软琼脂集落形成实验

HessenwasrevisedinJanuary2021软琼脂集落形成实验一、目的：确定已转化肿瘤细胞的性质并对其进行定量。二、原理：肿瘤细胞能无限繁殖形成细胞集落，而成熟分化的细胞则不能形成集落。CHO-EGFP和CHO-ECRT39/272细胞在体外无需加刺激因子，可在软琼脂培养基中形成集落，其他细胞则丧失了软琼脂中形成集落的能力。三、操作1．收集对数生长期的细胞（如何鉴定），先测定细胞活力并进行活细胞计数，然后调整细胞浓度，用含20%FBS的DMEM制成1000活细胞／ml的细胞悬液。2．用蒸馏水制备%、%两个浓度的低熔点琼脂糖，高压灭菌后，维持在40℃不会凝固；3．%琼脂糖和2xDMEM等体积混合，6孔板中加入，RT凝固作为底层琼脂，置CO2温箱中备用；4．%琼脂糖和2xDMEM等体积混合，再加入细胞悬液充分混匀，RT凝固作为上层琼脂，勿有气泡，将实验组和对照组分两组加好，盖上盖并作好标记。在室温放置20分钟使细胞琼脂悬液凝固。以上各步骤均在无菌条件下进行。5．然后移培养板或平皿于CO2培养箱中37℃进行培养。6．培养7～l0天，肉眼观察并计数细胞集落。四、结果：以肉眼可见的细胞团(含500个以上细胞)作为计数集落的。集落的计数和计算：集落数=n孔中细胞集落数总和/n孔，集落形成率=集落数/接种培养细胞总数×100％