IPTG诱导的外源蛋白表达

1.课题来源：实验步骤：接种扩大培养IPTG诱导蛋白提取、纯化思考：IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用原理？第一页，共25页。2.IPTG的作用原理IPTG(isopropylthiog-alactoside,异丙基硫代半乳糖苷):化学合成的乳糖类似物，很强的β－半乳糖苷酶诱导剂，诱导乳糖操纵元(lacoperon)的开放，自身不被催化分解。类似的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)也是一种人工化学合成的半乳糖苷，可被β－半乳糖苷酶水解产生兰色化合物，因此可以用作β－半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG和X-gal都被广泛应用在分子生物学和基因工程的工作中。第二页，共25页。2.IPTG的作用原理第三页，共25页。2.1乳糖操纵元（lacoperon）大肠杆菌利用乳糖至少需要需要两个酶：促使乳糖进入细菌的乳糖透过酶(lactosepermease)和催化乳糖分解第一步的β－半乳糖苷酶(β-galactosidase)。在环境中没有乳糖或其他β-半乳糖苷时，大肠杆菌合成β-半乳糖苷酶量极少，加入乳糖或其类似物2-3分钟后，细菌大量合成β-半乳糖苷酶，其量可提高千倍以上，在以乳糖作为唯一碳源时，菌体内的β-半乳糖苷酶量可占到细菌总蛋白量的3%。第四页，共25页。2.1乳糖操纵元（lacoperon）乳糖操纵元含有ｚ、ｙ和ａ3个结构基因。ｚ基因表达产物为β-半乳糖苷酶，催化乳糖转变为别乳糖(allolactose)，再分解为半乳糖和葡萄糖；ｙ基因编码半乳糖透过酶，促使环境中的乳糖进入细菌；ａ基因编码转乙酰基酶，以二聚体活性形式催化半乳糖的乙酰化。第五页，共25页。2.1乳糖操纵元（lacoperon）第六页，共25页。2.1乳糖操纵元（lacoperon）ｚ基因5’侧具有大肠杆菌核糖体识别结合位点（ribosomebindingsite，RBS）特征的Shan-Dagano(SD)序列，因而当乳糖操纵元开放时，核糖体能结合在转录产生的mRNA上。第七页，共25页。由于ｚ、ｙ、ａ三个基因头尾相接，上一个基因的翻译终止码靠近下一个基因的翻译起始码，因而同一个核糖体能沿此转录生成的多顺反子（polycistron）mRNA移动，在翻译合成了上一个基因编码的蛋白质后，不从mRNA上掉下来而继续沿mRNA移动合成下一个基因编码的蛋白质，一气依次合成这基因群所编码所有的蛋白质。2.1乳糖操纵元（lacoperon）第八页，共25页。2.2乳糖操纵元（lacoperon）的负调控操纵子（o）序列位于启动子（p）与被调控的基因之间，部分序列与启动子序列重叠。在乳糖操纵元中，调控基因lacI位于Plac邻近，有其自身的启动子和终止子，转录方向和结构基因群的转录方向一致，编码产生由347个氨基酸组成的调控蛋白R。第九页，共25页。2.2乳糖操纵元（lacoperon）的负调控第十页，共25页。2.2乳糖操纵元（lacoperon）的负调控当大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，lac操纵元处于阻遏状态。此ｉ基因在其自身的启动子Pi控制下，低水平、组成性表达产生阻遏蛋白R，每个细胞中仅维持约10个分子的阻遏蛋白。R以四聚体形式与操纵子ｏ结合，阻碍了RNA聚合酶与启动子Plac的结合，阻止了基因的转录起动，从而阻遏了这群基因的表达。第十一页，共25页。2.2乳糖操纵元（lacoperon）的负调控第十二页，共25页。2.2乳糖操纵元（lacoperon）的负调控当环境中有足够的乳糖时，乳糖受β-半乳糖苷酶作用转变为别乳糖，别乳糖与R结合，使R的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类，β－半乳糖苷酶在细胞内的含量可增加1000倍。这就是乳糖对lac操纵元的诱导作用。第十三页，共25页。2.2乳糖操纵元（lacoperon）的负调控在这过程中乳糖（实际起作用的是别乳糖）就是诱导剂，与R结合起到去阻遏作用（derepression），诱导了利用乳糖的酶类基因转录开放第十四页，共25页。2.3乳糖操纵元（lacoperon）的正调控细菌中的cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解产生能量时，cAMP生成少而分解多，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就升高。第十五页，共25页。2.3乳糖操纵元（lacoperon）的正调控细菌中有一种能与cAMP特异结合的cAMP受体蛋白CRP（cAMPreceptorprotein），当CRP未与cAMP结合时它是没有活性的，当cAMP浓度升高时，CRP与cAMP结合并发生空间构象的变化而活化，称为CAP（CRP-cAMPactivatedprotein），能以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。第十六页，共25页。2.3乳糖操纵元（lacoperon）的正调控第十七页，共25页。2.3乳糖操纵元（lacoperon）的正调控在lac操纵元的启动子Plac上游端有一段序列与Plac部分重叠的序列，能与CAP特异结合，称为CAP结合位点（CAPbindingsite）。CAP与这段序列结合时，可增强RNA聚合酶的转录活性，使转录提高50倍。相反，当有葡萄糖可供分解利用时，cAMP浓度降低，CRP不能被活化，lac操纵元的结构基因表达下降。第十八页，共25页。2.3乳糖操纵元（lacoperon）的正调控由于Plac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使lac操纵元转录开放，还不能使细菌很好利用乳糖，必需同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。lac操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在又需要没有葡萄糖可供利用。通过这机制，细菌是优先利用环境中的葡萄糖，只有无葡萄糖而又有乳糖时，细菌才去充分利用乳糖。第十九页，共25页。2.3乳糖操纵元（lacoperon）的正调控不难看出：CAP结合位点就是一种起正性调控作用的操纵子，CAP则是对转录起正性作用的调控蛋白──激活蛋白，编码CRP的基因也是一个调控基因，不过它并不在lac操纵元的附近，CAP可以对几个操纵元都起作用。从上所述，乳糖操纵元属于可诱导操纵元（inducibleoperon），这类操纵元通常是关闭的，当受效应物作用后诱导开放转录。这类操纵元使细菌能适应环境的变化，最有效地利用环境能提供的能源底物。第二十页，共25页。3乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用运用乳糖操纵元控制外源蛋白表达的目的：在需要菌体大量繁殖时，为了提供更多的物质和能量确保菌体正常快速的生长，需要将外源基因关闭。菌体浓度达到要求时，可通过诱导使菌体表达大量外源蛋白。第二十一页，共25页。3乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用在我们所使用的PGEX载体中，插入了乳糖操纵元的调控基因lacIq和启动子Plac，其后紧接GST基因、外源基因。这些基因头尾相接，上一个基因的翻译终止码靠近下一个基因的翻译起始码，因而同一个核糖体能沿此转录生成的多顺反子mRNA移动，在翻译合成了上一个基因编码的蛋白质后，不从mRNA上掉下来而继续沿mRNA移动合成下一个基因编码的蛋白质，一气依次合成这基因群所编码所有的蛋白质。第二十二页，共25页。vectorinformationMCSregion3乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用第二十三页，共25页。3乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用IPTG诱导的表达载体必须以过表达lac阻遏物的大肠杆菌为宿主，才能阻止外源基因在诱导前的转录。由于大多数IPTG诱导的表达质粒拷贝数很高（30~600），因此需要过量阻遏物才能阻断基础表达（渗漏表达）。单拷贝的lacIq等位基因可以表达过量10倍的lac阻遏物但是，如果外源蛋白对宿主的毒性非常强，或者质粒拷贝数非常高，就需要将lacIq等位基因克隆进表达质粒，确保紧密调节。第二十四页，共25页。3乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用IPTG诱导的条件：一般：0.5mM28℃3.5hours通过调节温度和IPTG的浓度，诱导表达质粒慢转导，防止外源蛋白表达过快而形成包涵体。影响大肠杆菌中获得高表达水平的重要因素可能是生长温度，通过实验确定最佳温度，是表达外源蛋白的关键。表达量低高温诱导易形成包涵体低温诱导第二十五页，共25页。