荧光淬灭法测定ε-聚赖氨酸含量的研究

荧光淬灭法测定ε-聚赖氨酸含量的研究 荧光淬灭法测定ε-聚赖氨酸含量的研究 现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2010,Vo1.26,No.11 荧光淬灭法测定,一聚赖氨酸含量的研究 刘双燕,贾士儒,王国良,戴玉杰,谭之磊,宋庆超 (天津科技大学工业微生物教育部重点实验室,天津300457) 摘要:以异硫氰酸酯(FITC)为指示剂,采用荧光法测定,一聚赖氨酸(,一PL).体系 的激发波长和发射波长分别为495nnl 和51911I/1.在2%乙醇介质中,,.PL与FITC反应,使FITC发生荧光淬灭.,一PL 含量在0.1-0.8mgm范围内呈现一定的线性关 系.本文探讨了,一PL淬灭FITC的机理,并用荧光淬灭法检测了米饭样品中,一 PL的含量.结果明,所测得的,.PL含量与实 际添加量较为接近. 关键词:异硫氰酸酯;荧光淬灭法;,一聚赖氨酸 文章篇号:1673.9078(2010)11-1267—1270 Determination0f,.PolylysineContentby FluorescenceQuenchingMethod LIUShuang—yan,JIAShi—ru,WANGGuo-liang,DAIYu-jie,TANZhi-lei,SONGQing—chao (KeyLaboratoryofIndustrialMicrobiology,MinistryofEducation,TianjinUniversityofSci ence&Technology, Tianjin300457.China) Abstract:Anewhighlysensitiveandselectivefluorometricmethodhasbeendevelopedforth edeterminationof,一PLusing fluoresceinisothiocyanateasfluorogenicreagent(~ex=495nm,Xem=519nm).In2%ethan olmedium,,-PLcanmakefluorescence isothiocyanatequenched.Thelinearrangewas0.1-0.8mg/L.Inthisstudy.thefluorescenceq uenchingmechanismof,一PLtoFITCwas discussed,andthemethodhasbeenappliedtothedeterminationof ,-PLaddedintoricewithsatisfactoryresults. Keywords:fluoresceinisothiocyanate;fluorescencequenching;,-polylysine 食品的腐败变质主要是由于有害微生物的侵入 与繁殖所造成,食品的腐败变质问题直接影响食品的 品质和消费者的健康.为了保持食品的品质以及延长 食品的保存期需要,防腐剂广泛地应用于食品的生产 中.我国常用的食品防腐剂有许多种类,例如:苯甲 酸,苯甲酸钠,山梨酸,山梨酸钾,丙酸盐等.由于 这些防腐剂均为化学合成的防腐剂,对人体健康有一 定影响,随着人们生活水平的提高,日益需要更安全 的防腐剂.日本使用,.PL,Nisin等以微生物发酵法 生产的防腐剂替代传统的化学防腐剂,这些生物防腐 剂的安全性越来越引起人们的重视LJj. ,.聚赖氨酸(e-poly—L.1ysine,简称c-PL)是一 种由20,30个赖氨酸单体组成的均聚氨基酸,它是通 过单个赖氨酸分子在.羧基和,一氨基之间形成酰胺 键而连接成的多聚体.,PL安全性高,抑菌谱广, 收稿日期:2010-07—17 基金项目:国家"973"项目(2007CB714305) 作者简介:刘双燕(1984-),女,硕士研究生 通讯作者:贾士儒,教授,博士生导师 1267 pH值范围宽,在高温下稳定,水溶性强【2J.作为新 型天然防品保鲜剂,而且8-PL在体内可以分解为人 体必需的L.赖氨酸,所以e-PL具有天然,营养,安 全等优点【引. 食物中添加防腐剂对于剂量是有严格规定的,需 要有准确简便快速的方法进行检测.1972年,Itzhaki【4j 利用甲基橙与,一PL之间形成复合物的特性,建立用 甲基橙测定a-PL含量的方法.PrihardiKahar等J用 高效液相测定,一PL的含量,但在操作过程中保留时 间波动比较大,峰值多,重复性差.由于食品中成分 复杂,甲基橙法和高效液相色谱法受干扰大,无法检 测食品中添加的,.PL含量.目前,在国内外食品卫 生中,未见有关食品中,一PL的定量测定方法. 因此,探索一种简便,快速,灵敏的检测,.PL的分 析方法具有重要意义. 荧光素异硫氰酸酯(FITC)是一种重要的阴离 子探针,其硫氰酸基团能和胺基快速结合.FITC具 有较好生物安全性和较高的荧光灵敏度,因此被广泛 用作生物标记物【6】.本研究以荧光素FITC为指示剂, 现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2010,Vo1.26,No.11 采用荧光法测定米饭样品中的,一PL含量. 1材料与方法 1.1仪器与试剂 RF.540荧光分光光度计(Shimadzu,Japan), FITC(Sigma),,一PL标准品(实验室自制),,一PL 样品(浙江银象生物工程有限公司). 荧光素FITC母液:准确称取1mg荧光素FITC, 用无水乙醇溶解,然后定容至100mL. 配制,一PL母溶液:准确称取5mg,一PL标准品 定容至500mL,,一PL浓度l0mg/L. 配制溶液均用去离子水. 1.2实验方法 准确移取,.PL母液和2mLFITC溶液于100ml 容量瓶中,用去离子水定容,混匀.配制含有已知浓 度的FITC和,一PL混合溶液,其中,.PL浓度分别为 0.02,0.04,0.O6,0.08,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8, 1.0,1.5,2.0mg/L.在kex=495am,kem=519am波 长下测定.狭缝宽度均为1.5am.以FITC溶液为空 白参比,荧光强度为Io,FITC和,一PL混合溶液的荧 光强度为I,记录荧光比值Io/I. 1_3样品处理及测定 称取2.0000g,一PL样品,用水定容至100mL. 称取3份米饭各100g,分别添加0,15,30mL的,一PL 溶液.添加少量水并搅拌成粥状.称量总质量,分别 减去烧杯质量,在每个烧杯中添加少量水,使烧杯中 物质的质量一致.3份米饭置于高压灭菌锅中, 121?,20rain.高压灭菌结束后,分别从3份米饭 样品中称取1g,然后添加20mL10mg/L的FITC溶 液,定容到1000mL,混匀,4000r/min离心15min. 取上清液,用荧光分光光度计检测其荧光强度. 2结果与 2.1不同介质中,.PL对FITC的淬灭 以去离子水和2%乙醇作为介质进行试验,根据 文献报道J,FITC的激发波长是495am,用RF.540 荧光分光光度计扫描得到体系的发射光谱,由图1 和图2可知,在两种介质中,FITC发射波长均为519 am,加入,一PL后,体系的荧光强度下降.说明在去 离子水和2%乙醇介质中,一PL对FITC具有淬灭作用, 故可选用去离子水和2%乙醇作为介质. Wavelengthinm 图1水溶液中,一PL对FlTc荧光淬灭图谱(pH7.0) Fig.1QuenchingofFITCintrinsicfluorescencespectrumby ,一PLinwater Wavelength/nm 图22%乙醇溶液中,一PL对FlTc荧光淬灭图谱(oH7.0) Fig.2QuenchingofFITCintrinsicfluorescencespectrumby ,.PLin2%ethanolsolution 2.2荧光稳定性 分别以去离子水和2%乙醇为介质,在3h以内, 检测荧光强度. 嘿 时/h 图3两种介质中FJTC的荧光强度随时问的变化 Figure3.FluorescenceintensitychangesofFITCintwo differentmediumwithtime 由图3可知,FITC在2%乙醇溶液中,随着时间 的延长,荧光强度略有上升,但幅度很小,说明荧光 现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2010,Vo1.26,No.11 强度较稳定.但在去离子水中,随着反应时间的延长, 上升幅度较大,则表明荧光强度不稳定.故选用2% 乙醇为介质,绘制标准曲线以及检测米饭中的,.PL 含量. 口 口 Wavelength/am 图4FITC荧光图谱(pH9.0) Fig.4FITCfluorescencespectra(pH9.0) Wavelength/am 图5添加s-PL后FITC的荧光图谱(pH9.0) Fig.5FluorescencespectraofFITCwith,-PL(pH9.0, 考察了添加和未添加,一PL的FITC溶液在不同 pH环境中荧光强度的变化.图1,图2表明,在去 离子水和2%乙醇介质中,当溶液pH值均为7.0左右 时添加,.PL后FITC荧光强度降低,FITC发生淬灭,: 而在pH9.0的环境中(图4,图5),FITC空白溶液 和添加,一PL的FITC溶液的最大发射峰基本一致, 最大发射波长为519nm,同时FITC和FITC.,_PL这 两个体系在最大发射波长处的荧光强度分别是 185.05和187.292,荧光强度变化不大.因此,在pH9.0 的环境中,添加e-PL不会使FITC发生淬灭.可能 是由于,一PL等电点为9.0左右,pH9.0的环境中,.PL 电离平衡,不带电荷,因而,一PL对FITC没有淬灭 作用.而在中性pH环境下,外界溶液的pH小于,.PL 等电点,故e-PL带正电,FITC属于阴离子化合物, 两者相互作用,FITC发生淬灭,荧光强度降低.因 而本实验选择pH值为7.0. 2.4FITC浓度的选择 1269 在2%乙醇介质中,分别选择0.2mg/L和0.4 mg/L的FITC与不同浓度的,一PL混合,检测其荧光 强度.图6表明,在0.2mg/LFITC的溶液中,,.PL 在0.1~1.5mg/L范围内,随着,.PL浓度的增大,荧 光强度逐渐降低.而在0.4mg/LFITC溶液中,随着 ,一PL浓度的增大,荧光强度并未出现逐渐降低的现 象,没有规律性的变化,故选用0.2mg,L作为FITC 的用量. 想 ,一PL浓度/(mg/L1 图6不同浓度FITC与,.-PL反应的荧光强度变化 Fig.6FluorescenceintensityChangesofdifferent concentrationsofFITCwith,.PL 2.5测定限量 ,一PL浓度/(mgm) 图7荧光强度与,一PL浓度的关系 Fig.7TherelationshipbetweenFluorescenceintensityof FITCandconcentrationof,.PL 以2%无水乙醇为介质,选用0.2mg/L的FITC, 与0,2.0mg/L的,一PL反应,检测荧光强度.图7表 明,,.PL在0.1-0.8mg/L浓度范围内与被检测到的 荧光强度成线性,大于和小于该浓度范围则不能反映 荧光强度与,一PL浓度的线性关系.故荧光淬灭法检 测,一PL的浓度范围为0.1,0.8mg/L. 2.6标准曲线的绘制 在上述优化实验条件下,测定了加入不同浓度 ,.PL后体系荧光强度的变化.在中性pH环境下,以 2%乙醇为介质,配制FITC和,一PL混合液.混合液 中FITC浓度为0.2mg/L,,一PL浓度依次为0.02,0.04, 现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2010,Vo1.26,No.I1 0.06,0.08,0.I,0.2,0.4,0.6,0.8,I.0,I.5,2.0mg/L. 使用荧光分光光度计在kex/em=495nm/519nm,狭缝 ex,em均为1.5nm的状态下测定其荧光值,制作标 准曲线(见图8).以荧光强度10/I,,一PL浓度直线回 归,,.PL浓度与荧光强度具有良好的线性相关,其 线性回归方程为:y=2.0907x+0.8215,线性范围为: 0.1-0.8mg/L. 在0.1-0.8mg/L的,一PL质量浓度范围内,荧光 强度值和,一PL质量浓度变化遵从以下的回归方程 y=2.0907x+0.8215.在上述实验条件下,对米饭中的 ,.PL含量进行检测,其结果列于表1. 表1米饭样品中e-PL含量的检测 Table1Determinationof,-PLcontentsinsamples 从表1可见,利用荧光法可以检测出米饭样品中 的,一PL.,.PL为0.6m100g添加量时,根据标准曲 线,得出测得值与实际值较为接近,回收率达 96.33%.而,一PL为0.30mg/100g添加量时,所测得 的,.PL含量与实际添加量略有偏差,回收率为80%, 可能由于,一PL添加量过低,米饭中成分复杂,干扰 ,.PL的测定.可见利用荧光法测定添加较高剂量 ,.PL的米饭具有可行性.该方法具有很好的选择性 和较高的灵敏度,适用于组成较复杂的分析对象中的 ,一PL含量的测定. 3结论 一 些特殊的物质能使产荧光物质的荧光强度减 弱甚至不产荧光,这就是荧光淬灭现象】.FITC易 溶于水,乙醇等溶剂,易电离产生阴离子,是目前应 用最广泛的荧光素.,一PL易溶于水,属于阳离子聚 合物,与阴离子有强烈的静电作用.因此,,.PL淬 灭FITC荧光机理可理解为,一PL与FITC发生静电作 用的结果.根据本文实验结果可知,,一PL在一定浓 度范围内,随着,一PL的加入及其浓度的增大,体系 的荧光强度逐渐降低. 本文以FITC作为阴离子探针,采用去离子水和 2%乙醇介质简单体系,研究了米饭中,.PL荧光测定 法,测定条件为:激发波长495nm,发射波长519nm, 绘制标准曲线,检测范围为:0.1-0.8mg/L. 本研究建立了用FITC检测食品中,一PL的方法, 为,一PL在应用过程中的定量分析供了一种新的手 段. 参考文献 【1]MJ小佩尔扎,RD里德.武汉大学生物学系微生物学教 研室译.微生物学[M].北京:科学出版社,1987 [2】金丰秋,金其荣.新型生物防腐剂,聚赖氨酸[J].中国食品 添加剂,2003,5:87 [3】尤新.功能性发酵制品[M】.北京:中国轻工业出版社,2000 [4]ItzhakiRF.Colorimetricme~odforestimatingpolylysine andpolyarginine[J].Ana1.Biochem.,1972,50:569—574 [5】KaharP,1wataT,JunHirakl,eta1.Enhancementofe-PL productionbyStreptomycesalbulusStrain410usingpH control[J].Journalofbioscienceandbioengineering.2001, 91(2):190-194 [6]6苏风宜,邢新会.利用荧光素异硫氰酸酯检测季铵盐阳离 子表面活性剂的方法【J】.化工,2008,59(10):2589. 2595 [7]刘超,徐小超,吕鸿周,等.荧光淬灭作用研究黄精凝集素II 微环境与构象的关系【J].四川大学(自然科学版), 2006,43(3):692—696 1270