甲泼尼龙对大鼠视网膜激光损伤中Mueller细胞胶质纤维酸性蛋白和增生细胞核抗原表达的影响
甲泼尼龙对大鼠视网膜激光损伤中Mueller细胞胶质纤维酸性蛋白和增生细胞核抗原
表达的影响
中华眼底病杂志2002年12月第18卷第4期ChinJOculFundus—
Dis,December20
—
02,Voi18,No.4
甲泼尼龙对大鼠视网膜激光损伤中
Mtiller细胞胶质纤维酸性蛋白和
增生细胞核抗原表达的影响
翟黎东何守志张笑呜
299
?
实验研究?
【摘要】目的研究甲泼尼龙对视网膜激光损伤后MOiler细胞胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillary
acidicprotein,GFAP)和增生细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)的影响.方法4O只
Sprague—Danley(sD)大鼠随机分为治疗组和对照组,治疗组大鼠在视网膜激光光凝损伤后连续3d腹腔注
射剂量为30mg/kg的甲泼尼龙,对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水;分别于激光光凝术后3,7,l4,28d各
处死5只动物,取出眼球,用AFA固定液进行组织固定后做石蜡包埋,切片,用免疫组织化学方法测定
GFAP和PCNA的表达.结果激光光凝损伤后3d,治疗组和对照组视网膜MOiler细胞均表达
PCNA,治疗组PCNA表达明显较对照组弱,3d后PCNA表达消失;激光光凝损伤后3d,治疗组和对照
组视网膜MOiler细胞均表达GFAP,在各时间点治疗组GFAP表达明显较对照组弱.结论甲泼尼龙可
减轻MOiler细胞激光损伤后PCNA和GFAP的表达,最终影响视网膜激光光凝损伤的瘢痕修复,这为研
究视网膜激光损伤和防护的机制提供了实验证据.
【关键词】纤维蛋白/
;增殖细胞核抗原;视网膜/病理学;MOiler细胞;甲泼尼龙;
动物,实验
中图分类号:R774.12R362—23
TheeffectofmethyIprednisoIoneontheexpressionofglialfibrillaryacidicproteinandproliferatingcell
nuclearantigeninMOilercellsofratsretinaeinjuredbylaserzHAILidong,HEShouzhi,zHANG
Xiaoming.DepartmentofOphthalmology,GeneralHospitalofPLA,Be诤ng100853,China
[Abstract]0bjectiveToinvestigatetheeffectofmethylprednisoloneontheexpressionofglialfib—
rillaryacidicprotein(GFAP)andproliferatingeellnuclearantigen(PCNA)inMOilercellsofrats’retinae
injuredbylaser.MethodsFortySDratswererandomlydividedintotwogroupsandinflictedwithlaser
photoc0agulation.Theratsintreatmentgroupweregivenmethylprednisolonebyintraperitonealinjection
withadoseof30mg/kgfor3days.Atthe3rd,7th,14th,and28thdayafterphotocoagulationrespectively,
theeyeswereenucleated,fixedandcutintosections.ImmunohistochemicalexaminationwasusedtOdetect
theexpressionofPCNAandGFAP.ResultsAfterphotocoagulationtheMOilercellsexpressedPCNA
bothinthetreatmentandcontrolgroup,andtheexpressionofPCNAdecreasedsharplyafter3days.The
expressionofPCNAintreatmentgroupwaslessthanthatincontrolgroup.Afterphotocoagulationthe
MOilercellsalsoexpressedGFAPandtheexpressionofGFAPlastedforatleast28days.andtheexpres—
sionofGFAPexpressioninthetreatmentgroupwaslessthanthatinthecontrolgroup.Conclusion
MethylprednisolonecanreducetheexpressionofGFAPandPCNAinMOilercellsofrats’retinaeinjured
bylflser.
[KeywordslFibrin/analysis;Proliferatingcellnuclearantigen;Reitna/pathology;
Moilercell;Methylprednisolone;Animals,laboratory
激光光凝治疗后常发生视网膜色素上皮(retinal
pigmentaryepithelium,RPE)下的纤维增生膜,导致
光斑扩大,而这种纤维增生膜主要由肥大增生的
Mailer细胞的突起构成l1].胶质纤维酸性蛋白
(GFAP)是Maller细胞骨架蛋白,在损伤后才表达,
并与Mailer细胞的肥大,增生和迁移有关系[33.在对
基金项目:全军”十五”医药卫生科研基金资助项目(02M014)
作者单位:100853北京,解放军总医院眼科(翟黎东,现在北京英智眼科
医院)
大鼠脑海马回的研究中发现大剂量甲泼尼龙可以抑制
星形胶质细胞GFAP的表达[43,但甲泼尼龙对视网膜
激光损伤中Mailer细胞GFAP表达的影响尚未见报
道.我们对此进行了初步观察,现将结果报道如下.
1材料和方法
1.1材料和设备
小鼠抗大鼠增生细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体
(北京中山生物技术有限公司);链霉亲合素一生物素化
300中华眼底病杂志2002年12月第18卷第4期ChinJOculFundusDis,Dec!:!!:!:
过氧化物酶复合物(strepto—avidin_biotinperoxidase
complex,SABC)试剂盒(武汉博士得生物工程有限公
司);小鼠抗猪GFAP单克隆抗体(加拿大BioGenex
公司);氩离子激光器(NOVAS2000,Coherent公
司);MIAS一300图像分析仪(国产).
1.2实验方法
成年健康SD大鼠40只,体重180,220g,雌雄
不限,由解放军总医院实验动物中心提供.随机分成治
疗组和对照组,每组各20只.实验前30min两组大鼠
均腹腔注射浓度为3.5%水合氯醛10ml/kg,双眼复
方托品酰胺充分散瞳,眼前放一53D前置镜,进行双
眼视网膜激光光凝.每只眼在视盘1.5,2.0个视盘直
径外4个象限均匀光凝40个点.光凝时间0.20S,光
斑为50tzm,能量400mw,治疗组20只大鼠在光凝后
1h内按30mg/kg剂量腹腔注射浓度为1的甲泼尼
龙,其后每日注射1次,连续3d.对照组大鼠亦连续3
d每日腹腔注射等量的生理盐水.
1.3组织切片
激光光凝后3,7,14,28d任选5只大鼠,水合氯
醛腹腔注射麻醉后取出双眼眼球,固定(固定液450
ml:95%酒精150ml,10中性缓冲甲醛100ml,冰醋
酸50ml,蒸馏水150m1)15,20h后,于赤道部矢状
切开,小心取出品状体,玻璃体,后半部眼球在75酒
精中继续固定3,5h.组织脱水,透明,浸蜡,包埋.组
织蜡块在冰水中制冷后,眼球均从冠状位沿视神经向
周边视网膜方向切削0.5mm,然后做5tzm厚的连续
切片.蜡块置于44C蒸馏水中展开,65’C左右的烤片
机上烘烤10min,制片完成.用SABC免疫组织化学
染色法测定PCNA和GFAP,3,3一二氨基联苯胺室温
显色.显微镜下控制反应时间,待显色完全后,用蒸馏
水洗涤.苏木素轻度复染,中性树脂封片.
1.4图像分析与统计学处理
应用MIAS一300图像分析仪,用200倍显微镜,每
个激光损伤灶为一个视野,随机选取5处视野.对治疗
组和对照组的PCNA免疫组织化学染色结果进行定
量检测,测定阳性反应物的面积和灰度,然后在SAS
软件下进行统计学处理.
2结果
2.1PCNA表达
激光光凝损伤后3d,治疗组和对照组激光光斑处
可见成片的PCNA阳性染色细胞,包括Mtiller细胞,
RPE细胞,脉络膜血管细胞和炎性细胞.对照组较治
疗组染色面积大,灰度深(表1;图1,2).在7,14,28d
治疗组和对照组激光光斑处均未见PCNA阳性表达.
表1激光光凝损伤后3dPCNA染色
2.2GFAP表达
激光光凝损伤后3d,治疗组激光光斑边缘只有少
量GFAP阳性表达,对照组激光光斑边缘有相对较多
的GFAP阳性表达.但在治疗组和对照组的激光光斑
两侧的Miiller细胞都有围绕激光光斑的扇形GFAP
阳性表达区域(图3,4).损伤后7d,治疗组和对照组
激光光斑中央都出现GFAP阳性染色,激光光斑周围
Miiller细胞扇形GFAP阳性表达区域向激光光斑方
向缩小(图5,6).激光光凝损伤后14d,治疗组和对照
组激光光斑仍显示GFAP强阳性染色,周围的Mtiller
细胞扇形GFAP阳性表达区域继续缩小,颜色变淡.
损伤后28d,激光光斑仍显示GFAP强阳性染色,周
围Miiller细胞GFAP染色基本消退.在各个时间点
对照组免疫组织化学染色面积均比治疗组大.
3讨论
PCNA是一种细胞周期调节蛋白,与机体的生
长,生理性再生,创伤修复,细胞程序性死亡及肿瘤发
生密切相关.其合成水平反映了细胞增生率及DNA
合成率,并与多种细胞周期调节因子密切相关[.
在视网膜损伤中,损伤的程度与非神经元细胞增
生有直接关系,损伤越重,这些细胞增生修复程度越
强[6].我们观察到激光光凝损伤治疗组的PCNA阳性
染色面积小于对照组,染色强度也弱于对照组.这说明
治疗组在损伤后非神经元细胞的增生程度较对照组
弱.Tim等_7证实了大剂量甲泼尼龙对视网膜激光光
凝损伤有防治作用.因而治疗组视网膜非神经元细胞
增生程度较对照组减弱.
视网膜不同损伤实验中,PCNA阳性表达持续时
间各不相同[6].这可能和损伤引起的刺激程度不同有
关.我们只在损伤后3d观察到PCNA阳性染色结果,
其余7,14,28d3个时间点PCNA表达均为阴性.这
说明激光光凝损伤引起的刺激作用可能较短暂.
许多研究认为视网膜在受到损伤后,Mtiller细胞
开始表达GFAP】,而GFAP的表达是Miiller细胞进
入反应状态的标志,并与Mtiller细胞的肥大,增生和
中华眼底病杂志2002年12月第18卷第4期ChinJO!nd!!!!!!:!:!:3O1
图l治疗组激光光凝损伤后3dPCNA染色像.激光光斑处阳性细胞较少(黑箭)PCNA染色×200图2对照组激光光凝损伤后3d
PCNA染色像.激光光斑处阳性细胞较多(黑箭)PCNA染色×200图3治疗组激光光凝损伤后3dGFAP染色像激光光斑边缘阳性细胞
较少(黑箭)GFAP染色义200图4对照组激光光凝损伤后3dGFAP染色像.激光光斑边缘阳性细胞多见(黑箭)图5治疗组激光光
凝损伤后7dGFAP染色像.阳性细胞向激光光斑中央集聚(黑箭)GFAP染色×200图6对照组激光光凝损伤后7dGFAP染色像.激光
光斑中央集聚的阳性细胞仍多于治疗组(黑箭)GFAP染色×200
Fig.1PhotographofPCNAstainingofretinaintreatmentgrouponthethirddayafterlaserinjur.Withlessp
ositivecellsinlaserphotocoagu—
lation(LP)scar(blackarrow)PCNAstain×200Fig.2PhotographofPCNAstainingofretinaincontrolgr
ouponthethirddayafterlaser
iniury.WithmorepositivecellsinLPscar(blackarrow)PCNAstain×200Fig.3PhotographofGFAPstai
ningofretinaintreatment
groupatthethirddayafterlaserinjury.WithlesspositivecellsontheedgeofLPscar(blackarrow)GFAPst
ain×200Fig.4Photograph
ofGFAPstainingofretinaincontrolgroupatthethirddayafterlaserinjury.Withmorepositivecellsonthe
edgeofLPscar(blackarrow)
GFAPstain×200Fig.5PhotographofGFAPstainingofretinaintreatmentgrouponthe7thdayafterlaseri
njury.Positivecellsgathered
tothecentralareaofLPscar(blackarrow)GFAPstain×200Fig.6PhotographofGFAPstainingofretinain
controlgrouponthe7thday
afterlaserinjury.PositivecellsinthecentralareaofLPscar(blackarrow)GFAPstain×200
迁移有关系[6].在对视网膜损伤后GFAP表达的研究
中,明确原发损伤的准确范围很重要.由于激光光凝损
伤范围明确,继发损伤少,因而视网膜激光光凝损伤动
物模型比较适合研究视网膜损伤GFAP表达与激光
损伤的关系L3].Humphrey等口]观察到视网膜激光光
凝损伤后GFAP的表达有两种不同的方式,即在激光
光斑区域有局限和持续的表达,而在激光光凝斑周围
有广泛而短暂的表达.我们观察到治疗组激光光凝损
伤后各时间点激光光斑区域的GFAP表达都较对照
组弱,而周围GFAP的表达范围无明显差别,可见大
剂量甲泼尼龙可减少视网膜激光光斑区域Mailer细
胞的GFAP表达.甲泼尼龙的这种作用可能有两方面
原因,一方面是直接作用,在对大鼠海马回的实验中,
发现糖皮质激素可抑制GFAP基因的表达;另一方面
是间接作用,Mailer细胞的GFAP表达与激光光凝损
伤程度成正相关[3].由于大剂量甲泼尼龙可以减轻视
网膜的激光损伤程度,因而减少了GFAP表达.
4参考文献
1RutledgeBK,WallowIH,PoulsenGL.Sub—pigmentepithelial
membranesafterphot0coagulationfordiabeticmacularedema.
ArchOphthalmol,1993,111:608—613.
HumphreyMF,ConstableIJ,ChuY,eta1.Aquantitativestudy
ofthelateralspreadofMtillercellrespsonsestoretinallesionsin
therabbit.JCompNeurol,1993,334:545—558.
HumphreyMF.ChuY,MannK.eta1.RetinalGFAPandbFGF
expressionaftermultipleargonlaserph0tocoagulationinjuriesas,
sessedbybothimmunoreactivityandmRNAlevels.ExpEyeRas,
1997,64:361—369.
NancyRN,HeinzHo.JeffreyNM,eta1.MessengerRNAforglial
fibrillaryacidicproteinisdecreasedinratbrainfollowingacuteand
chroniccorticosteronetreatment.MolBrainRes,1990,7:I-7.
周大彪.增生细胞核抗原及其在脑胶质瘤中的研究进展.国外医学
神经病学神经外科学分册,1999,26:242—244.
YewDT,YiX,ChanWY,eta1.Arabbitmodelofproliferative
Vitreoretinopathyinducedbyinjectionofastrocyticcultures.Cell
MolNeurobiol,1999,19:759—773.
TimTT,KanjiT,JunF,eta1.Methylprednisolonetherapyinlaser
oftheretina.Graefe’sArchClinOphthalmol,1993,231:729—736.
JuWK,KimKY,HofmannHD,eta1.Selectiveneuronalsurvival
andupregulationofPCNAintheratinnerretinafollowingtransient
ischemia.JNeuropatholExpNeurol,2000,59:241—250.
(收稿日期:2001—09—14)
(ak文编辑:唐健)
2345678