[doc] 益气化瘀方及其拆方对脑梗死大鼠脑组织微血管密度的影响

[doc] 益气化瘀方及其拆方对脑梗死大鼠脑组织微血管密度的影响 益气化瘀方及其拆方对脑梗死大鼠脑组织 微血管密度的影响 2007年9月第9卷第3期 september.2007,Vo1.9,No.3 湖北中医学院 JournalofHubeiCollegeofTCM?25? 益气化瘀方及其拆方对脑梗死大鼠脑组织微血管密度的影响 黄丽,王渝,高铁祥 (1.湖北中医学院基础医学部实验教学示范中心,湖北武汉430065;2.湖北中医学院2005级硕士研究生,湖北武汉430065) 摘要:目的观察益气化瘀方及其拆方对脑梗死大鼠脑组织微血管密度(MVD)的影响.方法动物造模分组, 并给予相应治疗,采用免疫组化法检测大鼠脑组织CD31蛋白表达情况.结果各治疗组与空白对照组和假手术组比 较均有非常显着性差异(P<0.05,P<0.01);益气组与化瘀组比较有显着性差异(P<0.05).结论益气化瘀方及 其拆方均有促进脑梗死大鼠脑组织半暗带区新血管形成的作用. 关键词:益气化瘀法;对比研究;脑组织;微血管密度 中图分类号:R2—05:G64文献标识码:A文章编号:1008—987X(2007)03—0025—02 TheEffectoftheTherapyofSupplementingQiandResolvingStasis andItsSeperatedTherapiesOnBrainTissueMicrangium sufferingMice DensityofBrain—infarction— HUANGLil,WANGYu2,GAOTiexiangl (1.HubeiCollegeofTraditionalChineseMedicine;2.Grade2005Postgraduate, HubeiCollegeofTraditionalChinesesMedicine,Wuhan,Hubei,430061) Abstract:Objective:ToobservetheeffectofthetherapyofsupplementingQiandresolvingstasisanditsseparatedtherapieson micrangiumdensityofbrain—infarction—sufferingmice(MVD).Method: Themodelmicearedividedintodifferentgroupswith relevanttreatmentandimmunohistochemicalmethodisadaptedtoexaminetheproteinexpressionofCD31ofratsbraintissues. Conclusions:Thereexistsverysignificantdifferencebetweenthetreatmentgroupsandcontrolgroupandtheoperationgroup.(P <0.01,P<0.05);thereexistssignificantdifferencebetweenthegroupofsupplementingQiandthegroupofresolvingstasis (P<0.05).Conclusions:ThetherapyofsupplementingQiandresolvingstasisanditsseparatedtherapiesallhavethefunction ofimprovingthenewvesselsformationofhalfdarkbandareaofthebraintissuesofthebrain—infarction—sufferingmice. Keywords:TherapyofSupplementingQi;TherapyofResolvingStasis;Com parativeresearch;Braintissues;MVD 在血管新生的研究中,微血管密度(MVD)是普遍采用的1.2药物 能够较直观和有效反映新生血管的数目和侧枝循环建立情况的益气化瘀方由黄芪15g,人参,地龙,土鳖,当归,川芎 指标.血小板一内皮细胞粘附分子(PECAM一1,CD31抗原)各10g,水蛭5g等组成.加水500ml浸泡30min,武火煎煮沸 广泛分布在血管的各种细胞上,因此将其作为内皮细胞的特异腾后改用文火加热30min,收取药液,再加水500ml如上法煎 性标记物,通过免疫组化来定量反应组织中微血管密度已经被煮,去药渣后用滤纸过滤,将两次药液混合加热浓缩至70ml. 广泛采用….在本实验中,我们运用免疫组化法检测大鼠脑组制备成100%的水煎液,即1ml药液含生药1g.其中黄芪,人 织CD31蛋白表达情况,探讨益气化瘀方及其拆方对脑梗死大参构成益气方,余药构成化瘀方. 鼠MVD)的影响.1.3动物造模 1材料与方法取清洁级3月龄SD大鼠90只(由华中科技大学同济医学 1.1试剂,院动物学部提供),体重(250—300)g,雌雄各半.大鼠经1 兔抗大鼠内皮细胞粘附分子,羊抗兔SABC试剂盒(即用周后适应性饲养后,随机选取8只为空白对照组,剩余82只 型),DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司.按照文献方法…复制MCAO大鼠模型.选市售尼龙鱼线,直径 n02MPBS(PH7.2—7.6):1000ml蒸馏水中加氯化钠9g,0.20—0.26mm,长3.0cm,头端去棱角使其光滑,并距头端 Na2I-IPO4?12H207g,Na2HPO4?2H200.5g.n01M枸橼酸盐缓冲18mm处作一标记,酒精清洁后置生理盐水中备用.大鼠用 液:1000ml蒸馏水中加枸橼酸三钠(cH5Naz07?2H2O)3g,枸10%水合氯醛按300mg/kg剂量腹腔注射麻醉,仰卧固定于手 橼酸(cI()7?H20)0.4g.4%多聚甲醛PBS缓冲液:多聚甲醛术台上,行颈正中切口,从两侧颌下腺之间剪开浅筋膜,显露 40g,加人n1MPBS500ml,混合加热至60~C,滴加lmoL/LNaOH左侧胸锁乳头肌,钝性分离皮下组织和肌层,暴露左颈总动脉 至清亮,冷却后加PBS至1000ml.麻醉用10%水合氯醛.(CCA)分叉及颈外动脉(ECA),颈内动脉(ICA),结扎左 基金项目:湖北省教育厅资助项目,[Q2OO516015]. 作者简介:黄丽(1971一),女,湖北中医学院实验师. 通讯作者:高铁祥,湖北中医学院教授,硕士生导师.电话:027—68890084,E—mail:tiexiang昏a.@163.c【)m. ? 26?湖北中医学院2007年第9卷第3期 ECA,随后暴露ICA颅外段唯一分支翼腭动脉(PPA),并将其 根部置一动脉夹,暂时夹闭PPA,以免导线误入PPA;结扎左 侧CCA近心端,将准备好的栓线从左CCA近端插入,经CCA 分叉处进入ICA,当有轻微的阻力时停止,尼龙线插入深度由 分叉部计18.5?0.5ram.此时,栓线头端已达大脑前动脉 (ACA)近端壁,即将大脑中动脉(MCA)起始部堵塞,并同 时阻断来自ICA,ACA,大脑后动脉(PCA)侧枝的血流;结 扎左CCA远心端以固定钓鱼线,退出针头,逐层缝合皮肤.其 中8只为假手术组,栓线进线深度为10ram,即未向ICA内插 栓线.术后,腹腔注射青霉素10万u,2次/d,连续3d,预防 感染.术后室温控制在26—30~C. 1.4大鼠神经功能缺损评分标准 大鼠清醒后,观察其行为学变化,神经症状按Longa5级4 分制【2评分.评分标准:无神经功能损伤症状,0分;轻度神 经功能损伤(动物前爪不能完全前伸),1分;中度神经功能 损伤(动物向瘫痪侧转圈),2分;严重神经功能损伤(动物 向瘫痪侧倾倒)3分;不能自发行走或意识昏迷,4分.大于 或等于2分为有效模型. 1.5动物分组及给药 90只大鼠,8只为空白组,8只为假手术组.大鼠经造模 后,死亡大鼠37只,神经症状评分小于两分的2只.将造模 成功的存活大鼠随机分为模型组8只,益气化瘀组,益气组, 化瘀组各9只.各治疗组给予相应的药物,给药时间均为10d, 空白对照组,模型组,假手术组均以等量生理盐水灌胃. 1.6标本取材及组织切片 实验第11天取材.将大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉 (o.3mi/100g体重),剪开胸腔暴露心脏,用灌注针头刺人大鼠 心脏左心室,通过心脏灌注生理盐水150ml,然后以4%多聚甲 醛PBS缓冲液30Oral灌注固定,灌流维持20rain,灌注效果以 动物头颈坚硬如实木质地为佳.此时,迅速断头取脑,将脑组 织置入4%多聚甲醛PBS缓冲液36h,行外固定.冠状切片厚 2mm,切6片,取白头向尾端的第4片,采用常规方法制成 5m厚的脑切片.取上述切片作VEGF染色. 1.7检测方法与步骤 按ABC法常规步骤操作.在作特异性显色的同时,设 阴性替代片和空白对照显色. 1.8结果判定 微血管判定及计数方法按Weidner方法进行:先在低倍 镜(×40倍)扫描整张切片,寻找高血管密度的区域为”热 点区”.然后在2OO倍视野下计数每个”热点区”的微血管数 目.任何被CD31抗体染成棕黄色细胞或细胞簇均可以作为一 个血管来计数.计数3个热点的微血管数,选择两次相同或相 近数目,取其平均数来表示微血管密度(n×400倍).微血管 的判定不以红细胞的出现来确定是否血管,即使未显示管状结 构,只要它们邻近的微血管,细胞或其他结缔组织分开,就可 以作为一个血管来计数. 1.9统计学处理 实验数据以均数4-标准差(x4-S)表示.采用计算机统计 软件SPSS10.0进行统计分析. 2结果 CD31蛋白阳性表现为细胞浆出现棕黄色染色,主要在表 达缺血半暗带区或相当处的内皮细胞.各组大鼠脑组织MVD 比较见表1. 表1各组大鼠脑组织CD31免疫阳性MVD比较(x?5) 与假手术组,空白组比较,P<0.01;与模型组比较,#P< 0.05;##P<0.Ol;与化瘀组比较,?P<0.05. 3讨论 目前,在血管新生的研究中,比较常用的反映微血管密度的 血管己物有三种:第?因子相关抗原(vWF),CIY34,CD31. 其中CD34和CD31较vWF更为敏感,是目前较常用的两种血管新 生标志物.CD34原为造血干细胞抗原,后证实可在正常及新生的 血管内皮细胞中表达,目前认为CD34是最敏感的血管内皮细胞表 面标志].CD31主要由内皮细胞及淋巴结中分化期的单核细胞 分泌,是存在于血管内皮和血小板中的一种糖蛋白,也是内皮细 胞的一种特异性标记物.CIB1虽然没有ClY34敏感,但是因为 CIYM在所有的血管内皮细胞中着色,所以经CD34染色后计数的 微血管密度与临床参数的相关性不高”J,因此,在本实验中,我 们选择了运用免疫组化法来测定CIB1的表达情况来反映祛瘀生新 方对大鼠脑组织MVD的影响. 从实验结果来看,各治疗组CD31免疫阳性MVD比空白 组,假手术组和模型组均有所增加.表明各治疗组均有促进脑 梗死大鼠脑组织半暗带区新血管形成的作用.特别是益气化瘀 组,祛瘀组增加尤其明显. 参考文献: [1]MartiHJ,BemaudinM,BellailA,etaLHypoxia—inducedvascular endothelialgrowthfactorexpressionprecedesneovaseularizationafter cerebralischemia[J3.AmJPathol,2000,i156(3):965-976. 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