微生物发酵产酶

第三章微生物发酵产酶第一节产酶微生物的发现及筛选3.1酶的来源与多样性： 80%以上的新酶来源于微生物，动物与植物来源的只占8%和4%。 微生物的多样性与丰富的资源促成了酶的多样性。 筛选微生物及其酶仍是目前发现新酶的有效和主导的方法，特别是新酶发现的初期。获取酶源的方式： （1）生产菌可从菌种保藏机构和有关研究部门获得菌种保藏机构网址美国模式培养物保藏所（ATCC）www.atcc.org德国微生物和细胞生产收藏中心（DSMZ）www.gbt.cle/DSMZ中国微生物信息网sun.im.ac.cn微生物菌种数据网(MSDN)www.bdt.org.br/bdt/msdn世界微生物数据中心(日本)wdcm.nig.ac.jp大肠杆菌遗传收藏中心(CGSC)cgsc.biology.yale.edn/top.html （2）自然界是产酶菌种的主要来源要获得生产某种酶的菌种可从富含该酶作用底物的场所去采集菌种样品。3.2微生物产酶的优点： 种类多、酶种丰富，而且菌株容易诱变，菌种多样； 生长繁殖快，容易提取酶，特别是胞外酶； 培养基来源广泛、价格便宜； 可以在线监控酶发酵生产过程，实现连续化、自动化，经济效益高； 可利用基因手段，选育菌种、增加酶产量和开发新菌种。 寻找酶要依据微生物的生境不同环境中的微生物具有与各自生理特征和代谢类型相对应的独特的酶； 产酶微生物的发现通常包括分离和筛选两个环节。 分离是通过分离技术将目标微生物从其生存的各种环境中分离出来； 筛选是以性能为目标确定合适的菌株。3.3微生物酶的筛选策略3.3.1常规酶筛选的一般策略 依据酶促反应过程和目标产物确定所需要的酶； 寻找具有这种催化活性的酶或微生物；1）从商品酶库中筛选，如Sigma、NovoNordisk等，最快、最简单，但品种有限；2）从保藏微生物菌株中筛选，如CGMCC、ATCC、UKNCC等，此外，可从一些公开的微生物数据库查阅有关酶源信息，如MINE、MSDN、世界微生物数据中心等；3）自然界发现和筛选产酶微生物，注意采样环境；4）从基因克隆库中筛选。 发酵周期短,产酶量高； 微生物尽可能地利用便宜和方便的原料生产酶； 所产酶最好具有比较高的专一性，没有或很少有生产副产物的杂酶； 所用微生物是不产生有害物质的非致病性的安全微生物； 微生物的遗传稳定性高。 由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。 非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。一般产酶微生物的筛选原则： 建立有效和方便的筛选分析方法；1）基于酶的特殊活性，如嗜热；2）基于底物；3）借助液相色谱仪或气相色谱分析；一般采用分级筛选。3.3.2从极端微生物中筛选酶的策略 极端微生物是开拓商业化新酶的有效资源； 培养极端微生物生产酶的时候要考虑微生物的特点，如多种超高温嗜热菌在培养基中有无机硫的时候，发酵会产生大量H2S，所以不能用一般的不锈钢发酵罐； 采用中间微生物宿主表达生产极端酶的时候，需要在类似极端微生物生长的生境下才可以得到折叠成天然构型的酶。 极端微生物产培养基成分要接近生境。3.3.3不可培养微生物中酶的发现策略 不可培养微生物是地球上最大的尚未开发的自然资源； 采用分子筛选，从元基因组中筛选酶基因，然后克隆，表达。 从自然界发现产酶微生物一般按采样、富集、分离与初复筛等几个步骤； 产酶微生物及酶的高通量筛选。 单克隆菌落在平板上的固定、培养以及液体几种的自动化技术可以一周筛选1000以上各菌落。3.4微生物和酶的一般筛选方法 自然选育自然环境或微生物自身代谢产生的诱变物质； 诱变选育 1）营养缺陷型突变株 2）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株 3）组成型突变株，解除对诱导物的依赖 4）抗性突变株，特别是抗噬菌体菌株3.5菌种选育第二节微生物酶的发酵生产一、优良的产酶微生物具备的条件： （1）酶的产量高； （2）产酶稳定性好； （3）容易培养和管理； （4）利于酶的分离纯化； （5）安全可靠、无毒性等。目前主要商品酶制剂及其来源目前主要商品酶制剂及其来源目前工业用主要酶的生产菌来源目前工业用主要酶的生产菌来源美国同意使用的食品用酶及生产菌种二、产酶菌种的保藏 1）低温保藏 2）干燥保藏 3）产酶菌种的退化与活化复壮四、菌种的培养固体培养法：以麸皮、稻草、米糠等农副产品作为营养源，加少量水，使之呈固体形式的培养基，接种，并在合适的温度下培养，使其生产并形成酶。液体培养法：用三角瓶装适当的液体培养基，在摇床振荡一定时间。四、酶的发酵工艺条件与控制1、培养基各种生物对营养的需求 1、选择适宜的营养物质 2、营养物的浓度及配比合适 3、物理、化学条件适宜 4、经济节约 5、精心、试验比较培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养目的不同，原料的选择和配比不同；不同阶段，培养条件也有所差异。培养基的设计原则实验室的常用培养基：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；放线菌：高氏1号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：查氏合成培养基；例如枯草芽孢杆菌：一般培养：肉汤培养基或LB培养基；自然转化：基础培养基；观察芽孢：生孢子培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础。培养基（medium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素。构成细胞物质或代谢产物中碳架碳源可作能源，为生命活动提供能量常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用）水是微生物最基本的组成分（７０％—９０％）水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）水碳源选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源）氮源有机氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏无机氮源铵盐、硝酸盐参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性维持细胞结构的稳定性调节细胞渗透压控制细胞的氧化还原电位有时可作某些微生物生长的能源物质常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钾、钠、钙、镁、铁等元素的化合物。氮源无机盐需要注意合适的碳氮比生长因子生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。分类：化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成分等四类功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子2、发酵条件的控制培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。通常培养条件：细菌与放线菌：中性或碱性范围（pH6.5～8.0）酵母菌和霉菌：偏酸性(pH4～6)植物细胞生长的最适pH值为5～6（1）pH值的控制pH值对产酶的影响 在发酵过程中，微生物不断进行着各种代谢反应，代谢产物能直接影响着pH值。培养基成分中C/N比高，发酵液倾向于酸性；C/N比低，发酵液倾向于碱性。 通气量的影响：通气量足，糖、脂类物质能完全氧化，最后产物为CO2和H2O；通气量不足，糖、脂类物质氧化不完全，则会生产中间产物有机酸。 盐利用的影响：强酸类盐的利用会引起pH值下降，强碱类盐的利用会引起pH值的上升。 碳源不足时，也会因利用氨基酸的碳架而引起pH值的变化。调节pH的方法：（1）调节培养基的原始pH，保持一定的C/N比；（2）添加缓冲液，保持pH一定范围；（3）调节通风量，使氧化还原电位保持一定的值；（4）发酵液pH高用糖或淀粉调节，过低通过氮调节。细胞发酵产酶的最适pH值与生长最适pH值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反应的最适pH值。有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的pH值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。例如，采用米曲霉发酵生产蛋白酶时，当培养基的pH值为碱性时，主要生产碱性蛋白酶；培养基的pH值为中性时，主要生产中性蛋白酶；而在酸性的条件下，则以生产酸性蛋白酶为主。通常在生物学范围内每升高10℃，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。（2）温度的控制枯草杆菌的最适生长温度为34～37℃黑曲霉的最适生长温度为28～32℃通风及搅拌速度对发酵温度均有影响。代谢反应对温度的影响：发酵过程中，微生物在发育过程中，不断进行合成代谢与分解代谢反应。在发酵初期，合成反应占优势，所以发酵液需要升温。当菌体繁殖旺盛时，分解代谢旺盛会带来大量热量，故发酵液需要降温。 细胞必须获得充足的氧气，使从培养基中获得的能源物质（一般是指各种碳源）经过有氧降解而生成大量的细胞的生长繁殖和酶的生物合成过程需要大量的能量ATP。 在培养基中培养的细胞一般只能吸收和利用溶解氧。在发酵过程中必须不断供给氧（一般通过供给无菌空气来实现），使培养基中的溶解氧保持在一定的水平。 溶解氧的调节控制，就是要根据细胞对溶解氧的需要量，连续不断地进行补充，使培养基中溶解氧的量保持恒定。（3）溶解氧的控制在酶的发酵生产过程中，处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。调节通气量调节氧的分压调节气液接触时间调节气液接触面积改变培养液的性质控制溶解氧方法（4）搅拌：（1）有利于热交换，使营养物质和菌体均匀接触，降低细胞周围的代谢产物，从而有利于新陈代谢；（2）打破空气气泡，使发酵液形成湍流，增加湍流速度，从而提高溶氧量，增加空气利用。但搅拌易产生切应力，使细胞受损，同时带来一定的热量，使发酵液温度发生变化。搅拌与发酵液粘度有关。（5）泡沫影响泡沫的存在（1）阻碍二氧化碳的排除；（2）影响溶氧量；（3）影响添料；（4）发酵液易溢出罐外。消除：（1）机械消泡；（2）消泡剂：天然的矿物油、醇类、脂肪酸类、胺类、酰胺类、醚类、硫酸酯类、金属皂类、聚硅氧烷和聚硅酮。其中，以聚甲基硅氧烷最好。4、酶生物合成的调节酶生物合成的诱导和阻遏诱导作用(induction)：诱导物使酶合成增加的过程 阻遏作用(repression)：阻遏物使酶合成减少的过程酶合成诱导的现象—JacobandMonod的工作：已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶；-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：1.大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；2.大肠杆菌生长在唯一碳源乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；当换成葡萄糖培养基时，三种酶基本消失；3.表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。本世纪三十年代，H.Karstrom在对糖代谢过程中的某些酶的合成进行研究时提出：诱导酶与组成酶 适应型酶（Adaptiveenzyme）或调节型酶（Regulatedenzyme）：生物细胞中合成的酶的含量变化很大，其合成速率明显受到环境因素的影响。如大肠杆菌β-半乳糖苷酶。 组成型酶（Constitutiveenzyme）：生物细胞中合成的酶的量比较恒定，这些酶的合成速率影响不大。如DNA聚合酶、RNA聚合酶、糖酵解途径的各种酶等。某些代谢物可以诱导某些酶的合成，是通过促进为该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成的诱导。能诱导酶合成的物质叫诱导物。酶合成阻遏的现象—JacobandMonod的工作：实验：1.大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；2.在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。3.表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌生长的经济原则：不需要就不合成。某些代谢物可以阻止某些酶的合成，是通过阻止为该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成的阻遏。能阻遏酶合成的物质叫辅阻遏物。被辅阻遏物作用而停止合成的酶叫阻遏酶。（1）酶的诱导调节诱导作用是由于阻遏蛋白与诱导物结合而发生别构，失去与操纵子结合的能力。所以结构基因能转录并翻译成相应的酶。许多参与分解代谢的酶如淀粉酶、纤维素酶都是诱导酶。它们的合成接受诱导调节。（2）酶的阻遏调节 尾产物阻遏 分解代谢产物阻遏（1）尾产物阻遏 生物的生长发育过程中，原以一定速度合成的某些酶，当这些酶催化生成的产物积累到某种浓度水平并能满足需要时，这些酶的合成就会受到阻遏，这就叫反馈阻遏。也叫尾产物阻遏。 这是由于阻遏蛋白在正常情况下不产生阻遏，但它能以酶的产物为效应物（辅阻遏物），并与之结合而发生别构，变为能与操纵子结合而关闭结构基因。 接受这种调节的酶一般是参与合成代谢的酶类。（2）分解代谢物阻遏作用指细胞内同时有两种分解底物存在时，利用快的那种底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。是指某些物质（主要是指葡萄糖和其它容易利用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。又称葡萄糖效应、二次生长现象。当调节基因发生突变时，形成的阻遏蛋白失去与操纵基因结合的能力，结果不管机体内需要与否，总是合成这些酶，这样合成的酶又称为组成酶。控制条件：包括添加诱导物和降低阻遏物浓度。遗传控制：包括基因突变和基因重组。其他方法：添加表面活性剂和产酶促剂等。5、提高酶产量的措施（1）添加诱导物对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导β-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。诱导物一般可以分为3类酶的作用底物诱导物的前体物质作用底物的类似物某些参与分解代谢的胞外酶的催化反应产物也可作为诱导物。（2）控制阻遏物的浓度控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。产物阻遏作用：由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的；分解代谢物阻遏作用：由分解代谢物引起的阻遏作用。 为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。采用其他较难利用的碳源，如淀粉等采用补料、分次流加碳源添加一定量的环腺苷酸（cAMP） 对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。（4）其他提高酶产量的方法 添加表面活性剂 产酶促进剂添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于打破细胞内酶合成的平衡，从而提高酶的产量。将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、特里顿(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如‘新洁而灭’等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。添加产酶促进剂产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶的产量提高1～20倍；添加聚乙烯醇可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度。6、酶的发酵生产的方式 固体培养发酵 液体深层发酵 固定化微生物细胞发酵 固定化微生物原生质体发酵四、酶生产过程的动力学1、酶生物合成的模式细胞在一定条件下培养生长，其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段。通过分析比较细胞生长与酶产生的关系,可以把酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。同步合成型酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系，又称为生长偶联型。属于该合成型的酶，其生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml特点：大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。但不受阻遏调节。例如米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长，在单宁或没食子酸的诱导作用下，合成单宁酶（tanaseEC3.1.1.20）。这类酶对应的mRNA很不稳定。延续合成型酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。合成可受诱导，但不受阻遏调节。该类型的酶所对应的mRNA很稳定。例如，在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养，可以诱导聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）的生物合成。细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml以半乳糖醛酸为诱导物以含有葡萄糖的果胶为诱导物中期合成型该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。受尾产物的阻遏，其对应的mRNA不稳定。细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml例如，枯草杆菌碱性磷酸酶的生物合成模式属于中期合成型。这是由于该酶的合成受到其反应产物无机磷酸的反馈阻遏，而磷又是细胞生长所必不可缺的营养物质，培养基中必须有磷的存在。这样，在细胞生长的开始阶段,培养基中的磷阻遏碱性磷酸酶的合成，只有当细胞生长一段时间，培养基中的磷几乎被细胞用完（低于0.01mmol/L）以后，该酶才开始大量生成。又由于碱性磷酸酶所对应的mRNA不稳定，其寿命只有30min左右，所以当细胞进入平衡期后，酶的生物合成随着停止。滞后合成型此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为非生长偶联型。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。黑曲霉羧基蛋白酶生物合成放线菌素D对产酶的影响细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml酶浓度U/ml酶浓度U/ml30℃22℃不加加入不加加入属于滞后合成型的酶，主要是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。该类型酶所对应的mRNA稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。影响酶合成模式的主要因素： 酶所对应的mRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素。其中，mRNA稳定性好的，可以在细胞生长进入平衡期以后，继续合成其所对应的酶；mRNA稳定性差的，就随着细胞生长进入平衡期而停止酶的生物合成；不受培养基中存在的某些物质阻遏的，可以伴随着细胞生长而开始酶的合成；受到培养基中某些物质阻遏的，则要在细胞生长一段时间甚至在平衡期后，酶才开始合成并大量积累。理想的酶合成模式 在酶的发酵生产中，为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合成模式应是延续合成型。因为属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。 对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程\细胞工程等先进技术,选育得到优良的菌株,并通过工艺条件的优化控制,使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型。 对于同步合成型的酶，要尽量提高其对应的mRNA的稳定性，为此适当降低发酵温度是可取的措施； 对于滞后合成型的酶，要设法降低培养基中阻遏物的浓度，尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶的生物合成提早开始； 对于中期合成型的酶，在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下功夫，使其生物合成的开始时间提前，并尽量延迟其生物合成停止的时间。