离子对色谱法分析食品中的维生素B

／ 盔监鍪 (江苏省微生物研究所) 维生素是维持人体正常代谢功能所必需 的一类有机化合物。人体一般不能合成维生 素，必须从食物中摄取 ，人体对维生素的需求 量不多，但却不能缺步 ，否则会引起新陈代谢 紊乱，影响机体的正常发育，甚至会产生相应 的疾病 ，即维生素缺乏症 维生素 B(V．B)是一类水溶性物质 ，主要 包 括硫胺素 (B )，核黄素(B2)和吡哆素 (B6) 等，及它们的磷酸酯形式lJ_ 用常规的微生物 法 、荧光法和 比色法 ，仅能测定 V．B中单一 成分 ，且手续繁琐0对于某些食物样品，还要 用专门的萃取方法，除去干扰物后才能测定． 过程更加冗长，已不适应科研和生产的需要 ， 因此建立一种简便、快速测定食 品中维生素 的方法是十分必要的 高效液相色谱(HPLC) 为 V．B的测定提供了精确 、灵敏、重复、快速 的可能性，特别是以离子对反相液相色谱法 可一次 同时测定多种 V．B，有 明显 的优越 性。本文简述了近十年来，离子对色谱法在食 品 V．B分析 中的应用，以引起人们的关注。 离 子 对 色 谱 V．B大多是 含 N杂环的有不 同取代基 的水溶性维生素，在 HPLC分析中 ．若用硅胶 吸附色谱法，在对强极性维生素分析 时，往往 需要用强极性的洗脱液，由于在吸附剂表面 产生非匀相影响，容易造成色谱峰的严重拖 尾，用离子交换色谱法 ，需要选择被分离物质 游离与未游离 的最佳平衡 pH条件 ，技术难 度较大 ，采用反相离子对色谱法克服了上述 方法的缺点 ，使分离能顺利的进行 ，实现了多 种 V．B的同时测定，开辟 ．r食 品 V．B分 析 的新途径。 一 、离子对色谱的概念 在一定 01-I值的溶剂 系统 中，V．B可以 解离为带电荷的离子，在此系统中加入一种 与上述相反 电荷的离子，使其形成中性 离子 对 ，用反相柱进行分离，称 V．B的反相离子 对色谱法。 以 V．B 为例，它在 pH3．5时，解离成带 正电荷的阳离 子B ，与流动相中的反离子烷 基 磺酸根 P1C 形成 离子对 P1C B，并呈 中 性 ．可溶于流动相，在反相柱上，实现 j，分离。 二、影响 V．B分离的有关因素 1．离子对试剂：离子对试剂有烷基季胺 盐和烷基磺酸盐二类。前者用于解离带负电 荷的极性化合物 ，后者用于解离带正电荷的 极性 化合物，在 V．B分析 中，主要 选择烷基 磺酸盐类离子对试剂。 随着烷基数 目的增加 ．反离子的疏水性 逐渐增强 ，对各 V．B问的相对保留值 影响亦 较大 。因此可以通过调节反离子的链长，使各 种 V．B达到最大分辨率 2．流动相的选择：流动相 的 pH和组成 对 V．B的分离有很大影响。流动相的 pH依 据分析化合物的离解程度和稳定性 l程V．B 的分析 中，选 择 pH3．5，使 V．B不 同程度 的 解离，其解离强度是 V．B >V．B >V．1 ．井 且 V．B在酸性条件下较碱性条件稳定 流动 相中有机溶剂与水或缓冲液的 比例增大时． V．B离子对的保留值减小 多B 一 ， 往 雠 n ^ Z p ， 品 e 一 _E m 孝 垒 r n‘ ， 耐 一 劈 a — ～ _g～ 一 维普资讯 http://www.cqvip.com 离子对色谱的应用 离子对色谱的实践主要包括样品处理和 色谱分 离两个方面 ，两者是相辅相成不可分 割的整体 样品处理得好．色谱分离就能顺利 地进 行 。 一 、 样 品处理 自然界中 V．B以多种形式存在 V．B．在 动物组织中以聚磷酸酯形式存在，而在植物 中多以游离形式存在。V．B 一般以核黄索一 5。。磷酸酯或核黄 素腺嘌呤二核苷酸的形 式 俘在，并与蛋白质相键台。V．B 主要以吡哆 醛、吡哆胺、吡哆醇和相 应的磷酸酯形式存 在。在食物分析中，应根据食物的种类和待测 V 的形式 ，拟定样品前处理的方法 ，实现一 次萃取同时分析的 目的。 样品处理步骤大体如下： a．酸提取，用 0．JN H：SO 或 HCI提 取， 压热器内 l20℃加热 ，15磅 30分钟 ； b．加木瓜酶处理 ．以除去蛋 白质的干扰 ； c．脱磷酸酯 ，用淀粉糖化酶或酸性磷酸 酶处理，使磷酸酯类 V．B转化成游离形式； 于：游离 V 的测定的样品处理 ，也要视食物 种类而定。肉类食品，一般用以上全步骤 处 理 ；植物类食物 ．可以不加酶处理或只加淀粉 糖化酶；强化食品只用步骤 a就可以了。含蛋 白质的溶液(牛奶)可 加三氯醋酸或过氯酸 ． 随后离心除蛋白质；高脂肪食物，需用 己烷脱 脂，在分析前 ，用 Sep-PakC 等小柱(Waters) 纯化样 品。对于某种游离 v 及其磷酸酯的 测定 ，其样品处理可用步骤 a，V．B 类的分析 可用磺基水扬酸提取 。 ，(此试剂可保护磷 酸酯的形式 ，同时也不影响其他维生素的提 取)，再用阴离子交换树脂进一步提纯。 最近 ，G．Jaumann E4]应 用 HPLC在线 痕 量富集 V．B的技术，通过阀的控 制，将微 量 的 V．B富集在 预柱上，然后将 富集的 V．B 转移到分析柱上，以实现样品处理到分析 的 自动化。 二、色谱分离 利用离子对色谱法分析测定食品中 V． B，主要包括多种游离的 V．B和 V．B及相应 V．B的磷酸酯同时分离测定两方面的内容。 d．加三氯醋酸除酶，加热过滤或离心。对 下表中汇总了有关 V．B的色谱条件。 V．B的 HPLC条件表 参考 V ． B种类 样品类型 样品处理 柱子 流动相 器 文献 强化 0．1M H ．SO 提取 ，压热 Lichrosorb RP8 5mM 烷磺酸钠 ： B一 器加热．调 pH4~6，在 5 冰醋酸 ：四氢呋 uV254n rrl [7] 食品 (M erck)1 m 线 Lichrosobsi 10O柱净化 哺(16：76，5) B1 0．05M H SO 提取，压热 甲醇 t冰醋酸 ：水 米和 器加热 ，用高峰淀粉 u Boadapak Ci (a9：1：60)PIC B uV25,1am Es： 烟酸 米制品 酶和术瓜酶(pH4 ． 5) (Waters公司 ) 和 PIC B 7各 25mi (Niacin) 保温水解 ，过滤 Bl 强化 O ． 1MHCI提取 ．压热器 Bondapak C 乙腈 ：0·01M 一 磷酸缓 答类 冲液 0H7(I2．5：87．5) uv25帅m E8] B2 加热 ，过滤 (Waters公司) 制品 吉 5ram 庚烷磺酸钠 答 用 Ca(OH)z提取．压热 类 器加热 ，阴离子交换剂 Bondapak Ci B 甲薛 ：水(5：95) Niacin uV254nm [6] 食 提纯 ，高锰酸钾氧化， (Waters公司) P1C A(Waters) 日 Seo—Pak Cartridge净化 消毒牛奶 0 ． 1～0．5MHCIO．提取 Lichrc~Dhcr 甲醇 ：0．03M磷酸盐 BR 来加工的 RP-18 5urn 缓冲掖 (082．7)， uV254nm [9] 肝 碱性磷酸酶处理 I25×4mm 4raM宰烷磺酸 B} 速溶巧克 在线预柱 Lichr~orbsi L[chrosorbsi 0．005M 虎烷磺酸钠 ： 力故料 100RPC 富集 100 RPCl B 0．005M 庚烷磺酸钠 ： 267nm 甲薛(55：25t 20) 或 280nm E4] 啤酒 (2×0．41 crr1 (2 ×0．4Icm) 含 Hd d16／1 维普资讯 http://www.cqvip.com 0．01N NaOH加热至 40C B 食 用超声波振荡 5分种 ， 甲醇 ：水 (25：751 ● B 0 ． 0IN HC[中和 ，4000g tt Bondapak C 8 0 ． 005M P1C B6试剂 uV280nm [1I] B 6 离心 5分种，Sep-Pak氧 (9．9 rn rn×30cm) (Waters)，【 己酸 Ni ac Jn 口 化 铝 A小桂 (Waters 口口 公司)过滤 A ：0．033M磷酸钾 ． B 及 食 8raM戊烷磺酸(pH2．2) 桂后荧光 磷酸酯 品 2O w／V磺基水杨酸提 Perkin—Elmer Az：0 033M磷酸钾 ， 衍生法 (PLP@ ： 和 取 ，用 BioRad AG 2×8 ocr．adecy1si】i龃 8ram 戊烷磺酸和 2．5％ 荧光检测 [21 PMP； 生 阴离子交换色谱进 一 步 V／V异丙 醇 pH2．2 PL ； 物 3um．4 6×30mm EeX330n rn PN 制 提取 B：0．033M磷酸钾和 Em × d00nm PM1 口 6．5 异丙 醇 (pH2．2) 口H 室温，线性梯度 B 及其 磷酸酯 u Bondapak CI目 50mM 四丁基铵和 1 uV254nm (ThMP~j． 荧光衢生化 [1O] (30×0 ． 39cm) 泳醋酸(pH4，3) 或荧光 ThDP) 注：①PLP 磷酸吡哆醛； PMP：磷酸吡哆胺 ； PL：毗哆醛； PN 吡哆素 ； PM 吡哆胺 ②ThMP：一磷酸硫胺 ；"PhDP：二磷酸硫胺 V．B的离子对色谱 以反相 C． 键合硅胶 柱为主 流动相为含有离子对试剂的各种不 同 pH值 的溶剂系统，一般认 为离子对试剂 的最佳浓度在 0．005M，离子对 试剂的种类 由所分离 V．B的化学性质决定，可以用一种 或几种组合，以达到各组分问的最佳分离。如 烟酸分子中有酸和碱性基团，可 以用烷基磺 酸盐或季胺盐类离子对试剂tS-~l 流动相的 pH可用磷酸、醋酸、甲酸等调节；简单的 V．B 分离用正常洗脱即可实现，对复杂样品可考 虑梯度洗脱。常用紫外检测器 ，波长在 254 280nm．在 280rim 处 ，V．B-和 V．B 的吸收值 大于 254nm，V．强 则相反；也可荧光与紫外 检测器同时使用 ，提高 V，Bz的检测灵敏度； 用紫外检测器虽然灵敏度差些 ．但样品制备 较简单 可以避免用荧光检测的衍生化处理 (有荧光吸收的 V．Bz除外)，如 V．B 的荧光 检测必须将其氧化成硫色素 而 V．Be必须 进行重氮衍生化。 总之，反相离子对 色谱法分析 V．B．可 一 次萃取．同时测定多种V．B成分，干扰小． 是一种简 便、灵敏、快速 的方法 ，比经典 的 AOAC方法更为省时 、省力 主 要 参 考 文 献 [I]南京药学院主编 ；《生物化学》，】979，人民卫 生出版社 ，48~69 [2j Jesse F．G 1 985，33，359～ 365 [3]Vanderslice J T．，et a1．：J．Agric．Food Chem． 1980．28．】1 45 [4]．1anumann G et al；Chromatographia．1 985 20．6l5～ 6l7 [5qToma R-B．et a1．：J．Food Se1．，I 979．44．263 [6]Ty】 T A．et a【． 3．269 F7]Hensha]t A．；In Liquid Chton~tographic Anal,．, s【s of Food and Beverage．】979，1，P．3l [8]Kamma13 J．F．et a1．：f．Food Sci．，1 980， ， 】497 [9]Bi~ch R et a1．{J．Chromat．．1989．,163，207 ～ 21I [j O Gubler J．I ec al{《Methods in Enzymoiogy Voi．62．Edited by I)~maid B．M． and LemueJ D．W ．． 1979．P．63～ 68 [I 1 李明元主编；《高敏液相色谱法 及其在食 品 分析中的应用#，1988，北京大学出版社 ．1 62一一：6．1 维普资讯 http://www.cqvip.com