帕金森

细胞生物学杂志 Chinese Journal of Cell Biology 2008, 30: 1-5 http://www.cjcb.org 适用于生命科学各研究领域的宝尔超纯水系统，使实验数据更逼真 Tel: 021-31263268 www.baolor.com 收稿日期: 2007-06-28　　接受日期: 2007-11-15 国家自然科学基金资助项目(No.30570357) *通讯作者。Tel: 022-87410797, Fax: 022-87410801, E-mail: minlu001@yahoo.com 胚胎干细胞移植治疗帕金森病 田雪梅　刘　娜　陆　敏* (中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所, 天津 300020) 摘要　　胚胎干细胞起源于植入前胚胎的内细胞团(inner cell mass, ICM), 能够在体外进行增 殖并能分化成三个胚层的所有细胞类型。如果能有效地将胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES细 胞)诱导分化为特定的细胞类型, ES细胞将成为细胞替代治疗中供体细胞的一个理想来源, 从而可 以应用于帕金森病(Parkinson’s disease, PD)、糖尿病、心肌梗死等的退行性病变疾病的治疗。近 年来, 将ES细胞来源的多巴胺能神经元用于PD治疗的研究越来越广泛。现对这些研究中有关基 因达调控、实验研究进展、临床应用以及所遇到的问题作一综述。虽然这些研究还没能最终大 面积应用于临床, 但为PD的治疗提供了一个广阔的应用前景。 关键词　　胚胎干细胞; 细胞替代治疗; 帕金森病 胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES细胞)起源 于胚胎泡内细胞团, 于1981年, 首次从小鼠体内分离 出来[1]。迄今为止, 胚胎干细胞系可以从啮齿类、 兔、猪以及灵长类动物中获取。人类胚胎干细胞系自 1998年成功建立[2]以来, 被广泛用于各种基础研究。 ES细胞具有显著区别于其他细胞系的特性: 其 中最重要的一点就是发育的全能性以及在体外无限 扩增的能力, 这为 ES细胞的研究和应用提供了无限 的细胞资源, 近年来已证明ES细胞能够向造血细 胞、心肌细胞、神经细胞、肝细胞以及视网膜上 皮细胞[3~8]等分化, 因此ES细胞在细胞替代治疗(cell replacement therapy, CRT)中具有潜在的应用价值。 CRT的原则就是利用有功能的细胞去替代那些受损 或老化的细胞, 从而恢复组织或器官的正常功能, 同 时也可以称其为再生生物学。如果这种新型的治疗 方法能够得到成熟广泛的应用, 它会比那些药物治疗 或手术治疗等传统的治疗更具优越性, 更能有效 地重建病变部位的正常功能。目前这种治疗方案最 大的障碍就是可供使用的细胞资源的严重不足, 随着 这些年来研究的深入, ES细胞以其无限增殖和多向 分化的潜力在CRT中的应用越来越广, 许多研究开 始转向利用ES细胞的多向分化能力得到能够用于临 床治疗的各种终末分化的细胞, 例如多巴胺能神经 元[9]、神经视网膜前体细胞[10]、心肌细胞[11]等等。 帕金森病(Parkinson’s disease, PD)的CRT方案主要 依据是通过神经元移植恢复黑质的多巴胺递质水 平。大量动物实验研究有力地证明了来源于ES细 胞的移植细胞在形态与功能上具备多巴胺能神经元 的特性, 它们能够修复黑质损伤, 与宿主神经元形成 突触联系, 释放多巴胺, 并能接受来自宿主细胞的传 入冲动。但这些还没能大面积应用于临床, 目前在 临床上用CRT治疗PD最多的是用人胚中脑组织块 移植, 临床实验结果显示移植的多巴胺能神经元能在 患者大脑内存活并形成功能联系, 并且同患者大脑神 经元发生螯合, 移植后也有利于症状的缓解[12,13]。 1 ES细胞移植治疗PD的实验研究及应用 1.1 PD的研究治疗现状 PD是以中脑黑质以及纹状体多巴胺能神经元的 进行性缺失而造成的神经退行性病变为主的疾病[14]。 作为神经递质, 多巴胺介导黑质纹状体通路到纹状体 尾壳核的信号转导。多巴胺缺乏导致锥体外系功能 失常, 从而产生静止性震颤, 肌强直, 运动障碍等临 床症候群。目前治疗PD可以用药物治疗和神经外 科的方法。左旋多巴胺等药物治疗有一定的疗效, 但长期使用后疗效下降, 而且会产生一些副反应[15]。 神经外科手术有一定的风险和创伤。这样就需要转 变治疗方案, 有大量的研究证实胎脑组织细胞移植能 够有效地缓解PD的症状[16], 但是这种治疗方案同样 具有局限性, 这既有伦理学上的问题又存在大量获取 胎脑组织在技术上和来源上的难题。所以较为理想 的方法就是找到能产生多巴胺的细胞或能分化成多 2 ·综述· 与世界接轨，用宝尔超纯水系统 Tel: 021-31263268 www.baolor.com 巴胺神经元的干细胞, 这样将会从根本上解决多巴胺 元细胞的来源问题。许多科学家尝试从胚胎干细胞 诱导多巴胺能神经元的产生, 这能够解决利用胎儿组 织移植所遇到的很多伦理学和难题。近些年来干细 胞技术取得了迅速的进展, ES细胞的分离、纯化、 建系及定向诱导分化技术日益成熟, 为PD的细胞治 疗提供了一条新的研究方向。 1.2 体外诱导ES细胞分化为多巴胺能神经元 成功地将ES细胞作为PD细胞移植治疗的工具, 首要的就是要将其分化为多巴胺能神经元以及将其 从混合细胞群体中分离出来并确认其具有正常的生 理功能。早期的时候有学者考虑直接将ES细胞移 植到PD大鼠模型体内, 在这种情况下, 虽然ES细胞 可以部分分化为酪氨酸羟化酶阳性神经元, 但发现把 小剂量的ES细胞移植到PD小鼠运动模型黑质部, 数 周后约20%小鼠大脑见到畸胎瘤。他同时指出, 如 果将此法运用到人类PD患者, 那么移植后至少 一年内没有并发畸胎瘤。这样, 基于临床应用的安 全性, 要求ES细胞必须在体外先分化为较成熟细胞 后再实施移植。这样就可以大大降低畸胎瘤的发生 率。而且这些由ES细胞先在体外进行分化而来的 多巴胺能神经元可以在移植的动物模型内存活32周 以上仍有功能, 而且对移植动物有持续的行为恢复作 用[17]。同时发现如果延长ES细胞在体外分化为多 巴胺能神经元的时间也可以有效地降低畸胎瘤的发 生率[18]。以上这些证据说明ES细胞可以作为功能 性多巴胺能神经元的一个有效的来源。 目前, 将ES细胞体外诱导分化为多巴胺能神经 元有很多种方法, 通常都需要加入各种诱导因子, 例 如视黄酸(retinoic acid, RA) 、音猬因子(sonic hedgehog, SHH)、FGF8、基质细胞以及一些关键性的转录因 子, 例如Pax2、Pax5以及EN1等等。现在最常用 的就是ES细胞和PA6小鼠基质细胞共同培养的方法, 例如Zeng 等[19]用人ES细胞与PA6小鼠基质细胞共 同培养, 随后将细胞移植到6-羟基多巴胺处理过的小 鼠纹状体中, 移植五周发现有大量的酪氨酸羟化酶阳 性细胞存活, 而且移植后未发现未分化的ES细胞。 Buytaert-Hoefen[20]等在PA6小鼠基质细胞作为基质层 的基础上加入胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)能使TH(+)细 胞数成倍增加; 他们还将人类ES细胞与来源于胚胎 纹状体的星形胶质细胞共培养也可产生大量的TH(+) 细胞, 将人ES细胞与来源于胚胎中脑的星形胶质细 胞共培养产生的TH(+)细胞做对比, 前者比后者高出 很多。即纹状体星形胶质细胞和PA6小鼠基质细胞 都能促进人ES细胞向TH(+)表型细胞的分化, 而且 GNDF的加入能够增加该表型细胞的数量, 这在其他 许多文献中也都有报道。但将任何蛋白质移入脑组 织都要面临一个血脑屏障的问题。Behrstock等[21]研 究发现人类神经前体细胞可以在诱导型启动子系统存 在的情况下在体外进行遗传学修饰进而释放GNDF。 他们将人神经祖细胞(human neural progenitor cell, hNPC)-GDNF移植入多巴胺系统部分损坏的小鼠纹 状体内, 移植后两周这些细胞在纹状体内移行并且释 放生理水平的GNDF, 这可有效地促进宿主体内多巴 胺能神经元的存活。而且在移植后五周对小鼠功能 的改善仍旧十分明显, 在八周的时候这种细胞已经移 行至整个纹状体而且继续释放G D N F。如果将 hNPC-GDNF植入猴脑中, 在移植入三个月内都能够 存活并释放GDNF。这样就可以通过遗传学修饰的 方法绕过这个血脑屏障的问题, 从而保证使用的安全 性以及向特定的靶器官释放生长因子的能力。 以上这些研究都是使用各种复杂的培养基而且 这些培养基成分不明确, 或者和其它各种组织或细胞 一起进行培养,而且这些基质细胞通常是动物源性 的。这存在很多的缺陷, 首先这些研究方法大多是 通过延长培养时间从而使ES细胞充分表达多巴胺能 神经元的特征, 虽然这样可以达到一定的分化目的, 但 在这种过程中, 除了一些不可避免的机械操作之外, 细 胞往往会经历非常复杂的过程以致造成最后较少的 收获量。使用被移植到脑内的存活的细胞数可能会 更少[22,23]。其次如果使用含血清的复合培养基或其 它不确定成分的条件培养液, 甚至直接与其他组织或 细胞一起进行培养(例如小鼠PA6基质细胞), 一些动 物源性的物质往往会含有与人ES细胞融合的免疫源 性物质[24], 它们移植入脑后最终会引起免疫排斥反应, 即使最后可能会被排出体外, 也可能会有一些动物源 性的物质残留。有学者尝试使用一种无血清仅含化 学成分确定的人源性的介质添加物和基质, 这种物质 能够迅速而有效地诱导人胚胎干细胞分化成多巴胺 能神经元[25], 他们比较了不同来源的人胚胎干细 胞系在三周内分化为多巴胺能神经元的能力, 同时在 早期收获细胞, 这样就能减少许多细胞的损伤, 而以 这些多巴胺能神经元在移入后继续在体内分化的过 程来检测分化的能力, 这样就避免了以往方法的许多 弊端。最近也有一些比较新型的分化方法, 例如有学 3田雪梅等: 胚胎干细胞移植治疗帕金森病 适用于生命科学各研究领域的宝尔超纯水系统，使实验数据更逼真 Tel: 021-31263268 www.baolor.com 者将短尾猴ES细胞聚集吸附于琼脂糖微粒体上再进 一步将其分化为能够释放多巴胺能神经元的细胞[26]。 也有文献报道说骨骼间充质干细胞可以增强由胚胎干 细胞分化的多巴胺能细胞和神经元细胞的存活[27]。 1.3 ES细胞分化为多巴胺能神经元的过程中细胞 因子和基因的作用 诱导ES细胞分化为多巴胺神经元, 起重要作用的 是各种细胞因子和诱导剂。在该过程中发挥作用的各 种细胞因子和诱导剂有很多种, 例如GNDF、SHH、 白介素 b、双丁酰环腺甘酸、TGF-b等等, 实验证 明, 它们都能在ES细胞分化为多巴胺能神经元的过 程中增加Nurr1以及酪氨酸羟化酶 mRNA 的水平, 同 时在诱导多巴胺能神经元分化的终末阶段可以发现 抗凋亡基因bcl-2的mRNA水平也发生了上调[28]。而 且SHH还能与BMP7相互作用直接调控下丘脑多巴 胺神经元以Six3-依赖的方式进行发育[29]。这两种 信号协同作用能够直接促使来源于小鼠ES细胞的神 经前体细胞在体外分化成下丘脑多巴胺能神经元。 而GNDF除了对多巴胺能神经元的体外分化有直接 的促进作用外, 也在其它很多方面间接发挥作用, 例 如1-甲基-4-苯基吡啶[MPP(+)]可以导致人类PD, 而 且对来源于人ES细胞的多巴胺能神经元有毒性作用, 而用GNDF处理却可以保护TH(+)神经元免受MPP (+)诱导的凋亡细胞坏死, 神经元的缺失以及避免细胞 内活性氧簇的形成[30]。 与ES细胞分化为多巴胺神经元相关的基因有早 期中枢神经系统基因nestin、Otxl、Otx2, 中脑基因 Pax2、Pax5、Wntl、Enl和中脑多巴胺神经元特异 性基因Nurrl。利用遗传操作在特定阶段导入某个基 因必将增加多巴胺神经元的数量。例如Nurrl就是 促进多巴胺能神经元分化的一个很重要的基因, 通过 它的过表达从成体鼠脑室下区和白质区分离得到的 神经前体细胞可以发育成为有功能的多巴胺神经元[31]。 而且Nurrl和Pitx3共同作用便可以促进体外培养的 小鼠或人类胚胎干细胞分化为成熟的中脑多巴胺能 神经元表型[32]。Nurrl在中脑多巴胺能神经元表型的 维持过程也发挥着重要作用, 同时它还参与GNDF家 族受体的相互作用。 同时也有文献报道表皮生长因子-集落形成细 胞蛋白(EGF-CFC protein, Cripto)和DJ-1对多巴胺能 神经元的影响。Cripto在ES细胞诱导成神经元的信 号转导过程中发挥着重要的作用[33]。实验结果显示 Cripto(-/-)的胚胎干细胞可以在体外有更强的多巴胺 能神经元分化的能力, 而且将该分化的神经元移植入 PD模型的小鼠后可以观察到明显的行为改善。 DJ-1是在两个家族性常染色体隐性遗传的PD 中发现的, 在这两个家族遗传图谱中都发现了DJ-1 的双突变。在毒素处理过的DJ-1-deficient细胞中会 有活性氧簇的蓄积, 这些细胞在开始的时候表现正常, 但它们不能应对连续的操作修复而最终开始凋亡。 而且最近有实验显示由DJ-1-deficient的ES细胞分化 而来的多巴胺能神经元会出现生存的下降以及对氧 化刺激敏感性的增强[34]。这提示DJ-1基因对多巴胺 能神经元是起着保护性作用的, 同时也为细胞移植治 疗提供了一种基因学修饰的方法。 1.4 来源于ES细胞的多巴胺能神经元治疗PD的 临床以及动物实验 在成功地将ES细胞诱导为有功能的多巴胺能神 经元之后, 接下来就应该是大量的动物实验以及应用 于人体的临床使用。虽然在临床上对人体移植的结 果还未见报道, 只有文献报道说利用ES细胞进行的 首例人类临床实验已于2006年在美国进行[35]。但目 前已经有大量成功的动物实验: 例如Ben-Hur等[36]首 先在体外将ES细胞分化为神经前体细胞然后将其移 植到PD的小鼠模型中, 分别于移植后二周、四周、 八周、十二周观察旋转行为的恢复。没有进行移植 的两只对照小鼠没有发现任何行为的恢复, 而实验组 与对照组相比旋转行为有了明显的恢复, TH阳性神 经元的数量以及对震颤的协调能力的改善都具有统 计学意义。再有, Cho等[37]将分别来源于D3和N2 两种ES细胞系的多巴胺能神经元移植入PD小鼠模 型中来观察其行为的恢复, 移植后两周, 来源于N2细 胞系的多巴胺能神经元移植后的小鼠有明显的行为 恢复, 而来源于D3细胞系的多巴胺能神经元似乎对 小鼠行为的恢复没有很大的作用。 2 问题与展望 2.1 ES细胞移植治疗PD的局限性 ES细胞体外诱导为多巴胺能神经元的研究日新 月异, 诱导步骤逐渐简化, 诱导时间逐渐缩短, 分化 效率大大提高, 神经细胞分化途径也起来越接近体内 神经细胞分化。分子生物学和转基因方法在分化过 程, 分化产物的鉴定和分离上也起了重要作用: ES细 胞向多巴胺神经元的诱导分化为研究体内神经系统 早期分化提供了良好的模型, 也为中枢神经系统的一 些退行性疾病的细胞治疗提供了有效的供体细胞。 4 ·综述· 与世界接轨，用宝尔超纯水系统 Tel: 021-31263268 www.baolor.com 同时, 也应该清醒地认识到ES细胞分化治疗体系还 存在不少问题: 首先最重要的是安全性的问题。为 防止畸胎瘤的形成, 需要将终末分化的细胞类型纯化 出来。这就需要很多新的技术方法用于分离终末分 化的细胞, 例如对Oct4阳性细胞进行负性筛选可能 成为解决这个问题的方法之一; 再者, 可以将一些死 亡信号标记于植入的ES细胞, 这样, 当它们开始形 成肿瘤或引起严重的并发症时, 就可以启动这些死亡 信号而从受体体内清除掉。其次, 利用常规的诱导 分化方法诱导出的一般都是混合的细胞群体, 这样, 为 了得到感兴趣的单一的细胞群体, 同样需要采用更有 效的筛选方法, 基因筛选可能会成为可供选择的方法 之一。例如将某个选择性标记或荧光标记置于某个 特定细胞类型的启动子控制之下, 当这种特定的细胞 类型开始分化时其启动子被激活, 这样那些选择性标 记或荧光标记就会在起启动子的控制下开始表达, 这 样就可以利用那些选择性标记或荧光标记的表达来 筛选所感兴趣的特定细胞类型。再有可以利用细胞 表面不同的标记抗原用磁珠分选的方法将特定的细 胞群体分选出来, 或者用荧光标记抗体与细胞表面标 记结合, 再利用荧光激活细胞分选术(FACS)来进行筛 选, 例如Fukuda等[38]利用该技术筛选出Sox1(一种神 经前体细胞的标志)阳性的细胞, 使其分化为多巴胺 能神经元并移植入小鼠模型体内,并没有观察到畸胎 瘤的形成, 而对照组中将Sox1阴性的细胞分化后移 植到小鼠模型体内后就会观察到畸胎瘤的产生。神 经元移植过程中的免疫排斥问题同样限制着细胞移植 中的应用。一个较吸引人的进展是ES细胞的MHC 可以被宿主的MHC取代, 这样宿主的免疫系统就会 把植入的细胞认为是自己的[39], 这种方法可以通过同 源染色体重组的技术来实现; 另一种解决的方法是在 胚胎干细胞中插入免疫抑制的分子例如Fas配体[40], 与此相关的一个有趣的解决方法就是ES细胞核移植技 术的应用。在这种情况下, 在ES细胞中完整的MHC 区域和其他免疫分子都和病人的完全一致, 只有很少 一部分起源于线粒体基因的免疫分子不同。这种方 法同以上方法比较而言是免疫排斥反应最小的一 种。但是这种方法却遇到了许多伦理学的问题以及 技术上的难题而限制了它的使用。还有目前对体内 外调控ES细胞向特定细胞类型诱导分化的各种因子 还缺乏深入的认识, 因此要得到向特定方向分化的ES 细胞后代还很困难, 这就需要对其诱导分化为特定细 胞类型过程中的调控机制做更深入的研究。 2.2 ES细胞移植治疗PD的临床应用前景 从临床应用的角度来看, 细胞替代治疗仍然处于 发展阶段, 尽管在移植实验中很多动物实验已经证明 了来源于ES细胞的多巴胺能神经元对PD有很好的 治疗作用, 但将这种方法广泛的应用于临床还有很长 的路要走, 还需要在啮齿类动物和灵长类动物上做更 深一步的研究, 以确保该类移植细胞存活的长期性, 作 用的安全性和有效性。但无论如何, 细胞替代治疗 PD有它潜在的优势, 例如它能够替代那些死亡的神 经元, 复元功能性突触在神经支配的部位释放多巴胺 神经元的特性, 以及在理想情况下完全恢复黑质纹状 体系统的功能。如果人们掌握了怎样由ES细胞大 量发育成多巴胺能神经元, 以及怎样将它们植入到特 定的部位并有效地恢复多巴胺神经递质系统的技术方 法, 在将来人们就有望通过细胞移植彻底治愈PD。 参考文献 (References) [1]Evans MJ et al. 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Although this field is only in its infancy, human ES cell represent a theoretically inexhaustible source of precursor cells that could be differentiated into any cell types to treat the degenerative diseases such as the diabetes, Parkinson’s disease, Alzheimer’s disease, spinal cord injury, heart failure, and bone marrow failure. In recent years, the therapy research of the Parkinson’s disease using dopaminergic neuron derived of ES cell is extensively more and more. This review updates the gene expression, the progression of empirical study, the clinical application and the problems encoun- tered of these researches. Although these researches has not be utilized in clinic in large areas, they provided a wide application perspective for the therapy of the Parkinson’s disease. Key words embryonic stem cell; cell replacement therapy; Parkinson’s disease Received: June 28 , 2007 Accepted: November 15 , 2007 This work w as sup ported by the Nat iona l Natur al Sci ence Fo undat io n of Ch ina (N o.30570 357) * C or r e s po n d in g a ut h o r. Te l : 8 6 -2 2 - 8 74 1 0 79 7 , Fa x : 86 - 2 2- 8 7 4 10 8 0 1 , E - ma i l : mi n l u 00 1 @ ya h o o .c o m