辅助生殖治疗中单卵双胎发生的研究进展

-398- 第 31卷第 6期Vol.31, No.6 2011年 6月 Jun. 2011 生 殖 与 避 孕 Reproduction & Contraception http://www.RandC.cn randc@sippr.stc.sh.cn 辅助生殖治疗中单卵双胎发生的研究进展 曾 明 1,2 吕祁峰 2 李思光 1 (1. 南昌大学生命科学院, 南昌, 330031) (2. 上海交通大学医学院附属第九人民医院, 上海, 200011) 【摘要】 随着不育不孕治疗手段的盛行, 世界各地的多胎妊娠率显著提高。与正常妊娠相比, 经 辅助生殖技术治疗后单卵双胎发生率显著增加。单卵双胎因伴随高风险的并发症而备受关注。然 而, 单卵双胎发生的相关因素及其发生机制仍未明确。本文概述了单卵双胎的概念、类型、并发 症、辅助生殖技术中影响单卵双胎发生的相关因素及发生机制假说，并提出了单卵双胎研究过程 中急需解决的一些问题。 关键词: 单卵双胎; 辅助生殖技术; 胚胎分裂; 囊胚; 内细胞团 中图分类号: R711.6 文献标识码: A 文章编号: 0253-357X(2011)06-0398-05 本课题为国家自然科学基金项目, 项目号: 30871413 通讯作者: 李思光; Tel: +86-13761197703; E-mail: siguangli@163.com 辅助生殖技术(ART)的出现, 给许多不孕不育的 夫妇带来了福音, 然而为了提高妊娠的机会, ART周 期中通常会移植2~3枚胚胎, 导致多胎妊娠发生率明 显提高。与单胎妊娠相比, 多胎妊娠增加了围产期 并发症的风险及健康呵护的开支。另外自然妊娠中 多胎妊娠大多为双卵双胎, 而ART中单卵双胎的发 生几率却大大增加。 1 单卵双胎的概念及并发症 单卵双胎(monozygotic twins, MZT)是指一个卵 子与一个精子受精后形成受精卵, 这个受精卵在某一 早期发育时期分裂成 2个胚胎或胎儿。单卵双胎儿 具有相同的基因、性别、血型、容貌。研究 明[1], MZT发生率高低与种族、年龄、产胎次数和 家族史等无关。根据胚胎分裂时所处的时期, 理论 上可将MZT分为 4种类型: ①胚胎在受精后 4 d内 分裂, 将形成双绒毛囊 -双羊膜囊MZT; ②胚胎在 移植前的囊胚阶段(受精后 4~8 d)分裂, 将形成单 绒毛囊 -双羊膜囊MZT; ③胚胎在移植后(受精后 8~13 d)分裂, 则形成单绒毛囊 - 单羊膜囊MZT; ④在胎盘形成(受精 13~15 d)后胚胎才分裂, 则会 形成联体婴儿 [2 ]。 单卵双胎儿具有较高的死亡率和流产率。据 报道[3], 双胎的流产率是单胎的 7倍, 而MZT的流 产率是双卵双胎的 2倍多。MZT有很大可能会早 产, 并会导致与早产相关的一系列问题。他们具有 生长不一致的风险并伴随先天性的发育缺陷。双 胎输血综合征是单绒毛性MZT(单绒毛膜 -单羊膜 MZT和单绒毛膜 -双羊膜MZT)特有的一种并发症, 其临床表现为供血胎儿贫血、发育迟缓, 而受血胎 儿血容量增加, 动脉压升高, 可发生充血性心力衰竭 和引发羊水过多[4]。30%的单绒毛膜 -双羊膜MZT 患有双胎输血综合征, 其中 15%流产, 即使幸存, 也 会面临神经受损的风险。单绒毛膜 -单羊膜MZT因 脐带互缠而面临更大的潜在风险[5]。 2 ART中影响MZT发生的相关因素 MZT在双胞胎中的比例为30%。一般而言, 自 -399- 发的MZT在人群中出现的概率大约为0.40%~0.45%, 而经过ART处理后, MZT的发生率至少增加2倍, 甚 至增加 7~8倍。虽然人们对这个现象非常感兴趣并 投入了很多精力去研究, 但得到的结论却极富争议 性, 其确切原因至今未明。 2.1 药物促排卵 有研究报道[6]: 与自然妊娠相比, 经克罗米芬 或促性腺激素促排卵治疗后MZT发生率增加了 1.5~ 2.0倍。认为由于促性腺激素促排卵修改了透明带 的结构, 从而导致了MZT的发生。东法兰德斯一项 关于双胞胎的前瞻性研究表明[7]: 由于药物促排卵导 致的MZT概率为 6.4%。 2.2 常规IVF Schachter等针对各种ART引起的MZT妊娠进 行了一项3年的回顾性[8], 结果表明由 IVF引起 的MZT发生率为0.72%, 远高于自发的MZT平均发 生率(0.40%~0.45%)。 Edwards等统计表明[9], IVF 患者的MZT发生率为 1.33%, 他们认为人工胚胎培 养液可能是导致MZT发生的原因之一, 而女性及男 性年龄、促性腺激素用量、E2峰值及黄体激素水 平、卵子收集数量、胚胎移植数量等与MZT的发 生无关。 2.3 透明带操作 在ART中, 有 3项涉及到透明带操作的常用技 术: 卵胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)、辅助孵化(assisted hatching, AH)、 移植前基因诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD), 它们分别可达到提高受精率和改善种植率以 及检测遗传病的效果。 ICSI是指将单个精子直接注射到卵子细胞质 中, 以达到受精的目的。这个技术极大地降低了所 需精子数目及对精子质量的要求(可使用较差的甚至 不运动的精子), 已成为了治疗某些男性因素不育的 常规技术。AH是指使用化学的、机械的或激光的 方法对透明带进行打孔, 从而使得胚胎更易孵化并增 加种植率。PGD一般指在受精后第 3日时用化学 法、机械法或激光法对胚胎透明带打孔, 再吸取 1 或2个卵裂球进行遗传学分析, 从而达到诊断遗传学 疾病的目的。 Ta lansky 等通过小鼠胚胎实验推测[10 ], 在 ICSI、AH或PGD过程中由于人为地对透明带开口, 使得胚胎通过开口疝样孵出, 并引起囊胚的机械切 割, 从而形成MZT。这个体外疝样孵出现象在吕祁 峰等的一项实验性研究中得到证实[11,12], 该项研究在 相对于内细胞团(ICM)的不同位置对人胚胎透明带 进行开孔。结果显示: 小而靠近 ICM的开口引起高 频率的 ICM疝样孵出, 并导致了 3例典型的 ICM分 裂。更有趣的是这 3例分别是 2例囊内分裂和 1例 联体的囊外分裂, 这种罕见现象已通过实验手段以较 高频率诱发出现。许多研究者通过案例报道或对一 定数量的人群进行回顾性研究, 证明ICSI与MZT的 增加有一定的相关性。Schachter等回顾分析了3年 中 1 438个 ICSI周期(经过AH或不经过AH), MZT 的总概率为 0.86%[1]。在另一项案例中[13], 102个行 ICSI周期中有 6例发生MZT妊娠(5.9%), 而在常规 IVF中并未见MZT妊娠。 Alikani等回顾分析了一家 诊所的81例MZT后结果表明[14]: 透明带操作与MZT 妊娠有一定的关系, 行ICSI周期的MZT概率为2.4%, 行人工授精的MZT概率为 1.6%, 但差异无统计学 意义。最近一项研究评价了影响MZT的风险因 素[15], 结果表明ICSI与MZT的发生有显著关系, 而 AH与MZT的发生也有显著关系。Ronit Haimov- Kochman等报道[16], 为鉴定胚胎性别和检测可能的 染色体异位, 对 3例患者进行了 ICSI+PGD, 结果得 到2对单卵双胎和1对单卵三胎, 同时进行ICSI 和PGD这2项透明带操作时, 可能存在叠加效应, 从 而极易形成MZT。 与此相反的是, 有几项研究表明透明带操作与 MZT发生概率的增加没有关系。Schachter等在一 项3年的回顾分析中提到[17]: 在经过各种ART处理 的731例妊娠中, 经过药物诱发排卵或控制性超促 排卵, MZT发生率为 1.5%(2/129), 经常规 IVF的 MZT发生率为0.72%(1/139), 而IVF后又行ICSI并 经过AH或者不经过AH产生的MZT概率为 0.86% (4/463)。因此, 不考虑治疗方式和显微操作, MZT 的发生概率仍显著提高, 引起MZT的原因主要是药 物促排卵的作用, 而不是体外培养诱导以及显微操 作。Sills等研究了 1995.01~1998.03期间的 3 546 例胚胎移植患者[17], 有 1 911例(54%)妊娠, 其中 IVF周期中透明带完整的患者和透明带经过显微操 作后的患者产生MZT的发生率无显著的统计学差 异(P>0.05)。 -400- 2.4 温度波动 已证实在鱼类中, 温度的波动会影响鱼胚的发 育并导致MZT的产生[18], 因此有人提出温度效应可 能会导致与辅助生殖相关的MZT的产生。移植冷 冻 -复苏胚胎对MZT的产生可能存在潜在的影响; 但其他报道却表明[14,19], 移植冷冻 -复苏的胚胎对 MZT产生的概率没有关系, 假如胚胎冷冻会增加 MZT的产生, 其原因可能是透明带的变厚而不是温 度的直接影响。 2.5 囊胚移植 与移植卵裂期的胚胎相比, 移植囊胚被普遍认 为可以提高妊娠率, 但同时也有许多报道认为囊胚移 植会增加MZT的发生率。1999年第 1次报道移植 囊胚、未进行透明带操作而产生MZT, 2名妇女分 别移植了 2枚第 5日囊胚, 1名出现了单绒毛膜 -双 羊膜 M Z T , 而另一名出现了单绒毛膜 - 单羊膜 MZT。Behr于 2000年收集几个 IVF实验室数据[19], 回顾分析了移植未经显微操作的囊胚, 199例妊娠者 中MZT的发生率为 5%, 且都为单绒毛膜 -双羊膜 M Z T。 da Costa等在一项回顾性分析中观察到[21]: 同 样是行 ICSI的胚胎, 1998~1999年间移植的 129个 囊胚, 有 5例MZT(3.9%); 而 1996~1999年间移植的 814个 4~8-细胞期的胚胎, 仅有 6例MZT(0.7%, P<0.01)。在 Milki等的一项大型回顾性妊娠数据分 析中[22], 移植囊胚的MZT发生率为 5.6%, 明显高于 移植卵裂期的胚胎(2.0%, P<0.05)。4年后该研究 小组进行了一项相似的研究[23]: 移植囊胚的经验增加 是否会影响MZT发生率。结果表明: 随着时间的推 移, 囊胚移植对MZT发生率(2.3%)的影响呈减小的 趋势, 移植卵裂期胚胎的MZT发生率为 1.8%, 两者 并无显著性差异。故他们认为由于培养条件的改 善以及囊胚移植经验的积累 , 囊胚移植导致的 MZT数量正在减少。Skiadas 等在研究透明带操作 对MZT的影响时也观察到[15]: 移植第 5日的囊胚显 著地增加MZT的发生。同时, 他们还观察到联合使 用透明带操作和第 5日囊胚移植 2项技术会对单绒 毛膜性MZT的产生起到一个叠加效应, 第 5日囊胚 移植 +ICSI的处理比单独第 5日囊胚移植或单独 ICSI更易产生MZT。Hershlag等报道[24], 移植 559 个胚胎未发生MZT, 而移植674个已孵化的胚胎, 却 产生1例同卵三胞胎和7例同卵双胞胎(1.2%, P<0.01)。 然而最近 Papanikolaou等在一项单胚移植的回 顾性分析中指出[25]: 1 951个行 IVF或者行 ICSI中有 587例妊娠(其中 308例移植单个第 3日胚胎, 271例 移植单个囊胚), 结果卵裂期组2.6%形成MZT, 囊胚 组 1.8%形成MZT, 两者间无统计学差异, 故囊胚移 植不增加MZT的风险。Papanikolaou 等进行了回顾 分析[25], 对 36岁以下妇女随机进行第 3日或第 5日 的胚胎移植时显示: 73例进行第5日的囊胚移植者临 床妊娠率和分娩率显著增加, 但没有发生MZT, 与此 相反, 在 59例进行第 3日胚胎移植中却出现了 2例 MZT(3.4%)。 目前对囊胚移植本质上是否会导致MZT发生 仍具争议性, 但大多数尤其是大型研究报道似乎都表 明囊胚移植会增加MZT的几率。尽管如此, 囊胚移 植显然不是影响MZT的唯一因素。 2.6 不利的胚胎培养条件 在体外培养中, 延长胚胎培养时间会使得透明带 变厚, 或者在低于最优条件下因ICM选择性凋亡而导 致ICM分裂或囊胚腔塌陷, 这些都可能会导致移植囊 胚时产生MZT。有意思的是, 有文献报道[20,26], 经 过共培养的囊胚, 移植后不会产生MZT; 在低于最优 条件下延长胚胎培养对MZT的影响是与培养液有关 的, 改善培养液可以减少 IVF中MZT的发生。 3 关于MZT发生机制的假说 对于 1个受精卵是如何分裂并形成MZT, 许多 学者都提出了自己的假说, 这些假说都具有一定的道 理, 但MZT形成的真实机制仍有待研究。 3.1 细胞排斥假说 本假说认为胚胎在发育过程中存在一些细微但 有特定遗传差异的细胞群, 他们互相排斥并导致分 裂[27]。这个假说有很多缺陷并缺乏根据, 首先大多 数MZT并没有展现出2个有明显差异的细胞系; 而 且这个理论只能解释早期胚胎分裂导致的MZT, 即 形成双绒毛膜MZT, 而不能解释囊胚以后的胚胎是 怎样分裂形成MZT的。再者这个理论不能解释促 排卵和ART治疗只影响部分受精卵产生遗传的差 异性, 例如在同样的促排卵条件下, 有的受精卵分 裂了但有的不分裂, 移植这样的 2枚胚胎将产生三 胞胎。 -401- 3.2 双轴假说 本假说借用禽类发育的一种现象, 认为人类胚 胎可能也存在固有的所谓双轴性, 其中一个占主 导地位, 当异常情况下双轴都起作用时, 胚胎分裂 发生[28]。此假说的主要缺陷是至今未在哺乳动物 中发现双原轴的存在, 只是在禽类胚胎的早期发育 过程中, 胚胎存在一个以上的原轴, 但在胚胎发生的 关键时刻, 胚胎会分泌一种原条抑制因子抑制多个 轴的活性而只保留一个轴有活性。 3.3 囊胚疝样孵出假说 本假说认为: 在胚胎发育过程中, 透明带由于 出现小的开口而失去了部分隔离和保护的功能, 多 潜能细胞通过一个或多个小的开口疝样孵出, 从而 导致了胚胎的切割[27,29,30]。这个假说是基于辅助孵 化等胚胎透明带操作和透明带本身结构异常的现象 与临床MZT现象显著相关的调查而推测的[31]。它 具有一定的合理性, 但也不完善。因为按此假说推 导, 胚胎应分裂成 2个囊胚, 得到的MZT应该为双 绒毛囊-双羊膜囊妊娠, 但这不符合临床调查报道的 ART发生的MZT以单绒毛囊 -双羊膜囊妊娠(即单 个囊胚内的 ICM分裂发育而来)多见。 3.4 细胞凋亡假说 本假说认为囊胚培养所引起的MZT增加是因 为培养条件的不足, 导致ICM在孵化过程中出现了 线形细胞凋亡而导致分裂[32]; 还有假说认为[9], MZT 可能与体外培养低 Ca2+浓度导致的细胞粘连降低 有关。但这些假说都不能解释与体外培养无关的 单纯促排卵 ART也有相对较高的MZT现象。 3.5 MZT倾向卵子假说 本假说认为人类卵巢中本身存在一定比率发生 MZT倾向的异常卵子, 此假说认为ART增加MZT的 发生是因为促排卵增加了这种异常卵子被采集授精 的机会, 而与囊胚培养、辅助孵化等操作无关[33]。 这似乎能解释部分MZT现象的发生, 但并没能阐明 这种卵子有何具体异常, 是如何产生胚胎分裂(特别 是 ICM分裂)过程的, 是如何产生各种类型MZT的。 4 结论与展望 单卵双胎(MZT)在自然妊娠中是一个很罕见的 现象, 而ART的应用极大地增加了MZT的发生率。 与ART相关的MZT发生机制极其复杂而未得到很 好的研究, 其中有几个关键问题亟需解决: 首先, 我 们对自发的MZT机制没有一个基本的了解; 其次自 发的以及ART相关的MZT几率很小, 这就需要分析 庞大的案例数据才能得到统计学上有意义的、令人 信服的结论; 再者如今对MZT的研究仅限于案例的 回顾性分析, 其中夹杂着许多治疗手段和潜在的变 量, 这令分析的结果更加缺乏统计学意义; 另外, 由 于MZT动物模型的缺乏, 至今未有相关的实验性研 究报道。MZT的确诊是通过产前超声波检测膜(绒 毛膜和羊膜)的分布情况、产后检查膜分布、胎儿 长相及基因检测, 其中最后一种方法是最可靠的。 在许多 IVF的案例中, 通常会移植 1枚以上的胚胎, 所以只有单绒毛膜的MZT才能被检测到, 而忽略了 双绒毛膜-双羊膜MZT; 另外, 由于在产后评定MZT 时, 通常都不会把消失的胎儿或完全流产的胎儿计算 在内。据报道[34], 这些消失或流产的胎儿在 IVF或 ICSI中分别有 12.1%和 5.0%概率是双胞胎。所以, MZT的真实概率可能要大于所报道的, 目前进行单 胚胎移植可能会消除这个误差。 在辅助生殖治疗中, 4种类型的MZT都能观察 到, 所以MZT可以在胚胎发育的各个时期形成, 且 其形成机制可能也各不相同。综上所述, 有很多因 素都会影响到与ART相关的MZT的产生, 但某些因 素似乎作用更大。大型研究表明, 促排卵、透明带 操作、长期体外培养以及囊胚移植对MZT的产生 有很大影响, 但仍需更全面、更详细地研究这些潜 在的影响因素究竟对MZT的产生起到什么样的作 用, 只有这样我们才能更好地理解辅助生殖中的 MZT现象, 并减少其发生几率以及避免母、婴并发 症的产生。 参考文献: [1] Schachter M, Raziel A, Friedler S, et al. 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