溶血性链球菌检验.doc

溶血性链球菌检验.doc 【GB/T 4789.11—1994】 食品卫生微生物学检验 溶血性链球菌检验 1 主题内容与适用范围 本标准规定了食品中溶血性链球菌的检验方法。 本标准适用于食品和食物中毒样品中溶血性链球菌的检验。 2 引用标准 GB 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 3 设备和材料 3.1 温箱:36?1?。 3.2 水浴:36?1?。 3.3 显微镜。 3.4 离心机。 3.5 试管架。 3.6 灭菌平皿。 3.7 灭菌小试管。 3.8 载玻片。 3.9 灭菌吸管:1mL、10mL。 3.10 灭菌镊子。 均质器。 3.11 3.12 酒精灯。 3.13 接种环。 培养基和试剂 4 4.1 葡萄糖肉浸液肉汤:按GB 4789.28中4.1规定，在肉浸液肉汤内加入 1%葡萄糖。 4.2 肉浸液肉汤:按GB 4789.28中4.1规定。 4.3 匹克氏肉汤:按GB 4789.28中4.62规定。 4.4 血琼脂平板:按GB 4789.28中4.6规定。 4.5 人血浆。 4.6 0.25%氯化钙。 4.7 灭菌生理盐水。 4.8 杆菌肽药敏纸片(含0.04单位)。 5 检验程序 (图略) 6 操作步骤 6.1 样品处理 称取25g固体检样;称取25mL液体检样，加入225mL灭菌生理盐水，研成 匀浆制成混悬液。 6.2 一般培养 将上述混悬液吸取5mL，接种于50mL葡萄糖肉浸液肉汤;或直接划线接种 于血平板，如检样污染严重，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经36?1?培养24h，接种血平板，置36?1?培养24h，挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。 形态与染色 6.3 本菌呈球形或卵圆形，直径0.5,1μm，链状排列，链长短不一，短者4,8个细胞组成，长者20,30个，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关;液体培养中易呈长链;在固体培养基中常呈短链，不形成芽孢，无鞭毛，不能运动。 6.4 培养特性 该菌营养要求较高，在普通培养基上生长不良，在加有血液、血清培养基中生长较好。溶血性链球菌在血清肉汤中生长时管底呈絮状或颗粒状沉淀。血平板上菌落为灰白色，半透明或不透明，面光滑，有乳光，直径约0.5,0.75mm，为圆形突起的细小菌落，乙型溶血链球菌周围有2,4mm界限分明、无色透明的溶血圈。 6.5 链激酶试验 致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶(即溶纤维蛋白酶)，此酶能激活正常人体血液中的血浆蛋白酶原，使成血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋白。 , 吸取草酸钾血浆0.2mL，加0.8mL灭菌生理盐水，混匀，再加入1824h36?1?培养的链球菌培养物0.5mL及0.25%氯化钙0.25mL(如氯化钙已潮解，可适当加大至0.3%,0.35%)，振荡摇匀，置于36?1?水浴中10min，血浆混合 凝固程度至试管倒置，内容物不流动)。然后观察凝块重新完全溶解物自行凝固( 的时间，完全溶解为阳性，如24h后不溶解即为阴性。 草酸钾人血浆配制:草酸钾0.01g放入灭菌小试管中，再加入5mL人血，混匀，经离心沉淀，吸取上清液即为草酸钾人血浆。 6.6 杆菌肤敏感试验 挑取乙型溶血性链球菌液，涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0.04单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上，于36?1?培养18,24h，如有抑菌带出现即为阳性。同时用已知阳性菌株作为对照。