�简报�
流行性感冒病毒鸡胚高产株的遗传特性
董婕, 张立国,陈爱君,吴昆昱, 孙梅生,张智清
(中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所, 北京 100052)
关键词:流行性感冒病毒; 高产毒株;基因突变
中图分类号: R373� 1+ 3; Q78� � 文献标识码: A � � 文章编号: 1000- 8721( 2002) 04- 0367- 04
收稿日期: 2001- 11- 21;修回日期: 2002- 01- 16
基金项目:科研院所技术开发研究专项基金( NCST E- 2000-
JKZX- 231 ) ; 973! 计 划 传染 病 防 治基 础 研究 ( 973 -
G19999054108)。
作者简介:董婕( 1972- ) ,女,吉林人,主要从事流感病毒的研究。
� � 流行性感冒(流感)病毒的基因组由分节段的单
股负链 RNA组成,其中 A、B型流感病毒含 8 个基
因节段[ 1]。它的第 4和第6节段分别编码病毒的血
凝素(HA)和神经氨酸酶( NA) ,决定病毒的抗原性,
其它 6个节段与病毒的生长特性有关[ 2]。在流感疫
苗生产中,为了提高产量,利用高产毒株与流行毒株
基因重配获得重组病毒, 它含有流行毒株的第 4、第
6节段和高产毒株的其它 6个节段,这样既具有流
行毒株的抗原性又具有高产特性,可以用来降低疫
苗的生产成本。A/ PR/ 8/ 34( H 1N1 )是目前常用于
重配的高产株之一,它经实验室长期适应已获得在
鸡胚传代稳定高产的生物学特征。本文中测定了
A/ PR/ 8/ 34(H 1N1)高产株内部基因的序列, 并与其
原始序列进行比较, 探讨了病毒高产的分子机制。
首先将我室保存的 A/ PR/ 8/ 34( H1N1)高产株 10- 3
接种 10日龄鸡胚后, 33 ∀ 孵育 48h 收获病毒尿囊
液。经血凝实验测定病毒血凝滴度为 1: 640。用
Q IAGEN 公司 Rneasy Mini Kit 提取病毒基因组
RNA。针对流感病毒的末端保守区设计通用引物,
序列为 5#- agc gaa agc agg - 3#,用于反转录。采用
GIBCO BRL 公司的 THERMOSCRIPT TM RT -
PCR System 反转录获得病毒 cDNA。为了保证基
因扩增过程中的保真性, PCR扩增采用 STRATA�
GENE 公司的 Pfx DNA Polymerase。不同节段基因
扩增采用各自的特异引物。纯化 PCR产物,克隆流
感病毒基因到 pGEM- 3zf 载体送测序。为了确凿
证实病毒基因组的点突变是高产毒株特有的, 而不
是 PCR过程中发生的变异,每个基因节段至少测定
3个克隆, 并且各克隆序列符合率∃99%。从而确
定高产毒株的基因序列。利用 DNASTAR 软件完
成蛋白质的
, 与病毒原始序列比较采用 DNA�
SIS( Version 2�5)软件进行。
通过 RT - PCR 扩增得到 A/ PR/ 8/ 34 毒株基
因组的 8个片段, 经电泳证明与预计的分子量一致
(图 1) ,将其克隆到 pGEM- 3zf载体中进行测序。
图 1 � RT- PCR扩增流感病毒 A/ PR/ 8/ 34 基因组 8 个
节段
F igur e 1 � RT - PCR amplification of 8 segments of in�
fluenza v irus A / PR/ 8/ 34 genome
M�Marker; 1�PB2; 2�PB1; 3�PA; 4�HA; 5�NP; 6�NA; 7�M; 8�NS�
� � 鸡胚高产株与 GenBank 中原始的 A/ PR/ 8/ 34
( H1N1)序列比较 ( PB2: J02153, PB1: J02151, PA:
J02152, NP: J02147, M : J02145, NS: J02150) , 结果
如表 1。(阴影部分是核苷酸突变可以引起氨基酸
变异的错义突变。)在三种复制酶基因中, PB2节段
共有 21个点突变, 6个氨基酸变异; PB1节段中 18
个碱基变异, 9个氨基酸突变; PA 中有 12个碱基变
异,但未导致任何氨基酸突变; NP 为病毒的核蛋
白,有 20个位点变异, 导致 6个氨基酸突变;第 7个
节段编码两种蛋白, 共有 12 个碱基变异, 其中 M1
蛋白有 1个氨基酸突变, M2中有 3个;最小的节段
NS也编码两种蛋白, 共 10 个碱基改变, 导致 NS1
第 18卷 � 第 4期
2 0 0 2 年 1 2 月 � � � � � � � � � � � �
病 � � 毒 � � 学 � � 报
CHINESE JOURNAL OF VIROLOGY
� � � � � � � � � � � � Vol. 18 � � No. 4� Dec. � � 2 0 0 2
中 2个氨基酸突变, NS2中氨基酸未发生变异。
表 1� 高产毒株 6 个内部基因节段核苷酸点突变及其相应的氨基酸的变化
Table 1� Po int mutations in 6 internal gene segments of t he high- yielding strain and their encoding amino acid substitut ions
�368� 病 � � 毒 � � 学 � � 报 � � � � � � � � � � � � � � � � � 18 卷 �
� � 各基因节段变异率比较见表 2。编码病毒复制
酶的 3个节段的突变率低于其它 3个节段,其中 PA
基因突变率最低,仅为 5�4% ; M、NS基因的突变率
接近,而 NP 突变率最高,达到 12�8%。
表 2 � 高产毒株 6 个内部基因节段突变率
T able 2 � Difference of mutational frequency among 6 internal
g ene segments of high- yielding strain
Gene Length( nt ) Mutation( nt)
Mutat ional f requency
& 10- 3
PB2 2, 341 21 9�0
PB1 2, 341 18 7�7
PA 2, 233 12 5�4
NP 1, 565 20 12�8
M 1, 027 12 11�7
NS 890 10 11�2
Total 10, 397 93 8�9
� � 病毒蛋白的相对突变率比较见表 3。在 3个多
聚酶蛋白中, PB2与总的平均突变率相同, PB1远高
于平均突变率, PA 没有氨基酸的变异; M 2 蛋白的
突变率最高, 97个氨基酸有 3 个改变, 其突变率达
到 3%。另外, NS2蛋白也未发生氨基酸改变。
表 3� A/ PR/ 8/ 34( H1N1) 鸡胚高产毒株 6 个内部基因节段
编码的 8 个蛋白突变率
T able 3 � Difference of mutational frequency among 8 proteins
of high- y ielding str ain
Protein
Length
( aa)
aa change
( aa)
Mutat ional f requency
& 10- 3
PB2 759 6 7�9
PB1 757 9 11�9
PA 716 0 0�0
NP 498 6 12�0
M1 252 1 4�0
M2 97 3 30�9
NS1 230 2 8�7
NS2 121 0 0�0
Total 3, 430 27 7�9
� � 在流感病毒复制酶 3个亚基中, PB2蛋白能够
识别和切割宿主细胞 mRNA 5#端帽结构, 作为病毒
mRNA 复制的引物。PB1 蛋白在转录过程中有起
始和延伸的作用[ 3, 4]。PA具有蛋白酶的功能[ 5] , 在
病毒的基因组 RNA 合成中发挥作用,但其作用机
理还不太清楚。本研究表明, 高产毒株的 PA 在聚
合酶的 3个亚基中突变率最低, 这可能与其在转录
中所发挥的作用有关。NP 蛋白主要负责维持核蛋
白复合物的稳定,并在病毒 mRNA合成和延伸过程
中起抗终止作用[ 6]。在高产毒株中, NP 蛋白突变
率较高的原因可能与该毒株适应鸡胚生长获得高产
性状有关。M2 是膜蛋白, 具有离子通道活性[ 7] ,在
高产毒株中突变率最高,其机制还不太清楚。
X- 31( H3N2)是另外一株被用于灭活疫苗生产
的高产毒株, 其 6 个内部基因节段也是来源于 A/
PR/8/ 34 ( H1N1 )
[ 8]。K H Lee 等在研究 X - 31
( H3N2)的高产性能时也发现, M 2蛋白的突变率最
高, PA在 3个聚合酶基因中相对的突变率最低。这
与我们的研究结果相同。但是他们的结果中 NP 蛋
白没有任何的氨基酸变异, 这与我们的结果不同。
这可能是由于两个实验室保存的毒种经宿主传代的
不同,更说明病毒株的高产性状是多基因联合作用
的结果, 不能简单地定义为某个基因或某个位点的
变异所形成。总之, 病毒株高产性状是经鸡胚连续
传代的结果,是 6个内部基因节段点突变积累所成。
近两年来,流感病毒基因操作技术取得了突破
性的进展。Hoffmann E 等人成功构建了含有流感
病毒基因组 8个节段的重组质粒系统, 利用这套质
粒系统转染真核细胞可以获得具有复制能力的病
毒[ 9]。上述技术的开发成功, 使得在 DNA 的水平
上对流感病毒的基因组进行任意改造成为可能, 从
而获得需要的突变毒株。这必将对流感病毒的研究
起到巨大的推动作用, 例如阐明各基因节段的功能,
细胞与病毒的相互作用机理,包括揭示高产毒株高
产特性的分子机制。
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Identification of Mutations in a High- yielding Strain of Influenza Virus
DONG Jie, ZHANG Li- guo, CHEN Ai- jun, WU Kun- yu, SUN M ei- sheng , ZHANG Zhi- qing
( National Insti tute f or Vi ral Di sease Cont rol and Prev ent ion, China CDC , Beij ing 100052, China )
Abstract: Inf luenza virus st rain A/ PR/ 8/ 34( H1N1) acquired a high - yielding property after serial passages in
fert ilized eggs�Six internal RNA segments of the high- yielding strain were sequenced from their cloned cDNAs
and compared w ith the corresponding original sequences in the prime A/ PR/ 8/ 34( H1N1) st rain�Ninety- three
point mutat ions w ere found accumulated in six genes( PB2, PB1, PA, NP, M, and NS) , w hich lead to 27 amino
acid changes�A significant low mutat ion frequency w ithout amino acid change was observed in PA gene�The mu�
tat ion frequency at the am ino acid level w as the highest ( about 3%) in M2 protein�Our data suggest that the un�
equal distribution of mutations among different viral proteins may correlate w ith individual role of each protein in
v iral grow th�
Key words: influenza virus; high- yielding st rain; gene mutation
�370� 病 � � 毒 � � 学 � � 报 � � � � � � � � � � � � � � � � � 18 卷 �