构建人头皮毛乳头细胞和真皮鞘细胞快捷高效分离培养的方法

构建人头皮毛乳头细胞和真皮鞘细胞快捷高效分离培养的 构建人头皮毛乳头细胞和真皮鞘细胞快捷 高效分离培养的方法 72 中国临床康复第9卷第78期2005.05.14出版 ChineseJournalofClinicalRehabilitation,May142005Vo1.9No.18 构建人头皮毛乳头细胞和真皮鞘细胞快捷高效分离培养的方法 朱堂友,郝飞,伍津津:,位争伟 ? 基础研究? 解放军第三军医大学西南医院皮肤科,重庆市400038;解放军第三 军医大学大坪医院野战外科研究所皮肤科,重庆市400042 通讯作者:朱堂友?,男,1969年生,重庆市人,汉族,2001年解放军第 三军医大学毕业,硕士,主治医生,讲师,主要从事组织工程方面的研 究.tangyouzhu@tom.com 国家自然科学基金项目(30070701)-k 中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:1671—5926(2005)18—0072—02 收稿日期:2004—11—11修回日期:2o05—01—18(26/GY/YH) Effectivemethodsforisolatingandculturinghumanscalpder- malpapillacellsanddermalsheathcellsrapidlyandpurely ZhuTang—you.HaoFei',WuJin?iin.WeiZheng—wei,DepartmentofDer— matology,SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversityofChinese PI』A,Chongqing400038,China;DepartmentofDermatology,ResearchIn— stituteofSurgery,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversityof ChinesePLA.Chongqing40OO42.China Correspondenceto:ZhuTang—You?.Master,Attendingphysician,Lectur— er,DepartmentofDermatology,SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedical UniversityofChinesePLA,Chongqing400038,China tangyouzhu@tom.com Supportedby:theNationalNaturalScienceFoundationofChina, No.30070701-k Received:2004—11—11Accepted:2005—01—18 Abstract A玎U:Toestablishthemethodsbycombiningmicroscopyandtwo.stepen. zymemethodsoastoisolateandculturehumanscalpdermalpapillacells (DPCs)anddermalsheathcells(DSCs)rapidlyandeffectively. METH0DS:Smallscalpspecimensweretransectedattheinterfacebetween dermisandsubcutaneoustissue,andthentheportionsofhairfollicleem. beddedintheadiposetissuewereextracted.Dermalpapilla(DP)anddermal sheath(DS)wereindividuallyisolatedfromintacthairfollicleunderdis. sectingmicroscope.DPwerepre-incubatedby2g/Lcollagenaseat37oCfor about4hoursfollowedbysuspension.ThefragmentsofDSwereinoculated onpetridishsmearedwithcollagen.Theculturedcellswereidentifiedby immunohistochemistrywitha.actinantibodyandbycytochemistrystaining withalkalinephosphatase. RESULTS:DPCsandDSCscouldbeharvestedpurely. C0NCLUSION:Thenewtechniquecombingmicroscopyandtwo.stepen. zymemethodisofhighefficiencyinisolatingandculturingcellsofhuman hairfollicledermalportionsrapidlyandpurely. ZhuTYHaoF.WuJJ.WeiZWEffectivemethodsforisolatingandculturinghumQn scalpdermalpapillacellsanddermalsheathcellsrapidlyandpurely.Zhongguo Linchuangl2005;9【18I:72—3lChinal 朱堂友,郝飞,伍津津,位争伟.构建人头皮毛乳头细胞和真皮鞘细胞快捷高效 分离培养的方法…中国临床康复,2005,9l18l:72—3f,vwzglckfcamI 摘要 目的:将显微法和两步酶法相结合,构建快捷分离培养纯的人头皮毛囊 毛乳头细胞和真皮鞘细胞的方法. 方法:从真皮一皮下组织交界处横断头皮,拔出脂肪组织中的完整毛 囊,解剖显微镜下分离出毛乳头和真皮鞘,毛囊毛乳头用2g/L胶原酶 37孵育4h左右后悬浮培养;真皮鞘碎片接种在涂有胶原的培养板 中.培养的细胞用a一平滑肌肌动蛋白组化及碱性磷酸酶染色鉴定及 鉴别. 结果:获得纯化的毛乳头细胞和真皮鞘细胞. 结论:将原有两方法结合后的新技术,既达到了快的目的,也解决了细 胞纯度问,是高效的人毛囊真皮成分细胞分离培养方法. 主题词:生物医学工程;毛囊/细胞学;细胞培养 0引言 目前人毛囊毛乳头和真皮鞘细胞的分离方法有显 微法1和两步酶法.显微法需要特殊显微外科器 械,解剖显微镜下的操作技巧和极大的耐心.两步酶 法需要的标本量大,分离时间长,工作强度大,分离的 真皮鞘细胞不纯,毛乳头容易在分离过程中大量丢 失.本文建立了一种结合显微法和两步酶法的高效, 纯化毛囊真皮成分细胞分离培养方法,该方法将在毛 囊细胞生物学研究,创伤愈合机制研究和组织工程皮 肤替代物研究中发挥重要作用. 1材料和方法 :对照组实验. _ qz~t:第三军医大学西南医院皮肤科. 材料:实验于2003—04/l2在第三军医大学大坪 医院野战外科研究所皮肤科实验室完成.自愿捐献的 人新鲜尸体头皮,D.Hanks'液,胎牛血清体积分数为 0.1的DMEM培养基(DMEM粉GIBCO公司,胎牛血 清HyClone公司):2g/L胶原酶D溶液(Roche公司), 眼科弯镊,lmL一次性注射器,6孔板,移液枪,解剖 显微镜(重庆光学仪器),二氧化碳孵箱(Sheldlab),超 净工作台(苏净集团苏州安泰公司),兔抗人,鼠ot一平 滑肌肌动蛋白多克隆抗体,SP组化试剂盒及二氨基联 苯胺显色试剂盒(北京中山). 设计,实施,评估者:设计为第一作者,干预实施为 全部作者,评估为第三作者.' 方法:?标本处理:用D—Hanks'液保存标本,4c【= 存放,最好24h内使用.将标本剃毛,超净工作台内用 碘伏搽洗一遍,乙醇棉球搽两遍后放人D.Hanks'液 中,反复冲洗5遍,剪去部分筋膜和边缘不组织, 将标本修剪成lamxlam大小.?完整毛囊的分离: 将修剪好的标本表皮面向下,用锋利的手术刀准确横 断真皮一皮下组织交界,留下皮下组织部分.用钝镊 子轻轻挤压脂肪组织面,以显露出皮下组织中的毛囊 中一下段的上部,用眼科镊抓住并抽出毛囊,将完整的 毛囊移人盛胎牛血清体积分数为0.1的DMEM培养 基的直径6am培养皿中,轻轻洗3遍.?真皮鞘和毛 乳头的分离:在解剖显微镜下,用两支带针头的lmL 一 次性注射器,一支固定住毛球部,一支轻轻挤压真皮 鞘,将毛发挤出,余下的组织即是带毛乳头的真皮鞘. 再用针头挑破毛球部鞘囊,使毛乳头充分暴露,针头侧 面轻切即可使乳头从蒂部脱落.用设定在50L的移 液枪将乳头吸人另皿中,冲洗后移人2g/L胶原酶D 溶液2mL中,37?消化4h左右.吸人离心管, D.Hanks'液加至5mL,500r/minx3min离心5次, 以洗去胶原酶.lmL新鲜培养基重悬后吸.人6孔板, 每孔15,20个,置37oC,体积分数为0.05的二氧化 碳,饱和湿度孵箱培养.真皮鞘组织挑至盛培养液的 另I111中,冲洗,眼科剪剪成小片,接种在预先涂有胶原 的6孔板中,间隔5mm左右.待组织块贴牢后加人 1.5mL胎牛血清体积分数为0.1的DMEM培养基,置 37?,体积分数为0.05的二氧化碳,饱和湿度孵箱培 卜70/R k~3385083@ina?朱堂友,等构建人头皮毛乳头细咆和真皮鞘细融快捷高效分离 培养的方法. ;oms?m朱堂友,等构建人头皮毛乳头细咆和真皮鞘细融快捷高效分离培乔的万 法 养.?培养细胞的免疫组化鉴定:培养的原代毛囊毛 乳头细胞和真皮鞘细胞传代至铺有载玻片的6孔板 中,细胞达90%融合时,取出载玻片,磷酸盐缓冲液冲 洗后,40g/L多聚甲醛室温固定30min.用SP免疫组 化试剂盒检测两种细胞一平滑肌肌动蛋白的表达,一 抗为1:200稀释的一平滑肌肌动蛋白多克隆抗 体,二抗为生物素标记羊抗兔IgG,二氨基联苯胺显 色,苏木精复染.?培养细胞的细胞化学鉴定:将培养 的细胞行碱性磷酸酶染色.将培养在载玻片上达90% 融合的第2代真皮鞘细胞,毛囊毛乳头细胞取出,磷 酸盐缓冲液冲洗3遍后,体积分数为0.1的中性甲醛 溶液固定8min.按文献【4】方法进行. 主要观察指标:?主要结局:分离培养细胞的生 长形态,是否混有杂细胞.?次要结局:培养细胞的平 滑肌肌动蛋白组化及特染. 2结果 真皮一皮下组织横断后抽出的毛囊为完整的毛 囊,在解剖显微镜和倒置显微镜下可见有真皮鞘,毛 球,毛乳头结构.毛囊毛乳头12h即可贴壁,并可见毛 囊毛乳头细胞长出,呈多角形,胞浆丰富,显示成层凝 集性生长特征,随接种毛囊毛乳头数量不同,10,20d 左右融合.刚从组织块中长出的真皮鞘细胞多呈梭 形.突起多而细长,30d左右可融合,显示梭形成纤维 细胞样形态,胞体狭长,胞浆较少,有2,4个胞质突 起.多平行生长,融合前有成层凝集性生长特征,但缺 少旋涡状生长特征.第2代毛囊毛乳头细胞和真皮鞘 细胞胞浆一平滑肌肌动蛋白染色强阳性.两种细胞 的碱性磷酸酶染色均阳性,但真皮鞘细胞明显弱于毛 囊毛乳头细胞,而包皮成纤维细胞阴性. 3讨论 1984年Messengert建立了人毛囊真皮乳头的显 微分离方法,1992年Warren等进行了改良.基本方 再从毛球部横断,用针头或显 法为先解剖游离毛囊, 微外科器械撕开毛球获得毛乳头.最近,Magerl等简 化了毛囊毛乳头的显微分离法,用横断真皮一皮下组 织交界后,抽出皮下组织中的毛囊来获得完整的毛 囊,用镊子夹住毛球上部使之成球形,切开毛球获得 乳头.真皮鞘细胞的显微分离及培养方法是"】:在解剖 显微镜下解剖出真皮鞘,用盖玻片压住培养,7d后取 出盖玻片.显微法分离毛囊真皮成分细胞的优点是标 本少,细胞纯,缺点是获得毛乳头数量有限,操作难度 大,不易推广应用.伍津津等?引首先提出用两步酶法 73 分离毛囊毛乳头,并发现低速离心上清可获得真皮鞘 细胞.两步酶法的优点是毛乳头贴壁快,短期内可获 得大量纯度较高的毛乳头细胞.但该法需要大量标 本,耗费实验用品多,分离时间长,劳动强度大,分离过 程中丢失大量毛乳头,即使多次低速离心,获得的毛乳 头中仍混有很多杂细胞和未消化组织;获得的真皮鞘 细胞混有脂肪间隔成纤维细胞,间充质细胞,真皮成纤 维细胞以及过度消化的毛囊毛乳头释放的毛囊毛乳头 细胞等.作者提出的方法是:标本必须新鲜,最好 在获取后6h进行实验,陈旧标本分离毛囊时易丢失 真皮鞘;必须准确横断真皮一皮下组织交界,脂肪层不 留真皮部分,否则不易抽出毛囊或抽出的毛囊不完整; 抽取时避免夹住周围脂肪组织.优点是:标本需要量 小;实验肖耗少,省时;不需要特殊器械;操作过程清 洁;可获得纯的真皮鞘细胞和毛乳头细胞.文献报道 的显微法获得的毛囊毛乳头贴壁时间长,Warren等1 用胶原酶处理的时间过短,毛囊毛乳头的贴壁时间仍 然较长.本法获得的毛囊毛乳头经胶原酶处理4h后, 毛囊毛乳头贴壁和毛囊毛乳头细胞融合时间与两步酶 法无明显差别. 高表达一平滑肌肌动蛋白是毛囊真皮成分细胞 的标志】.本法获得的真皮鞘细胞和毛囊毛乳头细胞 一 平滑肌肌动蛋白免疫组化染色均阳性,但真皮鞘 细胞稍弱于毛囊毛乳头细胞.真皮鞘细胞的碱性磷酸 酶染色明显弱于毛囊毛乳头细胞.文献报道,根据碱 性磷酸酶染色的强弱可区分真皮鞘细胞和毛囊毛乳头 细胞】,本实验也证实了真皮鞘细胞弱于毛囊毛乳头 细胞,与文献报道的结果一致. 4参考文献 lMessengerAG.Thecultureofdermalpapillacellsfromhumanhairfollicles.BrJ DermatolI984:Il0:685—9 2伍津津,刘荣卿.叶庆佾,等.毛乳头细胞的高效快捷培养方法【J】.第三军 医大学,1998,20(3):208—10 3麦跃,史春梦,屈纪富,等.真皮多能间充质干细胞对毛囊生长的影响【J】. 中国临床康复,2004,8(2):232—3 4王伯云,主编.病理学技术【M】.北京:人民卫生出版社,2000:226 5Wal'l~nR,ChestnutMH.WongTK,eta1.Improvedmethodfortheisolationand cultivationofhumanscalpdermalpapillacells.JInvestDermatol1992;98(5): 693—9 6MagerlM,KauserS,PausR.eta1.Simpleandrapidmethodtoisolateandcul— turefonicularpapillaefromhumanscalPhairfollicles.ExpDermatol20o2:l1 (4):38l一5 7KatsuokaK,ScheUH,Homstein0P,eta1.Comparativemorphologicaland owthkineticsstudiesofhumanhairbulbpapillacellsandrootsheathfibroblasts invitro.ArchDermatolRl986;279:20—5 8SchirrenCG,BurgdorfWH.SanderCA,eta1.FetalandadulthairfollicleAn immunohistochemicalstudyofanticytokeratinantibodiesinformalin—fixedand 40 paraffin—embeddedtissue.Am』Dermatopatholl997;l9(4):335— 9McElweeKJ.KisslingS.WenzelE,eta1.Culturedperibulbardermalsheathcells caninducehairfollicledevelopmentandcontributetothedermalsheathand dermalpapilla.J/nvestDermatol2003;l2l:l267—75