硫蛋白改善糖尿病大鼠肾脏氧化应激

锌诱导肾脏I型金属硫蛋白改善糖尿病大鼠 肾脏氧化应激 ImprovementofRenalOxidativeStressThroughInductionofRenal 、MetallothioneinSynthesisbyZincSupplementationinDiabetic NephropathicRats 杨勤，张晓林，孙迪，杨婷，谢汝佳，方丽 (贵阳医学院病理生理学教研室，贵阳550004) YANGQin，ZHANGXiao—lin，SUNDi，YANGTing，XIERu-jia，FANGLi (DepartmentofPathophysiology，GuiyangMedicalCollege，Guiyang550004,China) 锌是金属硫蛋白(metallothionein，MTs) 基因达的诱导因子⋯。MTs是富含半胱氨酸、可 诱导的、多功能、小分子量金属结合蛋白，在抗 氧化、维持微量元素自稳态、重金属解毒等方面 有重要作用旧。。本研究以口服硫酸锌诱导糖尿病 大鼠肾脏MT一1基因表达，探讨其对糖尿病肾病的 保护作用。 1材料与方法 1．1试剂 链脲菌素(STZ；Sigma)；兔抗鼠单克隆MT-1 抗体(SantaCruz)；血糖、肌酐、尿蛋白检测 试剂盒(北京迈克>；RNA纯化试剂盒、SYBRgreen、 MuLV逆转录酶、RNase、Trizol、dNTP、TaqDNA 聚合酶等主要试剂(AppliedBiosystems)；MDA、 SOD检测试剂盒(南京建成生物工程研究所) 1．2动物分组及动物模型复制 雄性Wistar大鼠50只，体重180～2009，上海 实验动物中心提供。适应性饲养1w后，将动物随 机分成：正常(N，／7=10)、糖尿病(DN，／7=15) 正常加锌(N+Zn，17=10)及糖尿病加锌(DN+Zn。 刀=15)四组。DN及DN+Zn组尾静脉单次注射溶于 无菌柠檬酸钠缓冲液的链脲菌素(55mg／kgbw) 诱导糖尿病，N及N+Zn组注射等量无菌柠檬酸钠 缓冲液。注后48h，测定空腹血糖，凡是大于 13．7mmol／L，且尿糖阳性的认为糖尿病模型成 立，列入实验。N+Zn组及DN+Zn组于注射当日开始 饮用含硫酸锌5mg／kg的自来水，N及DN组饮用 自来水，共12w。实验期间动物自由进食、不用胰 岛素及其它降糖药物。 1．3观察指标及方法 1．3．1血、尿及肾脏生化检测：实验结束时大鼠 称重，代谢笼收集24h尿，考马斯亮兰法测尿蛋 白。取血，分离血清，氧化酶法测血糖、血肌酐。 取肾，称肾重，一侧肾用于分子生物学和生化检 测。取肾皮质组织100mg，制备1％匀浆，严格按试 剂盒说明书操作，钡IJMDA水平及总SOD活性。 1．3．2肾脏病理学检查：另一侧肾用4％中性甲醛 固定，石蜡包埋切片，HE和PAS染色，镜下观察肾 小球、肾小管、肾间质的病变，并对PAS染色切片 用Biomias99图象分析系统测量基底膜厚度(每 例测量5个肾小球)。 1．3．3MT一1mRNA表达水平测定：取肾皮质组织 100mg，Trizol抽提总RNA，纯化，用RT—PCR方 法测mRNA水平。逆转录条件为：25℃10min) 48℃60min，95℃5min。PCR反应系统采用 SYBRG，按操作程序进行。反应总体积为50“l， 反应条件为50℃2min；95℃10min；95℃15s； 60℃1min，重复40个循环，保存循环域值(Ct)。 以每例标本组织的目的片段与带内参片段的ct比 收稿日期 2007-05—20 基金项目 本课题受教育部春晖国际合作项目(No．Z2005—52018)；贵州省高层次人才基金资助 作者简介杨勤(1964一)，女。教授，医学博士，E-mail：qinyyang@gmc．edu．cn 中图分类号R151．4 文献标识码B 文章编号0512—7955(2008)02—0220-03 万方数据 值作为该标本的基因表达的相对数值。引物序列 如下：13一actin：上游5’-ACCACCATGTACCCAGG CAT-3，下游5’一CCGGACTCATCGTACTCCTG一3’； MT-1：上游5’-GTGCCC从GGCTGCATCT一3’下游 5’ 一GGTCACGGTCAGGGTTGTACA一3’。 I．4统计学分析 用SPSS10．O统计软件进行组间方差分析。 2结果 2．1锌对血糖、24h尿蛋白量、肾重／体重的影响 Table1 Thelevelsofbloodglucose·24hurinary proteinandkidneyweight／bodyweight(n=8，i士s) a：P<0．01VSNgroup；CP<0．05VSDNgroup； N：controlgroup：N+Zn：conn'olwithZnsupplementation； DN：diabeticnephropathy；DN+Zn：diabeticnephropathy withZnsupplementation；KW：kidneyweight，BW： bodyweight；GBM：glomcrulousbasementmembrane； thesameinthefollowingtable 表1显示，DN组血糖、24h尿蛋白均较N组增高， 差异显著(PO．05)；DN+Zn组肾脏MT一1基因表达显著 增加，与N+Zn组及DN组比，差异显著(尸<0．05)。 N+Zn组肾脏SOD活性、MAD水平与N组比，无明显变 化，但DN组肾脏SOD活性较N组明显降低(尸< 0．05)，而MAD水平较N组明显增高(P·H<,2>O实现,实际饲粮锌浓度为15.18 mg/kg、30.75 mg/kg、36.91 mg/kg、 45.03 mg/kg、58.67 mg/kg、76.79 mg/kg、101.75 mg/kg、137.62 mg/kg）,测出MT总量及Zn-MT含量与饲粮锌水 平的相关性. 3.期刊论文 王达.朱京慈.Wang Da.Zhu Jing-ci 锌7-金属硫蛋白对深Ⅱ度烧伤创面脂质过氧化反应的影响 -中国 组织工程研究与临床康复2009,13(12) 背景:研究表明锌-金属硫蛋白具有明显的清除氧自由基和保护生物大分子的功能.目的:观察锌7-金属硫蛋白对大鼠深Ⅱ度烧伤创面脂质过氧化反应 的影响及在创面愈合中的作用.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-10/2009-01在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所第二研究室完 成.材料:健康雄性Wistar大鼠78只,随机分为2组,锌7-金属硫蛋白保护组、生理盐水组各36只,各组观察时相点为伤后12,24,48 h及7,14,21 d,每时相点 6只.方法:将大鼠背部置于98℃水中8 s,造成大鼠背部15%的深Ⅱ度烫伤创面.2组均于伤后即刻给药,锌广金属硫蛋白保护组与生理盐水组分别外敷单层纱 布浸润的浓度为1×105mol/L的锌7-金属硫蛋白以及等渗盐水,第1天每4 h换药1次,第2,3天每8 h换药1次,此后每日换药1次,直至创面愈合.主要观察指标 :伤后7 d开始采用硬纸片质量间接法测创面愈合率.伤后各时相点取创面组织标本(创面已愈合则取瘢痕组织),分别测羟脯氨酸、丙二醛含量和超氧化物 歧化酶活性.结果:伤后7,14,18,21 d锌7-金属硫蛋白组创面愈合率高于生理盐水组(P<0.05);且锌7-金属硫蛋白组伤后48 h,7 d,14 d,超氧化物歧化酶活 性降低程度和丙二醛含量升高程度与生理盐水组比较差异有显著性意义(P<0.05);锌7-金属硫蛋白组在伤后48 h,7 d羟脯氨酸含量减少程度显著低于生理 盐水组(P<0.05),且在14 d时含量已接近正常水平.结论:锌7-金属硫蛋白对大鼠深Ⅱ度烧伤创面有促愈合作用,其促愈机制与使用锌7-金属硫蛋白后创面 脂质过氧化反应程度减轻有关. 4.期刊论文 陈伟强.程义勇.李树田.王冬兰.于志杰.洪燕 锌对应激大鼠海马金属硫蛋白亚型表达的调控作用及机 制研究 -卫生研究2005,34(2) 目的观察不同锌摄入水平对应激大鼠海马脑区不同金属硫蛋白亚型表达的影响.方法将Wistar雄性大鼠随机分为8组:正常对照组、对喂组、缺锌组和 补锌组及其相应的应激组,分别给予正常饲料、缺锌饲料和补锌饲料,以缺锌动物当日的饲料摄入量作为对喂动物次日的给料量.动物喂饲1周后开始束缚 应激,持续4周.以血红蛋白镉饱和法测定脑组织金属硫蛋白含量,分离海马提取总RNA,以RT-PCR检测金属硫蛋白亚型MT-1 mRNA和MT-3 mRNA.结果缺锌动物 出现血锌含量明显降低,脑组织金属硫蛋白含量和海马金属硫蛋白mRNA的表达均出现降低,但其表达在缺锌应激组动物仍有明显升高;而补锌动物金属硫蛋 白的表达有所增加,补锌应激组动物的表达增加更加明显.缺锌和缺锌应激组动物的血浆皮质醇、IL-1、IL-6和NO水平也较其它组显著升高.结论缺锌可降 低动物脑和海马组织中金属硫蛋白的表达,但缺锌动物在接受应激刺激后,金属硫蛋白的表达仍可明显增加;而补锌可增加金属硫蛋白的表达,补锌应激使 脑组织中金属硫蛋白的表达升高更为显著;应激对动物的损伤作用与其锌营养状况有关,缺锌可降低机体对应激的抵抗能力. 5.会议论文 李慧祺.梁艺怀.雷立健.金泰廙 镉锌与金属硫蛋白抗体对金属硫蛋白的竞争结合 2008 [目的]探讨镉锌与金属硫蛋白抗体(MF-Ab)对金属硫蛋白(MT)的竞争结合.[方法]竞争ELISA法,通过光密度值判断竞争结合的程度.[结果]选择包被 MT浓度为1μg/mL,MT-Ab浓度为1:1000,随着镉锌离子浓度增加,光密度值下降.[结论]镉锌与MT-Ab对MT的结合存在着竞争作用;Cd与MT的结合更容易被MT- Ab竞争. 6.期刊论文 生吉萍.申琳.茹炳根.SHENG Ji-ping.SHEN Lin.RU Bing-gen 富锌培养对转金属硫蛋白侧耳菌丝生长 和锌有机化程度的影响 -光谱学与光谱分析2009,29(3) 金属硫蛋白(MT)是一种低分子量、高巯基含量、能结合金属离子的功能性蛋白,将MT基因转入蘑菇,可以获得具有重要生理功能的蘑菇以便为保健食 品生产提供原料,但对MT蘑菇的富锌能力缺乏系统研究.文章报道了用电感耦合等离子体-原子发射光谱(ICP-AES)法对富锌培养中的MT侧耳 (Pleurotusostreatus)菌丝和未转化的侧耳菌丝(对照)锌含量进行了测定,分析了MT侧耳菌丝的耐锌能力、富锌特性和锌有机化程度.结果发现转MT侧耳 在锌浓度0～1.2 mmol·L-1范围内菌丝生长速度最高,超过1.6mmol·L-1时菌丝生长开始受到抑制;转MT侧耳有较强的富锌能力,当培养液中锌质量浓度为 0.6～1.2mmol·L-1时,菌丝体中锌含量在2.56～27.49 mg·kg-1之间,与锌添加量呈正相关,且此浓度范围内菌丝体的生长情况良好;在锌浓度为0.6 mmol·L-1的液体培养基中,第7 d转MT侧耳菌丝锌有机化程度为88.7%,比对照(82.1%)显著提高(a=0.05),说明转入侧耳的MT、有利于无机锌向有机锌转化 ;对在不同浓度下培养7 d的两种菌丝测定发现,其有机化程度差异不显著,说明锌与菌体内的物质已经紧密结合形成有机锌复合物,锌浓度对锌的吸收量有 影响但对锌的有机化程度影响不大. 7.学位论文 周彦锋 水体中的重金属镉和锌对鲫鱼金属硫蛋白的诱导 2008 金属硫蛋白( metallothionein，MT)是一类相对低分子质量(6—7kDa)、富含半胱氨酸、能够结合金属的蛋白或多肽。水体中的重金属可以诱导鱼体 内金属硫蛋白的表达。本研究以鲫鱼(Carassius auratus)为试验材料，通过体外静态染毒，采用血红蛋白饱和分析法，研究了在一定环境条件下，经不 同浓度重金属镉和锌的连续暴露后，鲫鱼肝脏、肾脏、鳃丝和肌肉中MT含量的动态变化，为建立以金属硫蛋白作为评判淡水生态系统中重金属镉和锌污 染的生物标志物提供理论依据。研究结果表明： 1.平均体长为16.32±0.63cm，平均体重为320.6±6.19g的鲫鱼不同组织中的MT本底值存在着显著 差异(P<0.05)，含量顺序为肝脏>肾脏>鳃丝>肌肉，鳃丝、肌肉、肝脏和肾脏中MT含量范围分别为1.506～2.014、1.367～1.868、3.018～4.169和 2.582～3.602μg·g-1。在相同试验条件下，受试鲫鱼组织中的MT本底值稳定在同一水平，差异不显著(P>0.05)；水温16.5±1℃和26±1℃时鲫鱼同一 组织中MT含量差异显著(P<0.01)，但组织间MT含量顺序不变。 2.在水温为16.5±1℃时，与对照组相比，在0.005、0.05、0.10、0.25和0.5 mg·L-1浓度下镉胁迫对鲫鱼4种组织中MT的表达产生了诱导作用。鲫鱼的4种组织在12h内MT的增加量与镉的浓度表现出一定的剂量.效应关系其中肝脏 MT的诱导量最大，变化规律也最明显。鲫鱼各组织中MT含量的总体变化趋势较为一致，均为先升高后略微下降并趋于稳定，其中鲫鱼鳃丝、肝脏和肾脏 三种组织中MT的含量在12h时达到峰值，随后略有下降并趋于稳定，而肌肉中的MT含量在12h时没有出现峰值，其随着作用时间的延长逐渐到达峰值。试 验水温为26.5±1℃时，在其它试验条件不变的情况下，鲫鱼组织中MT的合成表达表现出相同的规律，但此时鲫鱼组织中MT诱导的峰值比16.5±1℃时鲫 鱼组织中MT的峰值高，二者差异显著(P<0.01)，表明温度的升高可以增强重金属镉对鲫鱼组织中MT的诱导。 3.水温为261℃时，与对照组相比，在 0.1、0.5、1.0和10 mg.L-1浓度下锌的胁迫对鲫鱼4种组织中MT的表达产生了诱导作用，但低剂量锌诱导效果不明显，高剂量的锌可以诱导鲫鱼组织中 MT的大量合成。鲫鱼的4种组织在24h内MT的增加量与锌的浓度表现出一定的剂量.效应关系，其中肾脏MT的诱导量最大，变化规律也最明显。鲫鱼的4种 组织中MT含量的总体变化趋势与重金属镉诱导规律较为一致，均为先升高后略微下降并趋于稳定，但组织中MT含量峰值的出现时间推迟到了染毒后的 24h。试验结果显示锌对鲫鱼组织中MT含量的诱导能力弱于镉的诱导能力。 4.环境中锌的存在可以加强重金属镉对鲫鱼组织中MT的诱导能力。试验 结果表明，暴露在不同镉、锌浓度比的染毒液中，鲫鱼肝脏和肾脏组织中MT含量的总体变化趋势较为一致，均呈先升高后降低然后再升高的趋势，肝脏 中MT在12h时增加速率最大，而肾脏中MT在6h时增加速率最快。鲫鱼组织肝脏和肾脏MT在12h内的增加量、12-48h内MT的减少量和48-96hMT的增加量都与 镉的浓度表现出一定的剂量.效应关系，12h时鲫鱼组织中MT含量达到高峰，表明水体中的镉、锌联合可诱导鲫鱼组织中MT的合成与表达，且主要诱导时 间在12h之内。鲫鱼组织肝脏和肾脏中MT含量均高于单独暴露于镉和锌时组织中MT的含量(P<0.01)。在锌浓度一定的条件下，随着镉浓度的逐渐增加，肝 脏和肾脏组织中MT含量也逐渐升高，呈现出一定剂量-效应关系。 研究结果显示，在一定的试验条件下，鲫鱼鱼体组织中的MT，尤其是肝脏和肾脏 中的MT含量可以作为指示水体中重金属镉、锌过度暴露的生物标志物。 8.期刊论文 秦海宏.沈慧.王福俤.郭俊生 锌对原代培养海马神经元锌转运体1和金属硫蛋白mRNA表达的影响 -第二 军医大学学报2004,25(1) 目的:观察不同浓度锌对锌转运体1(zinc transporter 1, ZnT-1)mRNA和金属硫蛋白(metallothionein, MT)1、2 mRNA表达的影响,旨在探讨神经元 锌内稳态的可能机制.方法:采用锥虫蓝染色法检测不同浓度锌(0、50、100、125、150、175、200 μmol/L)对原代培养海马神经元存活率的影响;用实时 荧光定量RT-PCR法分别检测不同浓度锌(0、50、75、100、125、150 μmol/L)对ZnT-1、MT1、MT2的mRNA表达的影响,检测100 μmol/L锌暴露不同时间点 (0、2、4、6、8 h)对ZnT-1、MT1、MT2 的mRNA表达的影响.结果:培养基锌浓度大于125 μmol/L时,海马神经元存活率明显下降;锌浓度大于75 μmol/L时,ZnT-1 mRNA 表达成线性上升(P<0.05),MT mRNA表达同样明显上升(P<0.05),但在100 μmol/L后进入平台期;在100 μmol/L锌浓度条件下 ,ZnT-1 mRNA表达在2 h内达到峰值,MT mRNA在6 h达到其峰值.结论:虽然神经元可通过增加ZnT-1和MT的表达来应对高锌冲击,但两者的保护作用不同 ,ZnT-1外排作用发生在前且具有持续性,MT的络合作用发生在后且会饱和. 9.期刊论文 曹家银.罗绪刚.S.R.Davis.P.R.Henry.R.J.Cousins.R.D.Miles.C.B.Ammerman 以组织锌、金属硫蛋白 及其基因表达指标评价肉仔鸡对锌源的相对生物学利用率 -畜牧兽医学报2003,34(3) 研究了有机锌源和无机锌源条件下肉仔鸡组织中金属硫蛋白(MT)的基因表达.在肉仔鸡饲粮中以锌蛋白盐或硫酸锌形式添加锌200 mg/kg饲喂6 d或12 d,比较肝、小肠MT和MT mRNA与骨锌作为评价锌源利用率的指标.3种指标均随锌量的增加而增加(P＜0.001).以骨锌为指标,锌蛋白盐的相对生物利用率为 124%.此值在一定范围内类似于以几种组织MT和MT mRNA水平为指标的测定结果,对于肉仔鸡,MT基因的调控可能是评价锌相对生物利用率的敏感指标.这种 方法可减少试验所需的时间和动物数量. 10.期刊论文 李连平.黄志勇.王志聪.刘晓雪.黄丽娥.张冰 小球藻锌结合金属硫蛋白(Zn-MT-like)的抗氧化活性研 究 -中国食品学报2009,9(4) 目的:研究锌胁迫诱导小球藻类金属硫蛋白的抗氧化活性.方法:小球藻经60 μmol/L锌诱导胁迫培养8d,离心收集藻细胞;超声波破碎细胞,离心,上清 液经凝胶层析柱(葡聚糖G-75)及脱盐柱(葡聚糖G-25)分离、纯化,得到锌结合金属蛋白;经光谱特征分析,确认为类金属硫蛋白(Zn-MT-like).对Zn-MT- like的抗氧化活性进行比较研究,包括基于Fenton反应体系的羟自由基(·OH),1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)产生的自由基和邻苯三酚自氧化产生的超氧阴 离子(·O2-)自由基的清除能力.结果:小球藻诱导产生的Zn-MT-like对这3种自由基均有较强的清除作用.其清除羟自由基、DPPH自由基和超氧阴离子自由 基的半数抑制率浓度(IC50)分别为13.12、2.23和48.59 mg/L;其抗羟自由基、DPPH自由基和超氧阴离子自由基的能力高于谷胱苷肽和兔肝锌诱导的金属 硫蛋白(Zn-MTs).结论:小球藻锌结合类金属硫蛋白具有显著的抗氧化活性能力. 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_yingyxb200802027.aspx 下载时间：2010年4月20日