雷洛昔芬通过促进一氧化氮释放诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化(可编辑)
雷洛昔芬通过促进一氧化氮释放诱导脂肪干细胞向成
骨细胞分化
??
24?? 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin
2011Jan;27 1 :24,8
雷洛昔芬通过促进一氧化氮释放
诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化
卢 翔,陈江宁,张峻峰
南京大学生命科学院生物医药国家重点实验室,江苏 南京 210093
中国图书分类号:R一332;R329(21;R329(24;R977(12
力及其机制。
文献标识码:A 文章编号:1001―1978 2011 O1―0024―05
1 材料与方法
摘要:目的 探讨雷洛昔芬诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化
1(1 材料
作用及其机制。方法 从大鼠体内提取分离脂肪干细胞,并
1(1(1 实验动物 sD大鼠,早,体质量 200?20
进行多向分化能力鉴定。在成骨诱导培养液中加入不同浓
g 维通利华动物试验中心,合格证编号:SCXKI1―
度雷洛昔芬 0、0(01、0(1、1Ixmol??L 、非选择性一氧化氮
00―0009 。
合成酶抑制剂 一硝基精氨酸甲酯 L―NAME 1mmol??
1(1(2 试剂与药品 雷洛昔芬 raloxifene,Ra1 由
L 、雷洛昔芬 1txmol??L +L―NAME 1mmol??L ,
山东银飞达药业有限公司提供。DMEM Dulbecco,S
在共同条件培养14―28d,测定各项成骨细胞形成指标。结
modifiedEagle,
fetalbo― Smedium 培养基、胎牛血清
果 雷洛昔芬 0(01―1l~mol??L 能明显提高脂肪干细胞
胞质一氧化氮的释放和成骨细胞分化标志基因 碱性磷酸
vinesertlm,FBS 、青 一链霉素溶液、十二烷基磺酸
酶、骨形态发生蛋白2和I型胶原 的表达以及矿化结节的
钠 SDS 购自美国 Gibco公司;维生素 C vitamin
生成,一NAME可以拮抗雷洛昔芬引起的胞质一氧化氮的释
C 、3-磷酸甘油
3-glycerophosphate 、地塞米松
放,并同时抑制雷洛昔芬诱导脂肪干细胞向成骨分化的作
dexamethasone 、II型胶原酶 typeIIcollagenase 、
用。结论 雷洛昔芬可以促进胞质一氧化氮释放,从而诱导
胰蛋白酶 trypsin 、溴
― 化甲基噻唑基四唑 methythi
脂肪干细胞向成骨细胞分化。
azolyltetrazoliumbromide,MTT 、茜素红 alizarin 购
自美国Sigma公司;BMP2、Col―I抗体购自武汉博士
关键词:雷洛昔芬;脂肪干细胞;多向诱导分化;成骨分化;一
德生物技术有限公司。TRIzol购自美国 Invitrogen
氧化氮;细胞增殖
公司。碱性磷酸酶 alkalinephosphatase,ALP 试剂
盒购自南京建成生物技术研究所;PCR引物由In(
长期的雌激素补充治疗可以改善妇女更年期骨
质流失以及降低骨折发生的几率,但同时可增加乳
vitrogen公司合成。用于逆转录和PCR的分子生物
腺癌的风险?J。选择性雌激素受体调节剂 selec( 学试剂全部购自Et本 TaKaRa公司。一氧化氮 ni(
tricoxide,NO 试剂盒购自碧云天生物技术研究所。
tiveestrogenreceptormodulator,SERM 雷洛昔芬
raloxifene,Ra1 为一种非类固醇类、苯噻酚化合物, 其他相关试剂均购买自南京生兴生物有限公司,均
为国产或者进口分析
纯。
由于其对骨骼具有保护作用,对乳腺和子宫内膜无
1(1(3 主要实验仪器
和设备 电子天平 德国
刺激作用,已被批准用于绝经后妇女骨质疏松的预
防和治疗。雷洛昔芬除了可以预防和治疗绝经后妇
;离心机 美国Eppendorf公司 ;紫 Sartorius公司
女的骨质疏松症,增加骨密度,还能降低乳腺癌和子 外分光光度计 深圳爱克分析仪器有限公司 ;CO。
宫内膜肿瘤的风险、动脉粥样硬化形成指标以及心 恒温培养箱 上海华明医化器械厂 ;2934型倒置相
血管疾病发生的可能 。J。但此种化合物调节成骨
差显微镜 COIC公司 ;
ModeB50酶联免疫检测仪
分化作用、机制目前仍不甚明了 J。本实验通过雷 日本 BIO―RAD公司 ;PCR仪 日本 BIO―RAD公
洛昔芬介导的大鼠脂肪来源的间充质干细胞体外培
司 ,HNZ一1(1F垂直流形超净工作台 南通沪南科
养,探讨雷洛昔芬诱导脂肪干细胞向成骨分化的能
学仪器有限公司 ;培养板 Coming―Costar,NY,美
国
收稿日期:2010,10―08,修回日期:2010―11―23
1(2 方法
基金项 目:国家 自然科学基金资助项目 No30771036
1(2(1 细胞培养 断颈处死大鼠,提取腹股沟脂肪
作者简介:卢 翔 1980一 ,男,博士生,研究方向:药理学 ,Tel:025-
组织。按文献l6一中的方法,提取脂肪干细胞,将5
83596594,E―mail:kakabb@ 163(eom;
―
ml的细胞以2×10cells??L 的密度接种于培养瓶
张峻峰 1968一 ,男,博士,教授,研究方向:药物靶向性
治疗与药理学,通讯作者 ,E-mail:j~hang@nju(edu(cn
中,48h后换液,待细
,汇合时,用0(25,胰 胞达80
国药理学通报 ChineSePharmacologicalBulletin
2011Jan;27 1 ??25??
蛋白酶 含0(02, EDTA 传代,传至第3代备用。
GACAATCTTGAGGGA(3。PCR程J字如 下:95cIC5
1(2(2 脂肪干细胞多向分化能力的鉴定 取第3 min;95oC变性30S,55oC退火30S,72?延伸30
S,30个循环;72cc10min。
代脂肪干细胞以10cells??L 的密度接种于6孔
板,每孔2ml培养液,待细胞达80,汇合时,进行诱 1(2(5 细胞内碱性磷酸酶 ALP 活性测定 将脂
导分化。脂肪诱导分化步骤:加人 10, FBS的高糖 肪干细胞以10cells??L 的密度接种于6孔板中,
DMEM培养基 含1p~mol??L 地塞米松、0(5mmol 每孔2ml完全培养基,待细胞达80,汇合时,换成
??
L,IBMX、1mg??L 胰岛素、0(2mmol??L 吲哚 成骨诱导培养基,进行成骨诱导。实验分组同
美辛 ,培养2d;2d后换成只含 10mg??L 胰岛素 “1(2(3”。诱导 14d后,弃培养液,PBS洗3次,用
的10,FBS的高糖DMEM培养基继续培养2d;之 试剂盒对 ALP进行定量分析。用考马斯亮蓝测定
后换成完全培养基 高糖 DMEM+10, FBS 继续 细胞裂解液中蛋白质含量。ALP活性表示为:mmol
??rain, ??g,Protein。
培养 1周。油红染色鉴定脂肪分化。
1(2(6 免疫细胞化学检测 Ra1对脂肪干细胞 BMP2
成骨诱导分化步骤:用成骨分化诱导培养基含:
10mmol??L―B(甘油磷酸钠、50p~mol??L 的维生
和 Col―I的合成 将脂肪干
s??L 的 细胞以 10 cell
素C、0(1p,mol??L 的地塞米松培养28d,Vonkos- 密度接种于6孔板中,每孔 2ml完全培养基,待细
sa染色鉴定成骨分化。 胞达80,汇合时,换成成骨诱导培养基,进行成骨
软骨诱导分化步骤:用软骨分化诱导培养基含: 诱导。实验分组:Ral组 0(1p~mol??L。 、Ral 0(1
10 g??L_。TGF―B1、6(25mg??L 胰岛素、0(1 mol p,mol??L +L―NAME 1mmol??L 组、1mmol??
??
L,L(NAME组、对照组 Con,加入相应浓度的DM(
L 地塞米松和50nmol??L 维生素C培养21d,
SO 。诱导14d后,弃培养液,PBS洗3次,对BMP2
甲苯胺蓝染色鉴定软骨分化。
和Co1(I蛋白进行免疫细胞化学染色。
1(2(3 细胞内一氧化氮的测定 将脂肪干细胞以
1(2(7 钙化结节的测定 将脂肪干细胞 以 1O
5×10cells??L 的密度接种于48孔板中,每孔 1
cells??L 的密度接种于24
1ml完全 孑L板中,每孔
ml完全培养基,待细胞贴壁后,加入Ral及相应的
培养基,待细胞达80,汇合时,换成成骨诱导培养
抑制剂。实验分组:Ral组 0(O1、0(1和 1 mol??
L 、Ral 0(1Ixmo]??L + 一NAME 1mmol?? 基,进行成骨诱导。实验分组同“1(2(6”。诱导28
d后,弃培养液,PBS洗3次,茜素红染色。
L 组、1mmol??L,L-NAME组、对照组 control,
1(2(8 MTF检测雷洛昔芬对脂肪干细胞增殖的影
Con,加入相应浓度的DMSO 。待细胞达80,汇合
响 将脂肪干细胞以10cells??L 密度接种于96
时,弃上清,PBS洗3次,胰蛋白酶消化细胞,超声裂
解。用一氧化氮检测试剂盒 Griess法检测细胞胞质 孔板
中,每孔200 l完全培养基。实验分组:Ral
组 0(01、0(1和 1p,mol??L 、对照组 Con,加入
中硝酸盐亚硝酸盐浓度,间接反映一氧化氮释放量。
相应浓度的DMSO 。分别在加
、3、5、 药处理后 d1
用考马斯亮蓝测定细胞裂解液中蛋白质含量。一氧
7、9进行 MTF实验。
化氮释放量表示为:tool??L,??g,Protein。
1(2(9 统计学处理 数据以 ?s表示,组间比较
1(2(4 PCR检测成骨标志蛋白mRNA水平表达
用方差分析。统计分析用方差分析,统计分析用
将脂肪干细胞以 10cells??L 的密度接种于6孔
板中,每孔2ml完全培养基,待细胞达80,汇合时, SPSS12(0软件完成。
2 结果
换成成骨诱导培养基,进行成骨诱导。实验分组同
2(1 脂肪干细胞多向分化能
力的鉴定 由于脂肪
“1(2(3”。诱导14d后,弃培养液,PBS洗3次,Tr―
izol法提取总 RNA、逆转录PCR鉴定 BMP2、ALP、 干细胞是一种具有多向分化能力的成体干细
胞_8J。所以本文中首先我们对提取的细胞分化能
Col―ImRNA水平 的表达。引物序列如下:ALP
sense 5-TCGGACCCTGCCrrI’ACCA一3, antisense 力进行鉴定,以确定其是否是脂肪干细胞:经成脂诱
5一TGTCTCCTCGCCCGTGTT一3;BMP2 sense 5一 导,油红染色发现诱导后细胞胞质中出现亮红色的
AACCCAGGTGTCTCCAAG(3, antisense 5一 脂滴 Fig1 。经成骨诱导28d后,VonKossa染色
AAGTCCACATACAAAGGGTG一3;Col―I sense 5一 发现细胞中有多个大块黑色团块着色,说明诱导后
CGAGTATGGAAGCGAAGGT一3, antisense 5一 的细胞有钙结节形成
Fig2 。经软骨诱导21d后,
CCACAAGCGTGCTGTAGGT一3;GAPDH sense 5一 甲苯胺蓝染色显示细胞胞质呈紫蓝色,表明细胞有
TATCGGACGCCTGGTTAC(3, antisense 5(TGCT( 蛋白多糖的表达。而各未经诱导的对照组不显色或
??
28?? 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2011Jan;27 1
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Raloxifeneenhancesosteoblasticdifferentiationinadipose
derived stem cellsvianitricoxidepathway
LUXiang,
CHENJiang-ning,ZHANG Jun―feng
StateKeyLaboratoryofPharmaceuticalBiotechnology,
SchoolofLifeSciences,NanjingUniversity,Nanfing 210093,China
Abstract:Aim Toexploretheeffectsofraloxifeneon
theexpressionofosteoblasticgene alkalinephospha―
osteoblasticdifferentiation(M ethods adipose derived
tase,ALP;bonemorphogenetieprotein2,BMP2;typeI
collagen,Col―I aswellasenhancedcalcium deposi―
stemcells ADSCs wereobtainedfromratsandidenti―
fledfortheirmuhilineagedifferentiationpotentia1(Dif-
tion(Meanwhile,supplementationofL-NAME 1mmol
??
L 1significantly reversed the raloxifene―induced
ferentconcentrationsofraloxifene 0,0(01,0(1,1
txmol??L 1wereaddedintoculturemedium withor NOformationandosteogenicmarkergenesexpression(
Conclusions Raloxifenemayinducetheosteoblastic
withoutN-nitro―L―argininemethylester -NAME,1
mmol??L (whichisusedasanon―selectiveinhibitor
differentiationofADSCsthroughNOpathway(
Key words:raloxifene;adiposederivedstem cell;mul―
ofnitricoxidesynthase NOS (After14,28dofculti(
vation,the expression of osteoblast―specific markers tilineage differentiation;osteogenesis;nitric oxide;cell
proliferation
weremeasured(Results RaloxifeBe 0(01,0(1,1
ixmol??L increased NO productionandenhanced