【doc】3种人抑制素α亚基N末端片段对hCG诱发排卵和胚泡着床的影响

【doc】3种人抑制素α亚基N末端片段对hCG诱发排卵和胚泡着床的影响 3种人抑制素α亚基N末端片段对hCG诱 发排卵和胚泡着床的影响 生殖与避孕(1999)19卷1期7,10页 Reproductian&(m?(1999)19(11:7,lO 7.3种人抑制素0c亚基N末端片段对 hCG诱发排卵和胚泡着床的影响 ? ?7? l强2 to-C-u- 尺f'7, i玺旦:!李文伟姜洁程治平 (上海医科大学妇产科研究所.~St,200011I哈尔滨医科大学生理教研室,咯尔滨,150086) 我们台成j抑制素4亚单位N末端1—32氨基醴(32肤.P).[Tyr]一1—32氨基酸 (33胜,P)和37—6s氨基醢(29脓,P)片段.表实验观察这三个片段对排卵和着床影 响.在PMsG—hcG诱发小鼠超排卵实验中,P具有显着的刺激超排卵作用,P组排卵 率是单纯hCG组的两倍(P<0.001).在着床实验中,利用大鼠双子宫角的特点进行自身 对照实验.在胚泡着床前期,对妊娠大鼠一侧子言角注入100生理盐水作为对照组.另 一 侧注入100l(300ng)抑制素a亚基片段结果除P一例外,均完全阻断胚泡蔷床(P <0.001) 关键词觥舶T' 发现抑制素—激活素一卵泡抑素轴这一调控 垂体FSH—LH分泌的新体系是近年来下丘脑 — 垂体一卵巢轴系统调控机理研究的一个突破性 进展.,,三种亚单位在二硫键联接下的不 同组合形成了作用相反的两个二聚体:抑制素 (,a)和激活素(风,队,日.).a亚单位 为抑制素所特有,有二聚体抑制素才抑衬垂 体FSH分泌【I.2].但是近期的研究表明,在多种 动物卵泡液中有大量游离的a亚单位前体蛋白 存在,大鼠颗粒细胞分泌游离的a亚单位0];大 鼠卵巢亚单位的表达远远高于p亚单位.并 且很多组织只表达亚单位tuRNAr,口亚单 位基因纯合子缺失可致小鼠性腺瘤等等,所 有这些均提示.a亚单位或其前体蛋白虽然没 .本实验为国家生育委员去和黑龙江省教育委员 台资助项目 有垂体生物活性(不抑制FSH分泌),但很可能 具有不同于二聚体抑制素的局部的旁分泌/自 分泌调节作用. 为了a亚单位可能具有局部调节作 用.我们与医科院药物所合作合成了四个抑制 素亚单位片段.首先从功能调节角度观察了 其对大鼠卵巢细胞激素分泌的作用,结果表明 a亚单位片段具有极显着抑制黄体细胞孕酮分 泌作用].本实验进一步观察抑制素a亚单位 N末端1—32氨基酸(32肽.P"')[Tyr]一i一32 氨基酸(33瞻.P")和37—65氨基酸(_99肽. P)片段对排卵和着床影响. 材料与方法 一 ,材料 (一)试剂 抑制素a亚单位N末端1—32氨基徽片段一 } ?8? (32肽,P),I-Tyr]-1—32氪基酸片段(33肽. P")和37—65氨基酸片段(29肽.P")由中国 医学科学院药物研究所合成.孕马血清促性腺 激素(PMsG)购自天津生物错品研究所.人绒 毛膜促性腺激素(hCG)为Sigma公司产品. (二)动物 未成年雌性小鼠,体重16,20g,共35只; 4,8个月育龄健康Wistar大鼠,体重在250士 50g的性周期正常雌性大鼠2只与体重为350 士50g的雄鼠一只台笼,取孕鼠16只实验. 二,方法 (一)促卵泡发育 未成年雌性小鼠,先用小剂量PMSG促使 卵泡发育.然后用hcG诱发排卵,观察3种人 抑制素q亚单位(humaninhibina.hlnq)片段 对hCG诱发排卵的影响. 实验分两大组:对照组和实验组.对照组 (n一11):PMSG+hCG;实验组又分3小组: ), PMSG+hCG再分别加hInq片段P"(10倒PP"组各7倒. 实验分四天进行:第一天,于16:00给所 有动物腹腔注射PMSG5u/只,第二天不进行 处理.第三天8:00实验组动物分别注射hlnq PP和P"i00rig/只/o.2ml;所有各组动物 于11:00注射hCG10U/只/o.2ml.第四天 800,各组动物均用颈椎脱臼法处死,立即取 双稠输卵管用压片法在显徽镜下检卵. (二)旺泡着床的研究 雌性大鼠两只.与雄鼠一只合笼.于次日8 :00做阴栓捡查或阴道涂片.有阴栓或精子者 为妊娠第一天. 抑制素q亚基片段P",P"直接溶于生理 盐水,稀释至3~tg/ml;P用含水乙酸溶解后. 加生理盐水稀释至3~g/m1;P.'对照子宫角的 生理盐水加入适量的乙酸,使其pH值与P相 同. 将妊娠第四天大鼠于15:00,180o乙 醚吸入麻醉后.做l,2cm切口.暴露子宫.用 微量注射器髓机向一侧子宫角注入生理盐水 0.1mI.以黑包线结扎为指征做对照;另一1勇1分 别注入q亚基片段P(I1=6)P(n一5)和P? (n一5)300ngf0.1m1.以白邑线结扎为指征. 注射完毕后缝合切口.于妊娠第ll,l5天剖 腹.肉跟观察双侧子宫角胚胎着床情况.并统计 着床胚胎数和卵巢黄体数. 结果 一 ,促卵泡发育 四组小鼠双侧输卵管压片检卵法显示.对 照组检卵数为22.1?9/只.实验组加入P,P 和P"100ng后.捡卵数分别为44士7.7.23.4 士l4和22士6/只.P组显着加强hCG诱发小 鼠排卵.比对照组增加100(P<0.001).而 P和P"片段未显示促排卵作用(表1) 寰】PP"和P对小?hCG诱发排卵的髟响(;?J Table1EffeelsofP?P"andP'o-hCG—lndu~'edsupenbvulalion'mice【;士jJ 注t'P<0.001与对照组比较 NotesI'P<0?001--comparedwithcontrolgroup 二,胚泡着床的研究 利用大鼠子宫具有两个子宫角的特点.用 一 侧注入a亚基片段,另一侧注入生理盐水为 对照.结果显示,除P组6倒中1例双侧子宫 均为血性积液不予计算外.P.其余5倒及P", P"组实验侧胚胎数均为零.显着地抑制胚胎着 床(,<0.01);而各实验组对照侧之间胚泡着 ?9? 束率无明显差异(,<0.05).而且三组的对照 侧与实验侧黄体数也无差异.表明.本实验所用 大鼠双侧卵巢排卵率无差异(无明显一翻优势 存在);其正常妊娠过程中就有27,33%的 胚泡丢失;三种抑制索n亚基片段P,P和P" 均具有显着的抗胚泡着床作用(见表2,附图. 见图版一). 襄2P",P"和P"对大置着床的影响G~s) Table2EffectsofP.PandP"offlmplIn抽I10nofrats(? 注:.P<O.001与对照组比较CL:corpuslutclim Not亡s.P<0.OOlcomparedwi,h~ontrolside 讨论 抑制索是32KD的nB异构二聚体糖蛋 白,其结构的复杂性和来源的局限性以及高分 子量等特点.给生物纯化和人工合成完整抑制 索分子带来极大的困难.加之抑制紊n亚单位 或其前体蛋白虽然漫有垂体生物活性(不抑制 FSH分泌),怛很可能具有不同于二聚体抑制 索的局部的旁分泌/自分泌调节作用,这些增加 了抑制索研究的难度.由于没有完整的抑翻索 蛋白所以本实验未能同时对比观察片段与完整 结构的作用异同.并且由于有完整的n亚单位 或其前体蛋白的存在,所以不能直接推断本结 果与抑制索作用的相关性. 抑制索亚单位N末端l一32氨基酸片段 P的合成多有报道,井已有商品化的产品.但 该片段对排卵和胚泡谊入,着床的显着影响尚 未见报道.[Tyr3-1—32氨基酸片段P"和37— 65氨基酸片段P的合成尚未见报遭.本实验 观察的抑制索片段对大鼠胚泡植入,着床的摄 显着影响和P对hCG诱发排卵的显着刺激作 用为抑制索a亚单位或其相关蛋白可能是卵巢 局都凋节因子之一的曝说提供了叉一佐证.同 时.本结果为抑制索和抑制索n亚单位或其前 体蛋白结构与功能关系的阐明挺觖了有意的参 考. 参考文献 [1]RivlerC.MeunlerH.Rober~vJ.v^kwllnh一 inlRoleandsecret-岫nintheTat.Ree~n,Prog HormR46t231.1990 [2]DejongFH.SharpRMlEvidc~_,eforinhibin? 1ikeactivityinbovinefoIllc~larfluid.Nature 2671.J976 [3]ckTA.nderSB,ValeW.HsuehAIWl Inhlblnstudiesofstoredandcreledformsby biosyntheticlabelingandimmmuxietectionin euhuredrnrgranu]osacells.Endoerlno]o~-l22 74l,l988 [4]MeunierH.RivierC.EcansRM.kw:Go. nada]andextragonada[expressionofinhibint. ? 10? [5] [6] 卧.andsubunitsinvarioustissuespredictsdi— verBenetioIlt$.PrOCnatlAcadSciUSA85: 247,l988 MatzukMM,FinegoldMJ?SuJ—GJ+Hsueh AjW+BradleyAlalahibinisatumor—suppres- 801"genewithgonad~specificityinmice.Na一 ?3?:3l3.1992 张江红,王启发,程治平,孙颖,鲁桂琛:四种人 抑树素t重基片段对大鼠黄体孕酮分泌的影响与 PKA系统的关系.生殖医学套志5:33,1996 [73张江红,ff己江,程治平,孙颖,鲁桂琛:.抑树 素片段和单艘能冲经递质对大鼠黄体功能的影 响.生理48(3J:284,l996 车文第一作者张江红.女,34岁.副研究员,博士 后 (1997年l2月!1日收稿 EffectsofInhibind—Subuntt—N—TerminalFragmentsP. PandP2,onhCG—InducedSuperovulationandImplatation ZhangJiang—hong-ZhouWen—jiang,LiWen—wei, JiangJie,ChengChi—ping (Instit.teofOBS/G3N.ShanghaiMedicalUniversity.Shanghai200011} '.日arhlnMedicalUnit*rsity.Hat-L{t~l50086 SunYing.LUGUi—chen (1~lsn'tare0fMateriuMed~a.AcademiaSinica.Beig.100050 ABSTRACT Humaninhibina—subunit—N—terminall一32aminoacid(peptide32.P).[ryr]-l一32 (P")and37—65(P")weresynthesized.Inthisexperiment.theeffectsof3fragmentsonovula— tionandimplantationofembryowereobservedPMSG—hCG— inducedsuperovulatlonmouse moddwasusedf0rthetestingofovulation.Among3fragments.onlyPshowedsignificantstim— ulatingeffect0novulation.theovtdationrateinPgroupwastwiceasmuchasincontrol(hCG— inducedsuperovulationrate)(P<0.001).Forimplantationexperiment.100vehiclewasinject— edonesideuterusofpregnantratbeforeimplatationandtheothersideutertlsreeeived1O0"1 (300rig)ofinhlbinframentP.P"andPrespectively.Theresultshowedthatexceptforone caseingroupofP,theyallabsolutelyblocktheimplantationofembryo(P<O.01). Keywords:lnhibindfragments,Superovulation,Anti—implantation . , }l? 一