自动化网织红细胞分析技术及其相关指标的临床应用

自动化网织红细胞分析技术及其相关指标的临床应用 自动化网织红细胞分析技术及其相关指标 的临床应用 国外医学输血及血液学分册2002年第25卷第4期 自动化网织红细胞分析技术及其相关指标 的临床应用 陈晓冰林希综述吴斌审校 【摘要】自动化网织红细胞分析比手工计数法具有更高的精确性,准确性和可重复性,且快 速简便, 可买对反映骨髓造血活动.自动化网织红细胞分析结果,特别是网织红细胞血红蛋白含量对 铁缺乏症/缺 铁贫血的早敷诊断及其它原因所致的贫血的诊断,鉴别诊断和治疗具有较高的临床应 用伊值. 【关键词】网织红细胞检测方法临床应用 网织红细胞计数是常用的检测项目,近年来,人工 镜检观察法逐渐被自动化网织红细胞分析技术所取 代’..本文就自动化网织红细胞分析技术的原理及 相关指标的临床应用研究进展作一综述. l自动化网织红细胞分析技术的原理 自动化网织红细胞分析技术的基本原理是利用网 织红细胞胞浆中残存的RNA能特异性结合某些染料, 如ThiazoleOrange(TO),AuramineO,Oxazine750, 作者单位:350005福卅1,福建医科大学附属第一医院儿科 Newmethyleneblue等.用这些染料对EDTA处理过的 全血进行染色,通过测定网织红细胞的染色强度来检测 网织红细胞数量及其各项参数.测定网织红细胞染色 强度的方法分为两种:荧光度法(如使用TO或Au— ramineO的系统)和吸光度法(如使用Oxazine750或 Newmethyleneblue的系统).二者分别通过测量与网 织红细胞RNA相互作用的染料的荧光素强度或吸光 度进行网织红细胞计数与分析.采用TO的荧光度法 容易过多估计网织红细胞的数量,尤其是在白细胞,血 小板或HowellJolly小体异常增多时I2J,吸光度法敏 适合于人类基因治疗.过去几年中,新的病毒制备技术 提高了从V病毒载体的效价,并清除了腺病毒的污 染,促进了r从V在体内基因转移中的应用,对杂合型 载体和各种从V血清型载体基因转移的实验研究拓 展了从V在不同细胞类型中的应用,研究人员也正致 力于可调节性载体和针对于不同细胞类型载体的研究, 使r从V在人类疾病基因治疗中展现出广阔的前景. 5 l 2 3 4 参考文献 RichterM,1wataA,NyhuisJ,eta1.PhysiolGeno,2000,2:ll7 HandaA,MuramatsubS,QiucJ,eta1.JGenVirol,2000,8l:2077 ZabnerJ,SellerM,WaltersR,etalJVirol,2000,74(8):3852 WaltersRW,YiSMP,KeshavjeeS.eta1.JBiolChem,2001,276(23): 206l0 RizzmoG,GorgoniB,CappellettiM,etalJVirol,1999,73(3):2517 SamuelM,YoungJ,DouglasM.etalJVi?l,2000,74(9):3953 ChatterjeeS,LiW,WongCA,eta1.Blood,1999,93(6):l882 XiaoX,LiJ,SamulskiRJ.etalJVirol,1998,79(3):2224 SalveuiA.OreveS,ChadeufG,etalHumGeneTher,l998,9:695 MonahanPE,SamulskiRJ,TazelaarJ.etd,GeneTher,l998,5:40 KNudo~N.BrownKE,WaltersRW,eta1.Jviml,2001,75(15):6884 l2 l3 14 l5 16 XiaoWD,ChimmleN,BertaSC,etalJVirol,1999,73(5):3994 DavidsonBL,SteinCS,HethJA,eta1.ProcNatlAcadSci,2000,97 (7):3428 HalbertCL,RutledgeEA,AllenJM,etalJVirol,2000,74(3):1524 DuanDS,YanzY,YueYP,etalJVirol,200l,75(16):7662 BurtonM,NakaiH,ColosiI,etalProcNatlAcadSci,1999,96(22): l2725 ArrudaVR,HagstromJN,1)eitchJ,etd,Blood,2001,97(1):130 KoeberDD,exanderIE,ttalbertCL,a1.ProcNatlAcadSci,1997, 94:l426 HerzogRW,HagstromJN,KungSH,etalProcNatlAcadSci,1997, 94:5804 NakaiH,HerzogRW,Hags:romJN,etalBlood,1998,9l:4600 WangLL,TakabeK,BidlingmaierSM,etalProcNatlAcadSci,1999, 96(7);3906 KayMA,MannoCS,RagniMV,etalNatGenet,2000,24:257 NathwaniAC,DavidoffA,HanawaH,etalBlood,2001,97(5):1258 GeY,PowellS,RoeyMV,eta1.Blood,2001,97(12):3733 KesslerPD,PodsakoffGM,ChenXJ,etalProcNatlAcadSci,1996, 93:l4082 BOblD,SalvettiA,MounierP,etalBlood,1998,92(5):1512 BohlD.BoschA,CardonaA,eta1.Blood,2000,95(9):2793 341 “加 )678q? 感性强,上述因素不会干扰网织红细胞的分析,因 此,网织红细胞分析技术的发展趋势倾向于采用吸光度 法.目前,临床上常用的几种自动化网织红细胞分析系 统虽然采用的染料不同,测定方法及检测的参数也有所 不同,但大多基于上述原理. 2自动化网织红细胞分析技术的优点 与全血细胞计数相比,网织红细胞参数可随骨髓红 细胞造血变化而及时发生变化,为骨髓红细胞造血活动 提供”实时”监测.除网织红细胞计数外,自动化网织红 细胞分析还能进行以下指标的测定:(1)网织红细胞相 关指标测量,包括网织红细胞血红蛋白含量(CH),平 均网织红细胞容积(MCV),平均网织红细胞血红蛋白 浓度(CHCM),网织红细胞体积分布宽度(RDW),网 织红细胞血红蛋白含量分布宽度(HDW)和网织红细 胞细胞血红蛋白浓度分布宽度(CHDW).(2)网织红 细胞成熟度分级,如高荧光素网织红细胞(HFR),中荧 光素网织红细胞(MFR)和低荧光素网织红细胞 (LFR).越不成熟的网织红细胞RNA含量越高,染色 强度也越高.代表网织红细胞成熟度的三种指数分别 是:网织红细胞成熟指数(RMI),高荧光素网织红细胞 数(HFR),不成熟网织红细胞比例(IRF,=HFR+ MFR). 研究证实:人工镜检计数法主观性大,精确性,准确 性和可重复性差.与此相比,自动化网织红细胞分析检 测是一种更客观,更准确的测量网织红细胞百分数和绝 对值的方法,其既可定性又可定量,同时,测定的变异系 数小,精确度高,具有良好的可重复性.研究证实-4J: CH,MCV,CHCM的变异系数为0.8%,1.6%,尤其 是CH.血样的贮存可能会引起MCV的升高和 CHCM的降低,但CH却保持相对稳定. 3自动化网织红细胞计数及其相关指标的临床应用 3.1网织红细胞计数及其相关指标在贫血诊断和治疗 中的应用 3.1.1缺铁性贫血(IDA)和铁缺乏症(ID)的诊断和治 疗Brugnara等_5J采用盲法随机试验评价CH和传统 诊断ID/IDA指标临床价值.Logistic多元回归分析显 示:只有CH与血红蛋白(Hb)对ID诊断,CH对IDA 诊断有统计学意义;受试者工作特征曲线分析显示: CH诊断准确度明显高于铁蛋白;以CH<26pg界值, 诊断ID的敏感度和特异度分别为70%和78%,诊断 IDA的敏感度和特异度分别为83%和75%;当CH< 20pg时,患ID的可能性>90%,而CH>29pg时,患 342 圈:塑垦兰坌盟堡笙鲞笙塑 ID的可能性接近于0.CH在口服铁剂治疗后1,2周 就能可靠地鉴别患者对口服铁剂治疗有无反应;严重 IDA患者采用静脉注射铁剂治疗后CH,MCV和 CHCM迅速提高.因此,自动化网织红细胞分析+全 血细胞计数可完全胜任ID和IDA的诊断;CH为代表 的网织红细胞参数是监测铁剂治疗早期反应的良好指 标.其优点在于:?自动化检测,操作简便,诊断的敏感 度,特异度高;?其成本一效益比极佳,且需血量明显减 少,非常适合儿童的血液学检查. 3.1.2VitB,治疗巨幼红细胞性贫血的疗效监测 VitB,治疗巨幼红细胞性贫血的早期反应为网织红细 胞体积变小,以至小于外周血循环中的成熟红细胞体 积,即MCV/MCV比值倒置.随后,MCV/MCV比值 才逐渐恢复正常.因此,MCV/MCV比值可作为 VitB,治疗巨幼红细胞性贫血的疗效监测指标_6j. 3.1.3镰刀状红细胞性贫血的诊断和治疗镰刀状红 细胞血红蛋白病(HbSC病)的鉴别特征之一是产生脱 水的高密度网织红细胞(CHCM>38g/d1).羟基脲 (Hydroxyurea)治疗HbSC病的早期反应是网织红细胞 体积增加和镰刀状红细胞脱水状况改善.在羟基脲治 疗2周后网织红细胞绝对数减少,CHCM下降,MCV 和MCV上升,高密度红细胞(CHCM>38g/d1)数减 少_7j.近来研究证实,Mg可抑制K—Cl协同转运, 改善细胞脱水状况,故口服镁制剂可用于治疗HbSC 病.经镁制剂治疗后高密度红细胞数减少,RDW, HDW和HDW下降,但Hb和网织红细胞绝对数保持 不变. 3.1.4再生障碍性贫血的诊断和治疗再生障碍性贫 血的网织红细胞计数极低(<0.03×10/L),不成熟细 胞比例<l0%.在抗胸腺细胞球蛋白,环孢素A和粒 细胞集落刺激因子联合治疗重度再生障碍性贫血的治 疗反应监测中,HFR可作为可靠的早期预测指标. HFR上升至>5%预示在7,l4天内多形核细胞将上 升并>0.5×10/L. 3.2网织红细胞计数及其相关指标在重组人促红细胞 生成素(rHuEPO)的疗效评价与监测中的应用 rHuEPO广泛应用于肾性贫血,肿瘤或艾滋病引起 的贫血及围手术期的治疗,但可引起功能性ID_1,内 源性EPO生成增加(如免疫溶血性贫血时)也可导致功 能性ID_6J.口服铁剂治疗不能满足rHuEPO引起的需 铁量增长,静脉注射铁剂能提高rHuEPO疗效,却容易 过量导致急慢性毒性反应.研究显示I1:使用皮下注 射rHuEPO+静脉注射铁剂治疗血液透析患者,其CH 国外医学输血及血液学分册2002年第25卷第4期 可保持正常;透析患者CH<26pg时,均有运铁蛋白饱 和度(Tfsat)下降,红细胞比容(Hct)下降和近期rHuE— PO剂量增加的治疗史.研究证实[12J:铁代谢指标对慢 性肾功能衰竭患者的铁营养状态监测无临床价值,但以 静脉注射铁剂治疗后网织红细胞数增加作为诊断功能 性ID的金,CH<26pg诊断功能性ID的敏感度为 100%,特异度为80%.提示,与血清铁蛋白,Tfsat或 低色素红细胞%相比,CH对长期血液透析患者ID的 预测更准确,为监测长期血液透析患者铁营养状态的可 靠指标. 33网织红细胞计数及其相关指标在骨髓移植后造血 功能重建早期诊断中的应用 研究发现6j,在骨髓移植前的化疗过程中,MCV, 进行性下降,发生暂时性的MCV/MCV比值倒置;在 移植后造血功能重建的早期,MCV迅速上升至超过参 考值.但网织红细胞计数和成熟度指标在骨髓移植或 外周血干细胞移植后造血功能重建的早期诊断中的应 用一直存在争议.一些研究认为RMI,HFR,IRF和平 均荧光素指数(MFI)能提供比血小板或白细胞更早的 造血功能重建的信息[13J.最新研究指出,当HFR达到 3%,IRF10%,MFI10,MCV110fl时可以判定红细胞 系已重建.IRF和MFI的上升均明显早于白细胞数的 上升,且二者相互关联.在异体移植中,MFI与随后的 白细胞数上升相互关联;在自体移植中,MCV与随后 的白细胞数上升相互关联.MFI与MCV的临界值对 确定随后的髓细胞系重建有重要意义l14J.但另一种观 点认为这些指标与白细胞计数相比,是否具有优越性还 不肯定.考虑到网织红细胞成熟度分析技术本身的局 限性,需作更多的研究才能证实RMI,HFR和IRF的 临床意义,尤其是这些指标提供的信息是否准确及这些 信息是否有助于更加有效的治疗l15J. 4自动化网织红细胞分析技术局限性和未来应用前景 自动化网织红细胞分析技术本身还存在一些局限性: (1)标准化问题,包括样品采集,染色技术,检测仪器及 数据分析等的标准化[.由于采用的自动化网织红细 胞分析系统及染色方法不同,定义网织红细胞参数和参 考值范围的标准不同,参考值范围不统一.此外,尚未 建立校准体系,没有特定的用于质控的校准参数…; (2)网织红细胞成熟指数检测的可靠性常受到质 疑l.16j,这是由于可用于计数的HFR过少,低于网织 红细胞总数1%.同时,HFR检测易受其他细胞成分的 干扰,例如:白细胞可能被荧光素染色而落入HFR区 域,导致高估HFR.有核细胞,有疟原虫寄生的红细胞 或带有Howell—Jolly小体的红细胞也将导致高估 IRF.因此,将来需要比较不同的自动化网织红细胞分 析系统并进行操作规程和数据分析等的标准化,筛选稳 定和可被广泛接受的校准参数,以及确定参考值范 围【’J.同时,对网织红细胞相关指标的临床应用价 值需作进一步研究. 5参考文献 lTurowskiD,WysockaJ,ButkiewiczAMFoliaHistochemCytobiol, 2000,38(1):3l 2DavisBH,BigelowNCHematolOncolClinNorthAm,1994,8(4):617 3BrugnaraC,HippMJ,IrvingPJ,eta1.AmJClinPathol,1994,102(5): 623 4SandbergS,RustadP,JohannesenB,eta1.EurJHaematol,1998,61 (1):42 5BrugnaraC,ZurakowskiD,DiCanzioJ,eta1.JAMA,1999,28l(23): 2225 6d’OnofrioG,ChirilloR,ZiniG,etalBlood,1995,85(3):818 7SteinbergMH,NagelRL,BrugnaraC.BrJHaematol,1997,98(4):838 8DeFranceschiL,BachirD,GalacterosF,etalBrJHaematol,2000,108 (2):284 9SicaS,SoraF,LaurentiL,eta1.CllnLabHaematol,1999,21(6):387 10MittmanN,SreedharaR,MushnickR,eta1.AmJKidneyDis,1997,30 (6):912 llBesarabA,AminN,AhsanM,eta1.JAmSocNephrol,2000,ll(3): 530. 12FishbaneS,GalganoC,LangleyRC,eta1.KidneyInt,1997,52(1):217 13d’0nofrioG,TichelliA,FouresC,etalClinLabHaematol,1996,l8 (supp1):145 14TorresA,SanchezJ,LakomskyD,etalHaematologica,2001,86 (1):24 15BrugnaraC.IntJClinLabRes,1998,28(1):l l6VillamorN,KirschA,HuhnD,etalClinLabHaematol,1996.18 (2):89 17CharuruksN,LimpanasithikulW,VoravudN,eta1.JMedAssocThai, 1998,8l(5):357 343