烯醚萜苷类成分薄层鉴别和同时测定的新方法，测 定了市售多个熟地黄药材样品，结果准确，为该类大 宗、常用中药材的质量检查提供参考 ， 。 1 仪器、样品与试剂 高效液相色谱仪(日本岛津，LC一10A)，SPD— M10A二极管阵列检测器，Class—vp 5．13色谱工作 站。乙腈为色谱纯(Merck公司)；水为双蒸水并经 0．45 m水系滤膜过滤；三氯甲烷、甲醇(北京化工 厂)为分析纯；定量毛细管1，2 (瑞士CAMAG)； 硅胶G薄层预制板(青岛海洋化工厂)；D一101型、 DA一201型、DM一301型大孔吸附树脂(天津市海 光化工有限公司)；地黄苷 A、地黄苷 D为自行提取 精制，并经 uV、IR、 HNMR13CNMR鉴定结构，高效 液相色谱法测定纯度为98％。熟地黄药材为市售， 经本院都恒青研究员鉴定来源为玄参科植物地黄 Rehmannia glutinosa Libosch．的炮制加工品。 2 薄层鉴别 取本品粉末5 g，加50％甲醇50 mL，冷浸过夜， 加热回流1．5 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水2 mL使溶解，通过 DA一201型大孔吸附树脂(内径 1．5 cm，长 15 cm)，以水 80 mL洗脱，弃去水液，再 用30％甲醇80 mL洗脱，收集洗脱液，浓缩至约 1 mL，作为供试品溶液。另取对照品地黄苷 A、地黄 苷 D，加甲醇制成每 1 mL各含0．5 mg的混合溶液， 作为对照品溶液。吸取上述溶液各5 ，分别点于 同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷一甲醇一水(12 ：8：1)为展开剂，展开约 8 cm，取出，晾干，喷以5％ 香草醛浓硫酸溶液，105℃加热至斑点显色清晰。 样品色谱中，在与对照品色谱相对应的位置上，显相 同颜色的斑点。见图1。 地黄苷 (reh~nnioside) 1 2 3 4 图 l 熟地黄 TLC图谱 Fig l TLC ehromatogram of Radix Rehmanniae Praeparata 1．对照品(reference substance) 2．样品 l(sample 1) 3．样品3(sample 3) 4．样品6(sample 6) 3 含量测定 3．1 对照品储备液的制备 精密称取对照品地黄 苷A、地黄苷D适量，加70％乙腈制成每1 mL各含 0．5 mg的混合溶液，即得。 3．2 供试品溶液的制备 取本品粉末(过4号筛) 1．0 g，精密称定，加 50％甲醇30 mL，冷浸过夜，加 热回流1．5 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水2 mL 使溶解，放冷，通过DA～201型大孔吸附树脂(内径 1．5 cm，长 15 cm)，以水 80 mL洗脱，弃去水液，再 用 30％甲醇80 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，用70％ 乙腈溶解并转移至5 mL量瓶中，加 70％乙腈至刻 度，摇匀，滤过，即得。 3．3 色谱条件 色谱柱：Inertsil NH2(250 inln×4．6 inln，5 )；流动相：乙腈一水(75：25)；流速：1 mL· n ～ 。 检测波长：203 nm。以外标法计算含量，理论 板数按地黄苷A峰和地黄苷 D峰计算，均不低于 3000，二者色谱峰与相邻色谱峰的分离度符合要求。 在上述色谱条件下，对照品与样品色谱图见图2。 A 廿 图2 对照品(A)和6号熟地黄样品(B)色谱图 Fig 2 HPLC ehmmatograms of reference substance(A、and Radix Reh· manniae Praeparata sample No．6(B) 1．地黄苷 A(rehmannioside A) 2．地黄苷 D(rehmannioside D) 3．4 线性关系考察 精密称取对照品储备液1，2， 3，4，5 mL，分别置10 mL量瓶中，加70％乙腈稀释至 刻度，摇匀，制成5个浓度的对照品混合溶液，分别进 样 l0 L，在上述色谱条件下，以进样浓度 (mg· mL )为横坐标，以测得峰面积y为纵坐标，绘制标 准曲线，地黄苷A及地黄苷D回归方程分别为： y：5．43×10 X +1．46×10 r：0．9999 Y：2．51×10 X 一2．19×10 r：0．9995 结果表明，地黄苷 A进样浓度在 0．064～0．320 mg ·mL 范围内，地黄苷 D进样浓度在0．044～0．220 维普资讯 http://www.cqvip.com 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2007，27(9) 一 l3l3一 mg·mL一范围内，线性关系良好。 3．5 稳定性试验 取供试品溶液10 ，分别在0， 2，4，6，8 h进样测定，所测峰面积的 RSD分别为 3．4％和3．6％。表明供试品溶液在8 h内稳定。 3．6 精密度试验 精密吸取供试品溶液 10 ，按 上述色谱条件，重复进样6次，测得地黄苷A峰面积 的RSD为3．6％；地黄苷D峰面积的RSD为1．5％。 3．7 重复性试验 取同一样品粉末5份，分别制备 供试品溶液，在上述色谱条件下测定峰面积，计算地 黄苷A的平均含量(n：6)为1．26 mg·g～，RSD为 1．9％；地黄苷D的平均含量(n=6)为0．49％，RSD 为 3．4％，表明该方法重复性良好。 3．8 加样回收率试验 精密称取6份已知地黄苷 A含量为1．26 mg·g 和地黄苷D含量为0．49 mg ·g一的熟地黄样品粉末，每份0．5 g，分别加入对照 品储备液(地黄苷 A：0．64 mg·mL～；地黄苷 D： 0．44 mg·mL )1 mL，按“3．2”项下方法制备供试 液。精密吸取对照品混合溶液(含地黄苷A及地黄 苷D分别为0．22，0．12 mg·mL )和供试液各 10 ，注入液相色谱仪，测得溶液中地黄苷 A、地黄苷 D的含有量(mg)，计算地黄苷A、地黄苷 D的回收 率。结果平均加样回收率(n=6)分别为 97．3％ (RSD=2．0％)及98．0％(RSD=1．8％)。 3．9 样品的测定 精密吸取供品溶试液及对照品 混合溶液(含地黄苷A及地黄苷 D分别为0．22， 0．12 mg·mL )各10 ，注入液相色谱仪，测定各 样品中地黄苷A、地黄苷 D含量，结果见表 1。 表 1 样品测定结果(mg·g～。，l=3) Tab 1 Determination reslllt of samples 编号 样品来源 地黄苷 A 地黄苷 D (No．) (source of sample) (rehmannioside A)(rehmannioside D) 4 讨论 4．1 在样品提取条件的筛选试验中，曾分别采用 50％甲醇、80％甲醇、甲醇、50％乙醇、80％乙醇、乙醇 回流提取，发现提取液经浓缩定容后溶液黏度较大。 滤过困难，稀释后注入液相色谱仪，结果供试品溶液 色谱基线掩盖了地黄苷A及地黄苷D信号峰，后选 用 D一101型、DA一201型、DM一301型3种大孔吸附 树脂和正丁醇多次萃取等方法用于样品提取液的除 杂，结果DA一201型大孔吸附树脂除杂效果较好，经系 统的方法学考察重复性和回收率试验结果符合要求， 其中熟地黄样品适宜的提取溶剂为50％甲醇回流提取 1．5 h，地黄苷A及地黄苷D的提取率最高。 4．2 地黄苷A和地黄苷 D结构中只有 1个双键， 无共轭结构，紫外吸收光谱图在末端有吸收，经测定 供试品溶液及对照品溶液在203 nm处吸收均较强， 故测定波长定为 203 nm。以乙腈 一水(75：25)为流 动相时，地黄苷A和地黄苷D的峰形对称性较好， 与其他杂质峰达基线分离。 4．3 根据测定结果发现，不同来源不同批次的熟 地黄样品中，地黄苷A和地黄苷 D含量差异较大， 分析其原因可能和产地和炮制加工有关。 参考文献 1 ChP(中国药典)．2005．VolI(一部)：83 2 GENG Fang(耿放)，WANG Xi—jun(王喜军)．Present situation of study on 5一hydroxymethyl一2一furfural[5一羟甲基 一2一糠醛 (5一HMF)在中药复方中的研究现状及相关药效探讨]． Sci Technol Mod Tradit Chin Med(世界科学技术 一中医药现代 化)，2005，7(2)：52 3 LI Geng—sheng(李更生)，WANGHui—sen(王慧森)，DU Heng— qins(都恒青)，et a1．Separation and preparation of active component of Radix Rehmanniae catalpol by HPLC(液相层析法分离制备地黄 活性成分梓醇)． Tradit Pat Med(中成药)，1998，20(6)：36 4 YU Zhen(于震)，WANG Jun(王军)，LI Geng—sheng(李更生)， et a1．Experimental study on rehmannioside D in the action of nouris- hing yin，enriching the blood and reducing the blood sugar(地黄甙 D滋阴补血和降血糖作用的实验研究)．Liaoning J Tradit Chin Med(辽宁中医杂志)，2001，28(4)：240 5 WANG Jun(王军)，YU Zhen(于震)，LI Geng—sheng(李更生)， et a1．Experimental study on rehman nioside A in nourishing yin and regulating immune functions(地黄苷A对‘阴虚’及免疫功能低下 小鼠的药理作用)．Chin P ．，(中国药学 杂志)，2002，37 (1)：20 6 LIU Chang—he(刘长河)，ZHENG Liu—ji(张留记)，LI Geng— sheng(李更生)．Determination of rehmarmioside A in Rehmannia glutinosa(地黄中地黄苷 A的含量测定)．Chin Tradit Herb Drugs (中草药)，2002，33(8)：706 7 LIGeng—sheng(李更生)，WANGHui—sen(王慧森)．Determina- tion of rehmannioside D in root of Rehmannia glutinosa by HPLC (HPLC法测定地黄 中地黄苷 D含量)．Chin Tradit Herb Drugs (中草药)，2003，34(8)：752 (本文于2007年 1月 15 13收到) 维普资讯 http://www.cqvip.com