蛹虫草菌丝体培养特性的研究

蛹虫草菌丝体培养特性的研究 食用曹ED?lLEFUNGI2008(3) 蛹虫草菌丝体培养特性的研究 宋仙妹常继东 (华东理工大学生物反应器国家重点实验室,华东理工大学生物工程学院, 上海200237) 摘要从碳源,氮源,碳氮比,微量元素,温度,培养基初始 pH值,光照强度等方面探讨了蛹虫草C.M.203菌丝体培养特 性.结果表明:最适碳源为玉米粉,最适氮源为黄豆饼粉,最适 碳氮比为20:1;,Me”,Zn2~xF,Cu”,Ca2和VBl对蛹虫草菌 丝生长影响不大;最适温度为25?,最适pH值为7,光照强度 对菌丝的生长速度有抑制作用. 关键词蛹虫草菌丝体固体培养培养条件 文章编号1o0o-8357(2008)03—0012一O3 蛹虫草【Gordycepsmilitaris(VuiU;Lex.rr)Link]又名北冬 虫夏草,蛹草,北虫草,蛹草菌,隶属于真菌f1(Eumycota),子 囊菌亚f-j(Ascomycotinia),核菌纲(Pyrenomycetes),球壳目 (Sphaeriales),麦角菌科(Claviciptiaceae),虫草属(Cordyceps)al, 我国各省区均有分布,其子座于春至秋季在半埋于林地上或 腐枝落叶层下的鳞翅目昆虫蛹上长出罔. 关于蛹虫草的报道,国外最早是1723年VaiUant在 {BotaniconParlsiense)--书中发表了蛹虫草和大团囊虫草,其 后在20世纪30-60年代,日本等国研究人员分别做了一些 生态调查和人工驯化栽培的研究闷.我国这方面的研究始于20 世纪80年代,20多年来在人工栽培,化学成分,药理等方面 做了大量的研究,结果表明蛹虫草具有与冬虫夏草极相似的 作用,无毒副作用,可以作为冬虫夏草(C.sinensis)的代用品171. 由于野生资源缺乏,天然蛹虫草供不应求,于是蛹虫草的 人工栽培和应用研究越来越被重视.自1986年吉林省蚕业研 究所首次以家蚕和柞蚕为寄主培养蛹虫草成功获得子实体阁 以来,蛹虫草先后在柞蚕和桑蚕活蛹,家蚕,蓖麻蚕蛹以及樗 蚕蛹为寄主在室内种植成功嘲,或在大米,高粱米,小米,玉 米渣上栽培出子实体l】’11--3,或将蛹虫草菌直接接在培养基 (MS培养基加适量的KH.PO,蛋白胨,白糖和琼脂等)上长出 子座【玎I.目前国内,多采用人工固体培养的蛹虫草子座作为冬 虫夏草和野生蛹虫草的代用品.研究表明人工培养的jE冬虫 夏草的纯子实体,作为食品对人体是安全的,可广泛用作保健 食品及其原料.同时人工培育的jE冬虫夏草子实体,色泽鲜 艳,气味纯正,实用性强,商品价值高,适合多种不同的人群使 用. 为此对蛹虫草菌丝体在实验室条件下固体培养特性进行 了研究,为蛹虫草的人工栽培提供理论依据. 1材料与方法 1.1试验材料 1.1.1供试茵株蛹虫草C.M.203,本室保藏. —12 收稿日期:2007-04 生物化工国家重点学科,生物工程上海市重点学科项目. 通讯作者,e-mail:jdchang@eeust.edu.cn. 一 12— 1.1.2培养基?基础培养基:葡萄糖2g,蛋白胨0.2g, KH~O,0.2g,MgSO4?7H,.O0.1g,琼脂2g,加蒸馏水100mL, pH自然.?基本培养基:葡萄糖2g,蛋白胨0.2g,琼脂2g, 蒸馏水100mL,pH6.5.?斜面种及平板种培养基:PDA培养 基(马铃薯20g,葡萄糖2g,琼脂2g,蒸馏水100mL,pH自 然).(微量元素培养基:依据Sitty和Barnett半组合培养基嘞? 人葡萄糖2g,蛋白胨0.2g,琼脂2g,蒸馏水100mL,pH6.5, 并分别加人KH2PO40.1g,MgSO40.05g,ZnSO40.01mg,FeSO4 0.01mg,Cu$040.O1mg,CaSO40.O1mg,VBl0.O1mg配制成相 应的微量元素培养基. 1.2试验方法 1.2.1温度对蛹虫草茵丝体生长的影响用打孔器在平板种 的菌丝生长良好处取直径6mm的菌丝体块接种于PDA平 板的中央,分别于5~C,10?,15?,20?,25?,30?,35?下避 光培养,3d后每隔48h测定菌落直径伸长长度,计算出平均 每日生长速度,并记录菌丝体生长势.每处理设3重复,生长 速度(mm?d)取其平均值. 1.2.2培养基初始pH对蛹虫草茵丝体生长的影响制备初 始pH值分别为2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12和13的PDA 培养基,在1.2.1实验检出的最适温度下培养,接种,观察测 量和重复数等均同1.2.1. 1.2.3不同碳源比较试验以0.2%的蛋白胨为氮源,将基础 培养基中的葡萄糖置换为相同含碳量(等于2%葡萄糖的含 碳量)的碳源,以不加碳源为对照,培养基的初始pH值调节 至1.2.2检出的最适值,考察不同碳源对蛹虫草菌丝体生长的 影响.在1.2.1实验检出的最适温度下培养,接种,观察,测量 和重复数等均同1.2.1. 1.2.4不同氮源比较试验以2%的葡萄糖为碳源,将基础 培养基中的蛋白胨置换为相同含氮量(等于0.2%蛋白胨的含 氮量)的不同氮源,以不加氮源为对照,培养基的初始pH值 调节至1.2.2检出的最适值,考察不同氮源对蛹虫草菌丝体生 长的影响.在1.2.1实验检出的最适温度下培养,接种,观察, 测量和重复数等均同1.2.1. 1.2.5最佳碳氮比的确定以2%的葡萄糖为碳源,蛋白胨 为氮源(蛋白胨的含碳量忽略不计),配制成碳氮比分别为10:1, 20:1,30:1,40:1,50:1,60:1,70:1的培养基,培养基的初始pH 值调节至1.2.2检出的最适值,考察不同的碳氮比对蛹虫草菌 丝体生长的影响.在1.2.1实验检出的最适温度下培养,接种, 观察,测量和重复数等均同1.2.1. 1.2.6微量元素试验依据Sitty和Barnett半组合培养基的 配方,在基本培养基中分别加人KH00.1g,MgSO0.05g, ZnSO40.O1mg,FeSO40.01mg,CuSO40.O1mg,CaS040.01mg. VB10.01mg;以基本培养基为对照.在1.2.1实验检出的最适 食用曹EDIBLEFUNGI2O08(3) 衷3不同微量元素对蛹虫草菌丝生长的影晌 微量元素KH2PO4Mgso4ZnSO4FeSO.CuSO4CaSO?V窒皂 注:同表1. 的基本培养基上的生长速度差异不大,且蛹虫草菌丝在不同 微量元素的培养基上的生长速度也非常接近;从生长势上看, 都表现为菌丝洁白有光泽,粗壮,致密.这说明了以葡萄糖为 碳源和以蛋白胨为氮源的培养基中,所含的微量元素已基本 能够满足蛹虫草菌丝生长的需求,且在供试的微量元素水平 上对蛹虫草菌丝的生长无促进作用,也无抑制作用. 2.7光照强度对蛹虫草菌丝体生长的影响试验表明蛹虫 草菌丝在黑暗,12h光暗交替,全光照条件下均能生长;黑暗 条件下菌丝生长最快,日均生长3.8mm,菌丝洁白有光泽;其 次为12h光暗交替,日均生长3.5mm,菌落外围为白色,中央 为淡黄色;全光照条件下菌丝生长较慢,日均生长3.1mm,菌 丝为淡黄色. 2.8培养条件单因子选优后与选优前蛹虫草菌丝生长之比 较单因子选优后蛹虫草C.M.203的培养条件为:玉米粉 16g,黄豆饼粉3.4g,琼脂20g,蒸馏水1000mL,pH7,25? 下避光.在优化条件下的生长情况与优化前的比较结果如表 4所示.从表4可见,优化培养条件后蛹虫草菌丝的生长速度 提高了31.5%,且菌丝粗壮,致密. 表4培养基优化后与优化前蛹虫草菌丝生长情况 3结论与讨论 蛹虫草C.M.203菌丝体生长的温度范围为5,30?,最适 为25?;pH范围3~13,最适pH7.蛹虫草菌丝体生长需要碳 源和氮源,且具有选择性;其碳源谱极广:在元素水平上属C. H.O类,在化合物水平上属糖类,在培养基原料水平上属天 然糖,淀粉,玉米粉等;营养类型属于化能异养型;其氮源谱极 广:在元素水平上兼属N.C.H.0.X,N.C.H.0,N.0和N.H 类型,在化合物水平上对有机氮和无机氮都可利用,其中有机 氮优于无机氮,蛋白一N优于铵态一N和硝态一N,在培养基原 料水平上兼属黄豆饼粉等天然蛋白原料和硝酸盐等无机盐 类;营养类型属于氨基酸自养型.最适碳氮比为20:1.与其它 一 14一 真菌菌丝体生长所需的碳氮比16:1~20:1r峒相符;以葡萄糖和 蛋白胨组成的培养基中,蛋白胨含天然成分,可以满足蛹虫草 菌丝对微量元素的需求,故不需再添加微量元素,试验结果也 证明了这一点;光照对菌丝的生长速度有抑制作用. 综上所述,从提高生物量为目的的菌丝体培养角度出发, 以玉米粉为碳源,黄豆饼粉为氮源,碳氮比为20:1,培养基最 适pH7,25?下避光培养为宜.其营养选择性的机理及其对 环境因子的选择性机制有待进一步研究. 参考文献 邵力平.真菌分类学【M】.北京:中国林业出版社,1984,109. 林群英,宋斌,李泰辉.蛹虫草研究进展[J】.微生物学通报, 2006,33(4):154-157. 韦会平,肖波,胡开始.蛹虫草药用价值考.中药材,2004,27 (3):215-217. 徐维容.北虫草子实体对大鼠睾丸功能的影响【J】.上海中医药大 学学报,2001,(4):50. 陈桂宝.蛹虫草的药理作用研究[JJ.中草药,1997(7):415. 王建芳,杨春清.蛹虫草人工栽培及产品开发研究概况.时珍 国医国药,2006,17(2):268-269. 徐锦堂.中国药用真菌学【M】.北京:北京医科大学,中国和医 科大学联合出版社,1997,394. 古恒生,梁漫逸.人工培育蛹虫草研究【J】.药学情报通讯,1987, 5(3):51. 蒋本律,徐银根.蓖麻蚕蛹虫革人工培养研究【J】.中国野生植物 资源,1996,15(2):12. 朱宏图.人工培育蛹虫草的研究【J】.中药通报,1987,12(12):21. 姜明兰,钟文田.北冬虫夏草人工栽培技术研究[J】.辽宁农业科 学,1995(1):54. 张显科,刘文霞.不同培养料栽培蛹虫草实验研究.中国食用 菌,1997,16(2):21. 郑晴霞,彭菲,王风翱.蛹虫草的人工培育及组织学研究L玎.湖 南农业大学学报,1995,21(6):581. 张平,朱述钧,钱大顺.北冬虫夏草功能成分及保健作用分析 m.江苏农业科学,2003(6):105. 董爱荣,吴力禹,吴力,等.羊肚菌的生物学特性[J】冻北林业大 学学报,2oo2,30(4):28—30. 张长铠,赵友春,吴志红,等.冬虫夏草菌丝生长的营养需求【J】I 微生物学通报,1992,19(3):129-133. 农业生产有问题,农科专家来帮助; 遇到问题怎么办,专家为你找答案. 上海农科热线,服务全国农业 上海农科热线采取电话咨询,网上问答等方式为全国农 民咨询服务.全年365天,每天早8时至晚8时都有专家值班, 当场解答,疑难问题由多家农业科技单位会诊答复.欢迎农 民朋友随时来电(晚间可以电话录音),来信或登门作客,咨询 有关农业技术等问题. 8弄16号 上海农科热线管理中心地址:上海市西康路151 2楼.邮政编码:200060. 欢迎拨打由农业部统一规定的热线电话:021—12316. ?引川 };;};【