纳豆激酶液体发酵条件的优化
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纳豆激酶液体发酵条件的优化
熊晓辉 梁剑光 熊 强
(南京工业大学制药与生命科学学院,南京,210009)
摘 要 以纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus s btillis natto,BSN)为实验菌株,对其液体发酵生产进行 l
了研究。实验考察了发酵条件(温度、接种量、起始pH、装液量)和培养基成分(碳源、氮源、金属离 {
子等)对纳豆激酶产量的影响;在优化发酵条件和培养基的基础上,进行了5L发酵罐放大实验,产 I...
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纳豆激酶液体发酵条件的优化
熊晓辉 梁剑光 熊 强
(南京工业大学制药与生命科学学院,南京,210009)
摘 要 以纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus s btillis natto,BSN)为实验菌株,对其液体发酵生产进行 l
了研究。实验考察了发酵条件(温度、接种量、起始pH、装液量)和培养基成分(碳源、氮源、金属离 {
子等)对纳豆激酶产量的影响;在优化发酵条件和培养基的基础上,进行了5L发酵罐放大实验,产 I
酶量为 2250IU/mL。 l
关键词 纳豆芽孢杆菌,纳豆激酶,液体发酵
1987年,日本的须见洋行从纳豆中提取出 物制品检定所制备;尿激酶:南京大学药业有
一 种具有溶血栓功能的物质,定名为纳豆激酶 限责任公司产。
(NattokinaSe,简称 NK)⋯。研究
明[引,NK 1.2 培养方法
具有纤溶活性,可治疗和预防血栓病,还可激活 1.2.1 BSN种子制备
纤溶酶原,从而增加酶源性纤溶酶的量与作用。 挑取斜面种子接入装有50mL种子培养基
目前常用及有待开发的治疗血栓病的药 品 的250mL三角瓶,30"C振荡培养 18~20h。
有[3】:链激酶(SK)、尿激酶(UK)、重组组织纤 1.2.2 发酵培养
溶酶原激活剂(t-PA)和尿激酶原(pro-UK)等, 将种子接入发酵培养基中,振荡培养,按设
但它们均在不同程度上存在一定的缺陷,或者 计进行实验。
毒性强、副作用大,或在体内半衰期短,或来源 1.3 测定方法
紧缺、价格昂贵,而 NK有望弥补这些不足,具 1.3.1 纳豆激酶的酶活测定方法
有较大的开发潜能,成为新一代抗栓药物【4]。 依据(中华人民共和国卫生部 WS-Oll(X-
本文以本实验室所保存的纳豆枯草芽孢杆菌 006)95)关于“蚓激酶的部颁标准”中“尿激酶琼
(Bacillus subtilis natto,BSN)生产 NK的液体 脂糖——纤维蛋白平板法”进行测定。
发酵条件进行优化,为 NK的产业化奠定基础。 (1)将牛纤维蛋白原溶解于 pH7.4磷酸盐
1材料与方法 举 昱蓑嚣 旱
1.1 材 料 7.5单位/mL的溶液。
1.1.1 菌种与培养基 (2)琼脂糖一纤维蛋白平板制备:取 1%琼
菌种:纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 脂糖溶液 20 mL,先在水浴 5012恒温 10~15
natto,BSN),本实验室保存。 min,然后将牛纤维蛋白原 15 mL在 50"C水浴
种子培养基(%):蛋白胨 1,牛肉膏 0.5, 中恒温 5~10 min,待两者温度一致时,将凝血
NaC1 0.5,pH 7.0~7.2。 酶 1 mL和牛纤维蛋白原 15 mL与琼脂糖溶液
发酵基础培养基(%):葡萄糖 1,蛋白胨 1, 迅速混匀,立即倒平板,凝固备用。 {
K2HPO4 0.25,KH2PO4 0.1,pH 7.2~7.4。 (3)发酵液经离心后,取上清液,适当稀释 l
1.1.2 主要试剂 后即为粗酶液。加样 10 L于琼脂糖一纤维蛋
牛纤维蛋白原和凝血酶:均为中国药品生 白平板上,同时以一定单位的标准尿激酶作对
第一作者:博士研究生。副教授。
收稿时间:2003—06—16。改回时间:2003—08—21
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现虽然碱性如 pH8.0比中性条件利于菌体生
长,但不利于产酶。因而选择起始 pH7.0为
宜。
照,放置 37"C恒温反应 18h。观察测定溶圈的
直径将其与尿激酶标准品相比较,得出 NK酶
活(相当于尿激酶)单位(IU/mL)。
1.3.2 发酵液中蛋 白质含量的测定
考马斯亮蓝法[ 。以 BSA做标准蛋白曲
线,测定发酵液的 OD595mn值,得到发酵液蛋白
质含量(mgTmL)。
1.3.3 残糖测定
DNS法 J。
1.3.4 生物量的测定
光密度法[引,于 OD660Ⅲn测定。
2 结果与分析
2.1 发酵条件对纳豆激酶产量的影响
2.1.1 温度对纳豆激酶产量的影响
从图 1中可以看出,纳豆激酶发酵的最适
温度为 30"C;过低则不利于细菌的生长,过高
又不利于产酶,且酶在过高温度下极易失活。
2'200
18O0
宅 l400
呈 1000
藿8O0
40O
0
25 30 32 35
温_l童,℃
图 1 不同温度对纳豆激酶产量的影响
2.1.2 接种量对发酵产酶量的影响
分别接入 1.5%,2%,3%,5%的种子培养
液到发酵基础培养基当中,使其发酵 3 d,测定
各酶活。从图 2可知,接种量对产酶量有一定
的影响,接种量为 2%时,产酶量最高,接近 2
100Iu/mL。接种量太少或太多,都会影响菌
体的生长及酶的产量。因而纳豆激酶产量最高
时的接种量为2%。
2.1.3 起始 pH值对发酵产酶的影响
调节起始 pH至 5.0~10.0,接入 2%的种
子液,发酵 3 d后测定酶活,结果如图 3所示。
当起始pH为7.0时,产酶量最高,偏酸性或偏
碱性均不利于 NK的发酵。实验过程中,还发
曩
1 1.5 2 卫5 3 3.5 4 4.5 5
接种量,%
图2 不同接种量对发酵产酶量的影响
{
垂
图3 起始 pH值对发酵产酶的影响
图 4 不同装液量对 NK发酵的影响
2.1.4 不同装液量对发酵产酶的影响
500mL的三角瓶中分别加入 50、100、150、
200、250 mL的发酵培养基,培养 3 d后测定
0D660mn及酶活,其结果如图 4。从图 4中可
知,随着装液量的增加,不论是生物量还是产酶
量都呈下降的趋势,说明纳豆菌是好氧菌,提高
溶氧量有利于其生长及产酶。
2.2 发酵培养基的组成对 NK的影响
2.2.1 不同碳源对发酵产酶量的影响
(6a)
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翻嚏
选择葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木糖,可溶性淀
粉及甘油作为碳源,浓度为 2%,甘油为 4 mL/
100mL。其他发酵条件相同,分别在 2~6 d测
定各酶活,其结果如表 1。以葡萄糖为碳源最
高产酶量出现在第 3和第 4天;以蔗糖和木糖
为碳源最高产酶量出现在第 4天;可溶性淀粉
的最高产酶量出现在第 3和第 4天,为 2 333
IU/mL,无论经济上,或发酵周期长短来看可
溶性淀粉都是可取的,因而选择其为最佳碳源。
用甘油作碳源时,从第 2~6天,NK量上升缓
慢,发酵周期较长,发酵液较粘稠,不利于供氧,
故不宜做为碳源。这与 日本竹内尚等人【7]的
报道不一致,可能是菌株不同所致。
表 1 不同碳源对纳豆激酶的影响
2.2.2 可溶性淀粉浓度的确定
确定可溶性淀粉为碳源后,比较其以 1%
~ 5%几个浓度对产酶的影响,分别于第 2、3、
4、5天测定发酵产酶,结果如图5。
图 5 可溶性淀粉质量分数对
发酵产酶的影响
从图5可见,不同浓度的可溶性淀粉,第 2
天的产酶量无差异,且产酶量均在第 3天或 4
天达到最高值。比较可溶性淀粉质量分数为
2%,396,496时产酶量相差不大,5%的可溶性
淀粉在第 4天达到最大值,而且黏度很大。同
时也说明高浓度的淀粉对 BSN产酶无抑制作
(64)
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时,产酶下降很快。这是因胰胨浓度过高,抑制
BSN生长,导致产酶量较低。
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选择 K 、Na 、ca2 、Mg2 、Fe2 、Mn2 、
Cu2
.其浓度均为0.002 mol/L。考察几种金
2.2.5 金属离子对发酵产酶的影响 属离子对发酵 NK产量的影响,结果如表 2。
表 2 几种金属离子对菌体生长和产酶的影响
从表 2可以看出,ca2 、M 对发酵产
NK有利,K 、Na 对 NK基本没有影响;加入
Fe2 、Cu2 发酵液无 NK活性,可能是其使 NK
失活,或抑制菌株产酶;而加入 Mn2 也使 NK
活性降低。可在发酵培养基中加入 一定的
ca2 、Mg2 提高产量。同时,加入ca2 、Mg2
也利于菌体生长,但各金属离子对 NK激酶的
合成起关键作用。
2.2.6 正交实验优化发酵培养基的组成
在分析发酵条件以及单因素如氮源、碳源
的基础上,选择可溶性淀粉为碳源,胰胨为氮
源,同时考察 Ca2 和 Mg2 对纳豆激酶的影响,
设计了正交实验,见表 3。所得结果如表 4所
示。从中可知,R值的大小分别为 B>C>A>
D,各因素适宜的配比为 A2B2C2D1。氮源的浓
度和 Ca2 浓度对发酵产酶影响较大,碳源的浓
度次之。而表中没有按 A2B2C2D1的配比,需
要做补充实验加以证实。最终酶活为2358Iu/
mL,说明该配比确实为最适产酶培养基。综合
各个方面的因素,以 A2B2C2D1配方为基础,确
立了以BSN发酵生产 NK激酶的适宜培养基
组成为:可溶性淀粉 2%,胰胨 0.5 96,CaCI,
0.0296,酵 母 膏 0.296,K2HP04 0.25 96,
K1-12PO4 0.1 96,pH7.0。
2.2.7 纳豆激酶 5L发酵罐放大实验
以优化后的发酵培养基、发酵条件进行发
酵放大实验,5 L的发酵罐配置发酵培养基3 L.
表3 正交实验设计
表 4 正交实验结果
实验号 A B c D NK酶活
.
/IU·mL一
接种量为2%,转速为 180 r/min。实验结果表
明,BSN在 5 L发酵罐上的生长无明显的延滞
期,在发酵罐里菌体生长较快,发酵周期缩短近
1 d。残糖含量迅速下降,从 3.31%下降到
0.54 96。pH值是先下降后缓慢上升,最后与初
始值接近。检测发酵液的酶活,60 h时的酶活
达到最高 2250Iu/mL。与摇瓶发酵比较,发酵
产酶有所提前,到 60 h可以认为发酵结束。
3 结 论
(1)优化后的发酵培养基最佳组成配方为:
可溶性淀粉2%,胰胨 0.5 96,CaCI20.02%,酵
母膏 0.2%,K2HP04 0.25 96,K1-12PO,0.1 96,
pH7.0。
(2)纳豆菌的摇瓶发酵产酶最佳温度为
30℃,在转速 150 r/min条件下,装液量为 100
mL/500 mL,接种量 2%,适宜纳豆激酶的生
产。
(3)在优化发酵条件和培养基的基础上进
行 5 L发酵罐放大实验,纳豆激酶产量达 2 250
( )
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市场动态
我 国番茄昔 出口价格攀升
由于2003年我国番茄产量大大低于预计水平,且同期世界其他主要番茄酱生产国产量也出现下滑,我国番茄
酱出口价格迅速攀升。
据我国番茄酱加工企业反映,2003年新疆开春比较晚,而且还受到低温、雨水和大风天气的影响,番茄收获期
推迟。番茄成熟度不够。预计 2003年的番茄产量和加工量不会超过 2002年的水平,产量约为270万 t。
由于番茄成熟度不够,固形物含量低,使得加工成品率下降,我国新疆等番茄主产区前期普遍出现原料供应紧
张。工厂开工不足的情况。同时,欧洲主要番茄酱生产国意大利、西班牙和希腊普遍受到高温和干旱天气的影响,
番茄减产幅度也比较大。
由于国际市场番茄酱供应不足,我国番茄酱出口价格迅速上升。来 自加工企业的消息称,9月初,我国36%/
38%浓度番茄酱出口价格已经达到 600美元/t(FoB),28%/30%浓度的番茄酱出口价格达到 550美元/t(FoB)。
在国际市场上,几个主要番茄酱生产国之间依然存在价格差距,中国的产品有一定的价格优势,美国、土耳其
和欧il}l产品的价格则相对较高。
中国和美国的产品受汇率变化的影响要大于其他影响(如包装、运输和付款条件等)。中国番茄酱在意大利南
部(用于再加工)、俄罗斯和东南亚等市场的份额快速增长,并且逐步向中欧、中东和中亚等地扩展。
根据中国海关统计,2002年,我国出口番茄酱 37.3万 t,创汇1.89亿美元。2003年 1~8月,我国番茄酱出口
量为 16.58万 t,基本与去年持平。按照这一发展趋势,预计今年出口量与去年相比变化不大,或略低于2002年。
英国<食品新闻>最新报道,2003年全球番茄酱产量约为2 6O0万t,与已签
之间存在 300万t的差量。
预测显示,欧洲最大的番茄酱产地意大利2003年的番茄产量将比预期减少 30%~40%。意大利北部主产区 !
的新鲜番茄价格 已经由最初的87欧元/t上涨到了98欧元/t。世界另一大番茄主产 区美国加利福尼亚州2003年
的番茄产量将不足 1000万 t,至少比预期下降50万 t。美国番茄酱 2002年在欧洲市场的销量不错,但是欧洲买家 :
近日表示,由于美国番茄酱价格较高,他们可能会减少采购量。 ;
、 H * H * H H * H ∞ H ●_日 _ _ _目 H ∞ H * H ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯
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